ADSORCION DE ACIDOS NUCLEICOS A UNA FASE SOLIDA
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un método para adsorber, es decir enlazar no covalentemente, un ácido nucleico a una fase sólida. Adicionalmente, la presente invención pertenece a un método para aislar un ácido nucleico a partir de una muestra biológica. Muchas substancias biológicas, especialmente los ácidos nucleicos, presentan retos especiales en términos de aislarlos a partir de su ambiente natural. Por otra parte, están con frecuencia presentes en concentraciones muy pequeñas y, por otra parte, se encuentran con frecuencia en la presencia de muchas otras substancias sólidas y disueltas, por ejemplo después de la lisis de las células. Esto los hace difíciles de aislar o medir, en particular en ensayos bioespecificos los cuales permiten la detección de ácidos nucleicos específicos, o la detección de propiedades específicas de un ácido nucleico. Tales ensayos bioespecificos juegan un papel principal en el campo de diagnósticos y bioanalíticos en investigación y desarrollo. Ejemplos para ensayos bioespecificos son ensayos de hibridización, ensayos inmune y ensayos receptor ligando. Los ensayos de hibridización usan el emparejamiento de bases específicas para la detección molcular de analitos de ácidos nucleicos por ejemplo ARN y ADN. Por lo REF: 161833 tanto, las sondas de oligonucleótidos con una longitud de 18 a 20 nucleótidos puede permitir el reconocimiento específico de una secuencia complementaria seleccionada por ejemplo en el genoma humano. Otro ensayo el cual implica el enlace selectivo de dos cebadores de oligonucleótido es la reacción de cadena polimerasa (PC por sus siglas en inglés) descrita en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,683,195. Este método permite la amplificación selectiva de una región de ácido nucleico específica a niveles detectables por una polimerasa termoestable en la presencia de trifosfatos desoxinucleótidos en varios ciclos . Como se describe anteriormente, antes de que los ácidos nucleicos puedan ser analizados en uno de los ensayos mencionados anteriormente o usados para otros procesos, tienen que ser aislados o purificados a partir de muestras biológicas que contienen mezclas complejas de diferentes componentes como por ej emplo componentes proteináceos y no proteináceos . Con frecuencia, para las primeras etapas, los procesos que son usados son los cuales permiten el enriquecimiento del componente de interés, es decir, los ácidos nucleicos. Frecuentemente, estos están contenidos en una célula bacteriana, una célula fúngica, una partícula viral o la célula de un organismo más complejo, tal como una célula de sangre humana o una célula vegetal . Los ácidos nucleicos como un componente de interés pueden también ser llamados un "componente objetivo". Para liberar los contenidos de las células o partículas, pueden ser tratadas con enzimas o con químicos para disolver, degradar o desnaturalizar las paredes celulares y membranas de tales organismos. Este proceso es comúnmente referido como lisis. La solución resultante la cual contiene tal material lisado es referido como lisado. Un problema con frecuencia encontrado durante la lisis es que otras enzimas que degradan el componente objetivo, por ejemplo desoxirribonucleasa o ribonucleasas que degradan ácidos nucleicos, llegan a estar en contacto con el componente objetivo durante la lisis. Estas enzimas degradantes pueden también estar presentes fuera de las células o pueden haber sido separadas espacialmente en compartimientos celulares diferentes antes de la lisis y llegan a estar en contacto con el componente objetivo. Otros componentes liberados durante este proceso pueden ser por ejemplo endotoxinas que pertenecen a la familia de lipopolisacáridos los cuales son tóxicos para las células y pueden provocar problemas para productos propuestos para ser usados en terapia humana o animal . En las siguientes etapas de la preparación de muestras que siguen a la etapa de lisis, los ácidos nucleicos son además enriquecidos . Los ácidos nucleicos son extraídos normalmente a partir de las mezlas de lisis complejas antes de que sean usados en un ensayo a base de sonda. Hay varios métodos para la extracción de ácidos nucleicos . Métodos dependientes a secuencia o bioespecíficos incluyen, por ejemplo, cromatografía de afinidad o ibridización a sondas inmovilizadas. Los métodos independientes a secuencia o fisico-guímicos incluyen, por ejemplo, extracción líquido-líquido con fenol-cloroformo, precipitación con etanol puro o isopropanol, extracción con papel de filtro, extracción con agentes formadores de micela como bromuro de cetilo-trimetil-amonio, enlazando a tintes inmovilizados, intercalantes tales como derivados de acridina, adsorción a substratos tales como gel de sílice o tierras diatómicas, adsorción a partículas de vidrio atraibles magnéticamente (MGP por sus siglas en inglés) o partículas de organosilano bajo condiciones caotrópicas . Se prefiere el enlace directo de los ácidos nucleicos a un substrato tal como un material con una superficie de sílice porque entre otras razones los ácidos nucleicos no tienen que ser modificados e incluso pueden ser enlazados ácidos nucleicos nativos . Particularmente interesantes para propósitos de extracción es la adsorción de ácidos nucleicos a superficie de vidrio aunque son posibles otras superficies . Los ácidos nucleicos los cuales son fijados libres, por ejemplo por la forma de lisis celular y/o lisis de organelos celulares tales como mitocondria, plástidos, núcleos u otros organelos que contienen ácidos nucleicos, pueden ser purificados por la forma de enlace a una fase sólida tal como substrato mineral, lavar el substrato mineral con los ácidos nucleicos enlazados y liberando los ácidos nucleicos a partir del substrato mineral . La adsorpción de ácidos nucleicos a partículas de vidrio o partículas de sílice en la presencia de sales caotrópicas es conocida en la técnica (Vogelstein, B . , and Gillespie, D., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 76 (1979) 615-619) y proporcionar la base para purificación cromatográfica y procesos de separación para ácidos nucleicos. También son conocidos en la técnica métodos para aislar y purificar ARN y ADN a partir de lisados usando concentraciones altas de sales caotrópicas, por ejemplo yoduro de sodio, perclorato de sodio y tiocianato de guanidina (Boom, R. , et al., J. Clin. Microbiol . 28 (1990) 495-503; Yamada, O., et al., J. Virol . Methods 27 (1990) 203-209) . La purificación de ADN de plásmido a partir de bacterias en polvo de vidrio en la presencia de perclorato de sodio es descrito en Marko, .A. , et al., Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387. En DE 37 24 442, se describe el aislamiento de ADN de fago M13 de cadena sencilla en filtros de fibra de vidrio por precipitar partículas de fago usando ácido acético y lisis de las partículas de fago con perclorato. Los ácidos nucleicos enlazados a los filtros de fibra de vidrio son lavados y después eluidos con un amortiguador de Tris/EDTA que contiene metanol . Un procedimiento similar para purificar ADN a partir de fagos lambda es decrito en Jakobi, R. , et al., Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201. El procedimiento implica el enlace selectivo de ácidos nucleicos a superficies de vidrio en soluciones de sal caotrópica y separar los ácidos nucleicos a partir de contaminantes tales como agarosa, proteíns o residuo celular. Para separar las partículas de vidrio a partir de los contaminantes, las partículas pueden ser ya sea centrifugadas o son extraídos fluidos a través de filtros de fibra de vidrio. Esta es una etapa limitante, sin embargo, que evita que el procedimiento sea usado para procesar grandes cantidades de muestras . El uso de partículas magnéticas para inmovilizar ácidos nucleicos después de la precipitación por agregar sal y etanol es más ventajoso y descrito por ejemplo en Alderton, R.P., et al., Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 y solicitud WO 91/00212. En este procedimiento, los ácidos nucleicos son aglutinados junto con las partículas magnéticas. El aglutinado es separado del solvente original por aplicar un campo magnético y realizar una etapa de lavado. Después de una etapa de lavado, los ácidos nucleicos son disueltos en un amortiguador Tris. Este procedimiento tiene una desventaja, sin embargo, en que la precipitación no es selectiva para ácidos nucleicos. Más aún, una variedad de substancias sólidas y disueltas son aglutinadas también. Como un resultado, este procedimiento no puede ser usado para remover cantidades significtivas de cualesquiera inhibidores de reacciones enzimáticas especificas que pueden estar presentes . El vidrio magnético, poroso es también disponible en el mercado que contiene partículas magnéticas en una matriz de vidrio poroso, particular y se cubre con una capa que contiene estreptavidina . Este producto puede ser usado para aislar materiales biológicos, por ejemplo proteínas o ácidos nucleicos, si son modificados en una etapa de preparación de complejos de tal forma que se enlazan covalentemente a biotina. Los adsorbentes particulares magnetizables pruebana ser muy eficientes y adecuados para preparación de muestras automáticas. Pigmentos ferrimagnéticos y ferromagnéticos así como también superparamagnéticos son usados para este propósito. Los MGP más preferidos son aquellos descritos en la solicitud WO 01/37291. La purificación de un ácido nucleico por la forma de adsorber el mismo a un substrato tal como un substrato mineral en la presencia de alta concentración de sales es también aplicada a otras mezclas complejas. Ejemplos son conocidos por lo tanto para una persona experta en la técnica de biología molecular e incluyen las mezclas de reacción que siguen, por ejemplo, la síntesis in vitro de ácidos nucleicos tales como PCR, digestiones de enzima de restricción, reacciones de ligamiento, etc. En Vogelstein, B., y Gillespie, D., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 76 (1979) 615-619, por ejemplo, se propone un procedimiento para enlazar ácidos nucleicos a partir de geles de agarosa en la presencia de yoduro de sodio para triturar vidrio de chispa. Otra aplicación para purificación de un ácido nucleico por la forma de adsorber el mismo a un substrato tal como un substrato mineral en la presencia de una alta concentración de sales es la remoción de contaminantes pirogénicos los cuales pueden haber copurificado con el ácido nucleico. El mecanismo por el cual se enlazan los ácidos nucleicos al soporte mineral en la presencia de agentes caotrópicos no es enteramente claro. Se hipotetiza que la interacción entre los ácidos nucleicos y el solvente está influido de tal forma que los ácidos nucleicos se adsorben al soporte mineral y desnaturalizan. En la presencia de concentraciones altas de agentes caotrópicos la reacción es casi cuantitativa. Los ácidos nucleicos adsorbidos pueden ser eluidos por aplicar los amortiguadores de soporte mineral de baj concentración iónica . La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,808,041 describe métodos para aislar ácidos nucleicos con longitudes mayores que aproximadamente 50 bases a partir de ciertas muestras biológicas. Un lasado acuoso el cual contiene iones caotrópicos en una concentración arriba de aproximadamente 2M es producido y los ácidos nucleicos son adsorbidos a partir del lisado a material de sílice (también referido como "enlace") . Una suspensión o resina la cual comprende material de sílice y sales caotrópicas se agrega al material biológico de esta forma resultando en un procedimiento de lisis y enlace de una etapa. Los métodos para lisar una muestra biológica descritos en el documento incluyen lisis de bacterias usando hidróxido alcalino y SDS, lisis de M13 o fagos lambda por incubar los fagos en la presencia de guanidinio 2.8 M, y lisis de tejido fresco o congelado por incubar el tejido en la presencia de guanidinio 2.8 M. Adicionalmente, se usa N-lauril-sarcosina para ayudar a la lisis . La Patente Europea 0 389 063 y EP 0 819 696 describen el método para purificar un ácido nucleico por la forma de mezclar en un material de fase líquida que contiene el ácido nucleico con una substancia caotrópica y un ácido nucleico de enlace a una fase sólida. De esta forma, los procedimientos descritos en los documentos también representan procedimientos de lisis y enlace de una etapa. Después de la lisis y enlace, la fase sólida con ácido nucleico enlazado es separada de la fase líquida. Después de una etapa de lavado se eluye el ácido nucleico a partir de la fase sólida. Los documentos describen un amortiguador de lisis el cual contiene tiocianato de guanidinio de aproximadamente 10 M, aproximadamente Triton-X100 al 2%, sal de Tris 0.1 M, y aproximadamente EDTA 50 µ?. Otro amortiguador de lisis además contiene 40% en peso por volumen de sulfato de dextrano. Otro amortiguador de lisis contiene aproximadamente tiocianato de guanidinio 10 M y aproximadamente EDTA 50 uM. Otros amortiguadores de lisis son discutidos en los documentos que contienen como una substancia caotrópica yoduro de potasio o yoduro de sodio en una concentración de aproximadamente 3M, o yoduro de potasio o sodio en combinación con urea 1 M ó 8 M. - Se efectúa la lisis de una muestra biológica por la forma de incubar la muestra con un amortiguador de lisis, donde 50 partes en volumen de la muestra biológica son mezcladas con 900 partes por volumen de un amortiguador de lisis y 40 partes en volumen de una sílice gruesa. Como una alternativa para usar sílice gruesa, otros procedimientos son descritos en donde se usa el material de filtro de sílice. La Patente Europea EP 0 658 164 describe métodos para la purificación cromatográfica de ácidos nucleicos por la forma de purificación cromatográfica . Particularmente, un procedimiento de dos etapas el cual comprende una primera etapa de lisis y una segunda etapa de enlace se describe. En la primera etapa (lisis) , se mezcla la muestra biológica con un agente caotrópico donde la concentración del agente caotrópico en la mezcla está entre aproximadamente 2 M y aproximadamente 4 M. Opcionalmente, la mezcla adicionalmente contiene fenol, cloroformo o éter. Opcionalmente, la mezcla adicionalmente contiene un detergente. Se agrega una proteasa ? se incuba la mezcla. En la segunda etapa (enlace) , se agrega un alcohol y la mezcla resultante se pone en contacto con la fase sólida que enlaza al ácido nucleico. Los métodos del estado de la técnica tienen ciertas desventajas. Por lo tanto, es el objeto de la presente invención proporcionar un método alternativo para preparar una muestra biológica que contiene un ácido nucleico y adsorber a partir de la preparación de ácido nucleico a una fase sólida. Es otro objeto de la invención solucionar la necesidad para alcohol durante la etapa de adsorpción ya que el alcohol es una substancia flamable y por lo tanto es deseable restringir su uso. En el presente documento se entiende que el término un "ácido nucleico" denota por lo menos un ácido nucleico. Adicionalmente , el término "un ácido nucleico" también puede indicar una mezcla de ácidos nucleicos. Los términos "fase sólida" y "substrato" denota una substancia la cual es substancialmente insoluble en una solución acuosa y en la cual un ácido nucleico en una solución acuosa de alta concentración iónica se puede adsorber cuando se agrega la substancia. Ejemplos por lo tanto son partículas minerales porosas o no porosas tales como sílice, vidrio, cuarzo, zeolitas o mezclas de los mismos. También, el término "substrato" comprende partículas atraibles magnéticamente recubiertas con sílice, vidrio, cuarzo o zeolitas. Además, se entiende que un substrato en la forma de "polvo" o material en "polvo" se refiere a material dividido finamente el cual, cuando se dispersa en una fase líquida tal como un compuesto orgánico liquido o una solución acuosa, produce una suspensión. El término "polvo" o material en "polvo" se propone para incluir tabletas, en las cuales el material en polvo ha sido agregado, pero todavía produce una suspensión cuando se combina con una fase líquida tal como una solución acuosa. Además, se entiende que los términos "concentración iónica alta" y "concentración alta" significa la resistencia iónica o concentración en una solución acuosa que resulta de sales disueltas en concentraciones iguales a o mayores que aproximadamente 1 M. Son preferidas sales caotrópicas de 1 a 10 M. Los inventores encontraron sorpresivamente que realizar un procedimiento de lisis y de enlace de dos etapas es ventajoso, donde en la primera etapa se efectúa la lisis por mezclar la muestra biológica con un amortiguador de lisis acuoso el cual contiene un agente caotrópico e incubar la mezcla; en la segunda etapa, se incrementa la concentración del agente caotrópico en la mezcla y se pone en contacto la mezcla con una fase sólida capz de enlazar los ácidos nucleicos, donde el ácido nucleico en la fase líquida es adsorbida a la fase sólida. Una primera modalidad de la invención es por lo tanto un método para adsorber un ácido nucleico a partir de una muestra biológica a una fase sólida, que comprende las etapas de (a) proporcionar un amortiguador de lisis acuoso que contiene un agente caotropico ; (b) mezclar el amortiguador de lisis con la muestra biológica, donde la concentración del agente caotropico en la mezcla está entre 1 M y 4 M, e incubar la mezcla; (c) disolver una cantidad adicional de agente caotropico en o agregar una solución acuosa la cual contiene un agente caotropico adicional a la mezcla de la etapa (b) , por lo que se incrementa la concentración del agente caotropico en la mezcla por más de 0.5 M; (d) poner en contacto la mezcla de la etapa (c) con la fase sólida, por lo que se adsorbe el ácido nucleico a partir de la mezcla a la fase sólida. Una segunda modalidad de la invención es un método para aislar un ácido nucleico a partir de una muestra biológica, el cual comprende las etapas de (a) proporcionar un amortiguador de lisis acuoso que contiene un agente caotropico; (b) mezclar el amortiguador de lisis con la muestra biológica, donde la concentración del agente caotropico en la mezcla está entre 1 y 4 M, e incubar la mezcla; (c) disolver una cantidad adicional de agente caotropico en o agregar una solución acuosa la cual contiene agente caotropico adicional a la mezcla de la etapa (b) , por lo que se incrementa la concentración del agente caotropico en la mezcla por más de 0.5; (d) proporcionar una fase sólida y poner en contacto la mezcla de la etapa (c) con la fase sólida, por lo que se adsorbe el ácido nucleico a partir de la mezcla a la fase sólida; (e) separar la fase sólida a partir de la fase líquida; (f) opcionalmente lavar la fase sólida de la etapa a partir de una fase líquida; (g) eluir el ácido nucleico a partir de la fase sólida por lo que se aisla el ácido nucleico; (h) opcionalmente precipitar el ácido nucleico de la etapa (g) a partir del eluato y aislar el ácido nucleico precipitado . Muchos procedimientos para aislar los ácidos nucleicos a partir de su ambiente natural han sido propuestos en años recientes por el uso de su comportamiento de enlace a substratos tales como superficies de vidrio. Es común usar agentes caotrópicos tales como, por ejemplo tiocianato de guanidina bajo condiciones altas en sales. Una concentración alta de un agente caotrópico cambia las propiedades de volumen de agua (Cacace, M.G., et al., Quarterly Review of Biophysics (1997) 30-241-277) . Ciertos iones en agua tenderán a incrementar las interaciones hidrofóbicas , mientras que otros iones disminuirán las interacciones hidrof bicas . Los iones los cuales tienen tendencia al efecto que se describe son llamados serie Hofmeister. La serie es como sigue: Cationes : H4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+ > guanidinio Aniones : P043+ > S042" > HP042~> acetato > citrato > tartrato > Cl" > Br" > N03" > CIO3" > CIO4" > I" > SCN". Los iones a la izquierda son para ser "cosmotrópicos" e incrementan la resistencia de las interacciones hidrofóbicas y de esta forma precipitarán o "salaran" proteínas en altas concentraciones . Los iones a la derecha son "caotrópicos" y tienden a debilitar las interacciones hidrofóbicas . La serie Hofmeister explica porqué el guanidinio es una proteína desnaturalizante. Adelgaza las interacciones provocando que las proteínas se desnaturalicen. En contraste, (NH4 ) 2S04 se disociará en iones NH4+ y S042~ . Ambos de estos iones son cosmotrópicos , y el efecto de cada uno es independiente y aditivo. Esto hace a (NH4 ) 2S04 un precipitado versátil el cual es usado ampliamente en procedimientos de purificación de proteína. NaCl está en el medio de la serie, esto es ni es cosmotropico ni caotrópico. Se descubrió por los inventores que para preparar una muestra biológica la cual contiene un ácido nucleico y adsorber a partir de la preparación el ácido nucleico a una fase sólida ventajosamente se aplica un método de lisis y enlace de dos etapas. En la primera etapa (lisis) la concentración del agente caotrópico es inferior que en la segunda etapa (enlace) . Durante la etapa de lisis, es decir en la mezcla de la muestra biológica y el amortiguador de lisis la concentración preferida del agente caotrópico está entre 1 M y 4 M. Una primera modalidad preferida de la invención es por lo tanto un método para adsorber un ácido nucleico a partir de una muestra biológica a una fase sólida, la cual comprende las etapas de (a) proporcionar un amortiguador de lisis acuoso que contiene un agente caotrópico; (b) mezclar el amortiguador de lisis con la muestra biológica, donde la concentración del agente caotrópico en la mezcla está entre 1 M y 4 M, e incubar la mezcla (c) disolver una cantidad adicional de agente caotrópico en o agregar una solución acuosa la cual contiene un agente caotrópico a la mezcla de la etapa (b) , por lo que se incrementa la concentración del agente caotrópico en la mezcla por más de 0.5 M; (d) poner en contacto la mezcla de la etapa (c) con la fase sólida, por lo que se adsorbe el ácido nucleico a partir de la mezcla a la fase sólida. Se prefiere que el agente caotrópico sea una sal caotrópica. Es más preferido que el agente caotrópico sea seleccionado del grupo que consiste de clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, un yoduro alcalino, y un perclorato alcalino. Preferentemente, el yoduro alcalino es KI o Nal. Preferentemente, el perclorato alcalino es NaCl0 o Kcl04. Mezclas de estos compuestos así como también mezclas de estos compuestos con urea son también posibles. Dependiendo del agente caotrópico usado, la concentración óptima del mismo en la mezcla de la etapa (b) puede variar. Por ejemplo, para obtener un efecto caotrópico comparable usando clorhidrato de guanidinio o tiocianato de guanidinio deben ser seleccionadas diferentes concentraciones en el intervalo indicado de entre 1 M y 4 M. El principio que subyace esta diferencia es que la sal de tiocianato de guanidinio cuando se disuelve en agua se disocia para resultar en dos iones caotrópicos, mientras que el clorhidrato de guanidinio disociado resulta en solamente un ion caotrópico. Es por lo tanto preferido que en la mezcla de la etapa (b) la concentración del agente caotrópico esté entre 1 M y 2 M. Es más preferido que en la mezcla de la etapa (b) la concentración del agente caotrópico esté entre 1.5 y 2 M. Es incluso más preferido que en las mezclas de la etapa (b) la concentración del agente caotrópico sea aproximadamente 2 M. Dependiendo del agente caotrópico usado es también preferido que en la mezcla de la etapa (b) la concentración del agente caotrópico esté entre 2 M y 4 M. Es más preferido que en la mezcla de la etapa (b) la concentración del agente caotrópico esté entre 2.5 M y 3 . Es incluso más preferido que en la mezcla de la etapa (b) la concentración del agente caotrópico sea aproximadamente 3 M. En este aspecto es el entendimiento general del técnico experto que la palabra "aproximadamente" en combinación con un valor cuantificado numéricamente signifique que este valor puede ser sujeto a variación, donde el efecto técnico deseado el cual se describe o define por el valor permanezca sin cambiar. Generalmente, "aproximadamente", se entiende para implicar una variación de 5%. Por ejemplo, un valor de aproximadamente 100 comprende los valores entre 95 y 105. Se clasifican los iones de guanidinio y tiocianato en la serie Hofmeister como que tienen propiedades caotrópicas mejoradas sobre, por ejemplo cationes de potasio o sodio, o aniones de yoduro o clorato, respectivamente. Es de esta forma también preferido que en la mezcla de la etapa (b) la concentración del agente caotrópico esté entre 2 M y 4 M. En la segunda etapa (enlace) la concentración del agente caotrópico en la mezcla se incrementa por agregar el agente caotrópico adicional a la mezcla de la etapa (b) . Como se indica por la etapa (c) estas son varias formas para lograr el incremento deseado. Es posible agregar el agente caotrópico como una materia sólida a la mezcla de la etapa (b) y disolver el agente caotrópico. Alternativamente, una solución acuosa del agente caotrópico se prepara y agrega a la mezcla de la etapa (b) . Preferentemente, la solución acuosa contiene además ingredientes tales como una sal de amortiguador, un detergente o ambos. Un ejemplo para tal solución acuosa es el amortiguador de enlace descrito en los Ejemplos 2, 3 y 4.
La concentración del agente caotropico en la mezcla de la etapa (c) se incrementa por más de 0.5 M. Es preferido, por lo tanto, que la etapa (c) comprenda disolver una cantidad adicional del agente caotropico en o agregar una solución acuosa la cual contiene agente caotropico adicional a la mezcla de la etapa (b) , por lo mismo incrementando la concentración del agente caotropico en la mezcla a un valor entre 1.5 y 10 . Se nota que el agente caotropico puede ser agregado como materia sólida a la mezcla de la etapa (b) hasta que se alcanza la saturación en la mezcla. De esta forma, es además preferido que la etapa (c) comprenda disolver una cantidad adicional de agente caotropico en la mezcla de la etapa (b) , por lo que se satura la mezcla con el agente caotropico. Se prefiere que en la etapa (c) la concentración del agente caotropico en la mezcla se incremente por entre 0.5 M y 6 M. Es más preferido que en la etapa (c) la concentración del agente caotropico en la mezcla se incremente por entre 0.5 M y 4 M. Es incluso más preferido que en la etapa (c) la concentración del agente caotropico en la mezcla se incremente por entre 0.5 M y 3 M. Es incluso más preferido que en la etapa (c) la concentración del agente caotropico en la mezcla se incremente por entre 0.5 M y 2 M. Es incluso más preferido que en la etapa (c) la concentración del agente caotropico en la mezcla se incremente por entre 0.5 M y 1.5 . Es incluso más preferido que en la etapa (c) la concentración del agente caotrópico en la mezcla se incremente por entre 0.5 M y 1 M. En detalle, el procedimiento para enlazar un (por lo menos un) ácido nucleico (también referido como ácido nucleico objetivo) a un substrato tal como, por ejemplo, partículas de sílice, fibras de sílice, filtro de vidrio o partículas de vidrio pueden se descritos como sigue. De acuerdo a la invención se realiza en la presencia de sales caotrópicas con una concentración de entre 1.5 M y 10 , y preferentemente entre 2 M y 6 M. El ADN o ARN se enlazan a material con una superficie de vidrio bajo estas condiciones es decir en la presencia de ciertas concentraciones de un agente caotrópico. Para llevar el lisado en contacto con el substrato, es decir el material con una afinidad para ácidos nucleicos, se mezcla el lisado con el substrato y se incuba por un periodo de tiempo suficiente para que ocurra el enlace . En caso de que el substrato sea un filtro el cual comprende por ejemplo vidrio, sílice o fibras de cuarzo, el lisado (es decir la mezcla de la etapa (c) ) puede ser pasado a través del filtro por jalado gravitacional , por aplicar presión o por aplicar succión. Mientras el ácido nucleico pasa a través del filtro, en la fase líquida llega a estar en contacto con la fase sólida y se adsorbe al mismo. Los expertos están usualmente familiarizados con la duración de la incubación de la fase líquida y la fase sólida. La incubación puede ser optimizada por determinar la cantidad de material biológico inmovilizado en la superficie de diferentes puntos en el tiempo. Los tiempos de incubación de entre 10 segundos y 30 minutos puede ser aproximado para los ácidos nucleicos. Es además preferido usar en los procedimientos para enlazar un ácido nucleico a una fase sólida o para aislar un ácido nucleico a partir de una muestra biológica una enzima con actividad proteolítica cuando se lisa una muestra biológica con el fin de fijar libremente los ácidos nucleicos. El término "enzima con actividad proteolítica" se entiende para comprender una proteasa o una mezcla de proteasas para degradar rápidamente en la muestra biológica las enzimas de degradación de ácido nucleico u otras proteínas no deseadas . En el presente contexto, el término "proteasa" es propuesto para significar cualquier hidrolasa, peptidasa, proteinasa o enzima que tiene actividad proteolítica (es decir hidrolasas que actúan en enlaces de péptido) como está comprendido en EC 3.4-3.11 y cualquier modificación de la misma, cuya modificación tiene retenida la actividad de la enzima. La enzima con actividad proteolítica puede ser aislada de tejido animal, tejido vegetal, un microorganismos, o puede ser obtenida por medio recombinante . Por lo tanto, es preferido que el amortiguador de lisis de la etapa (a) contenga una enzima con actividad proteolítica. Es más preferido que la enzima con actividad proteolítica sea seleccionada de las proteasas como está comprendido en EC 3.4-3.11. Es incluso más preferido que la enzima con actividad proteolítica sea seleccionada del grupo que consiste de Acromopeptidasa, aminopeptidasa, Ancrod, Angiotensina, Enzima convertidora, Bromelaina, Calpaina, Calpaina I, Calpaina II, Garboxipeptidasa A, Carboxipeptidasa
B, carboxipeptidasa G, Carboxipeptidasa P", Carboxipeptidasa W, Carboxipeptidasa Y, Caspasa, Caspasa 1, Caspasa 2, Caspasa 3, Caspasa 4, Caspasa 5, Caspaa 6, Caspasa 7, Caspasa 8, Caspasa 9, Caspasa 10, Caspasa 13, Cathepsina B, Catepsina C, catepsina D, catepsina G, catepsina H, Catepsina I, quimopapaina, quimasa, alfa-quimotripsina, clostripaina, colagenasa, complento Clr, Complento Clsr complemento factor D, Complemento factor I, Cucumisina, dipeptidil peptidasa IV, leucocito Elastasa, Elastasa pancreática, endoproteinasa Arg- C, endoproteinasa Asp-N, Endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lys-C, enteroquinaa, Factor Xa, Ficina, Furina, Granzima A, Granzima B, proteasa VIH, Igasa, Tejido de kallikrein, leucina aminopeptidasa, leucina aminopeptidasa citosólica, Leucina aminopeptidasa microsomal, metaloproteasa de matriz, metionina aminopeptidasa, neutrasa, papaina, pepsina, plasmina, prolidasa, pronasa E, antígeno específico a próstata, proteasa alcalofílica a partir de Streptomyces griseus, proteasa a partir de Aspergillus, proteasa a partir de Aspergillus saitoi, proteasa a partir de Aspergillus sojae, proteasa alcalina a partir de B. Licheniformis , alcalasa a partir de B. Licheniformis , proteasa a partir de Bacillus polymyxa. Proteasa a partir de Bacillus sp, proteasa a partir de Bacillus sp (esperasa) , proteasa a partir de Rhizopus sp., proteasa S, Proteasomas, proteinasa de Aspergillus oryzae, proteinasa 3, proteinasa A, proteinasa K, prote na C, piroglutamato aminopeptidasa, renina, Rennin, Streptoquinasa, subtilisina, termolisina, trombina, activador de plasminógeno de tejido, tripsina, triptasa, y uroquinasa. Es incluso más preferido que la enzima con actividad proteolítica sea seleccionada del grupo que consiste de una caspasa, proteinasa K, pronasa E, proteasa a partir de Bacillus sp (Esperasa, y subtilisina. Una mezcla de por lo menos dos diferentes proteasas como está comprendido en EC 3.4-3.11 es también preferida. Con respecto a la selección de una proteasa los expertos están usualmente familiarizados con la optimización de amortiguadores de lisis. Como se describe en el Ejemplo 1, el técnico experto probará para actividad proteolítica de una proteasa seleccionada en un amortiguador que contiene un agente caotrópico en diferentes concentraciones. Una proteasa activa bajo las condiciones caotrópicas de una mezcla de acuerdo a la etapa (b) es seleccionada preferentemente. La optimización de la duración de la incubación con la proteasa asi como también la optimización de la temperatura de incubación puede ser realizada por el experto. Como un parámetro, el técnico experto determinará la cantidad de ácidos nucleicos fijados libres a partir de la muestra biológica en la fase líquida y capaz de enlazar al substrato.
Es altamente preferido que el amortiguador de lisis de la etapa (a) contenga proteinasa K. Preferentemente, la actividad de proteinasa en la mezcla de la etapa (b) sea entre 0.1 U/ml y 10 U/ml . Es más preferido que la actividad de la proteinasa K en la mezcla de la etapa (b) esté entre 1 U/ml Y 6 U/ml. Es incluso más preferido que la actividad de la proteinasa K en la mezcla de la etapa (b) sea entre 2 U/ml y 4 U/ml . Es incluso más preferido que la actividad de la proteinasa K en la mezcla de la etapa (b) sea aproximadamente 3 U/ml . En este aspecto se entiende que los valores de actividad recitados de la proteinasa K reflejan valores de actividad determinados como se describe en el Ejemplo 1. Cuando se lisa una muestra biológica con el fin de fijar libres los ácidos nucleicos o cuando se enlaza el ácido nucleico a la fase sólida es además preferido usar un detergente en los procedimientos, es decir un detergente aniónico, catiónico, zwiteriónico o no iónico. .Tales detergentes son bien conocidos para la persona experta en la técnica. Generalmente, un "detergente" es un agente activo superficial, también conocido como tensioactivo . Un detergente es capaz de disminuir la tensión superficial del medio en el cual se disuelve, y/o la tensión interfacial con otras fases, y, por consiguiente, es adsorbido positivamente en el líquido/vapor y/o en otras interfases. De esta forma, los detergentes son moléculas antipáticas con dominios polares (solubles en agua) y no polares (hidrofóbicos) . Son capaces de enlazar a moléculas hidrofóbicas o dominios moleculares para conferir solubilidad en agua. Dependiendo de sus ¦ características iónicas, un detergente puede ser categorizado como un detergente iónico, un detergente no iónico, y un detergente zwiteriónico . Los detergentes iónicos pueden ser además clasificados en ya sea detergentes catiónicos tales como SDS (dodecilsulfato de sodio) , LiDS (dodecilsulfato de litio) , o cetiltrimetilamoniobromuro (CTAB por sus siglas en inglés) , y detergentes aniónicos tales como ácido deoxicólico, o lauroilsarcosina de sodio. De esta forma, estos son usualmente altamente desnaturalizantes de proteínas. Detergentes no iónicos son menos desnaturalizantes de proteínas . Esto es también verdadero para detergentes zwiteriónicos tales como CHAPS, o sulfobetaina 14. Compuestos zwiteriónicos , también conocidos como zwiteriónicos, sales internas o iones dipolares son compuestos neutrales que tienen cargas eléctricas de unidad formal de signo opuesto. Por lo tanto, es preferido que el amortiguador de lisis de la etapa (a) contenga un detergente. Es más preferido que el . amortiguador de lisis de la etapa (a) contenga un detergente aniónico, catiónico, zwiteriónico o no iónico. Es incluso más preferido que el detergente en el amortiguador de lisis de la etapa (a) sea seleccionado del grupo que consiste de dodecilsulfato de sodio. El dodecilsulfato de litio, cetiltrimetilamoniobromuro, ácido deoxicólico, lauroilsarcosina de sodio, Triton-XlOO, Tween 20, octil beta-D-glucósido, Nonidet P40, CH&PS o sulfobetaina 14. Sin embargo, otros detergentes son posibles. Generalmente, cuando se usa la combinación de un agente caotropico, un detergente y una proteasa para lisar una muestra biológica, el técnico experto selecciona un detergente y se conserva su concentración en la mezcla de la etapa (b) en la base de la actividad proteolítica . Preferentemente, la fase sólida comprende un substrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste de gel de sílice, fibras de vidrio, fibras de cuarzo, y zeolitas. También preferida, la fase sólida comprende un substrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo que consiste de óxidos metálicos, y/o óxidos mixtos metálicos, alúmina, titania, zirconia y materiales que consisten predominantemente de vidrio. Es también preferido que la fase sólida comprenda una substrato mineral con un tamaño de partícula de 0.1 µ?t? a 1,000 µp?. Es también preferido que la fase sólida comprende materiales de soporte mineral porosos con un tamaño de poro de 2 a 1, 000 nm. Más preferidos, materiales de soporte porosos o no porosos, especialmente zeolitas, están en la forma de empaques flojos. Incluso más preferido, la fase sólida consiste de hojas de filtro en la forma de vidrio, cuarzo u hojas de filtro cerámico, y/o una membrana que contiene gel de sílice y/o partículas o fibras de soportes minerales y telas de cuarzo o lana de vidrio. Es también preferido que la fase sólida comprenda partículas atraibles magnéticamente. Más preferido, las partículas atraibles magnéticamente son recubiertas con un substrato mineral seleccionado del grupo que consiste de gel de sílice, vidrio, cuarzo, y zeolitas. Incluso más preferido, el substrato comprende partículas de vidrio magnéticas. Una modalidad adicional de la invención es un método para aislar un ácido nucleico a partir de una muestra biológica, el cual comprende las etapas de (a) proporcionar un amortiguador de lisis acuoso que contiene un agente caotrópico (b) mezclar el amortiguador de lisis con la muestra biológica, donde la concentración del agente caotrópico en la mezcla está entre 1 M y 4 M, e incubar la mezcla; (c) disolver una cantidad adicional de agente caotrópico en o agregar una solución acuosa la cual contiene un agente caotrópico adicional a la mezcla de la etapa (b) , por lo que se incrementa la concentración del agente caotrópico en la mezcla por más de 0.5 M; (d) poner en contacto la mezcla de la etapa (c) con la fase sólida, por lo que se adsorbe el ácido nucleico a partir de la mezcla a la fase sólida; (e) separar la fase sólida a partir de la fase líquida; (f) lavar opcionalmente la fase sólida de la etapa con un amortiguador de lavado; (g) eluir el ácido nucleico a partir de la fase sólida por lo que se aisla el ácido nucleico; (h) opcionalmente precipitar el ácido nucleico de la etapa (g) a partir del eluato y aislar el ácido nucleico precipitado . Es preferido que la fase sólida comprenda un substrato mineral no poroso seleccionado del grupo que consiste de gel de sílice, fibras de vidrio, fibras de cuarzo, y zeolitas. Es también preferido que la fase sólida comprenda partículas de vidrio magnéticas . Es mucho más preferido que el agente caotrópico sea una sal caotrópica. Es más preferido que el agente caotrópico sea seleccionado del grupo que consiste de clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, un yoduro alcalino, y un perclorato alcalino. Es también preferido que el amortiguador de lisis de la etapa (a) contenga una enzima con actividad proteolítica y un detergente. Es muy preferido que el amortiguador de lisis de la etapa (a) contenga una enzima con actividad proteolítica. Es más preferido que la enzima con actividad proteolítica sea seleccionada de las proteasas como está comprendido en EC 3.4-3.11. Es incluso más preferido que la enzima con actividad proteolítica sea seleccionada del grupo que consiste de una Caspasa, Proteinasa K, Pronasa E, Proteasa a partir del Bacillus sp (Esperasa) , y Subtilisina. Una mezcla de por lo menos dos proteasas diferentes como está comprendido en EC 3.4-3.11 es también preferida. Es también mucho más preferido que el amortiguador de lisis de la etapa (a) contenga un detergente aniónico, catiónico, zwiteriónico o no iónico. Es incluso más preferido que el detergente en el amortiguador de lisis de la etapa (a) sea seleccionado del grupo que consiste de dodecilsulfato de sodio, dodecilsulfato de litio, cetiltrimetilamoniobromuro, ácido deoxicólico, lauroilsarcosina de sodio, Triton-XlOO, Tween 20, beta-D-glucósido de octilo, Nonidet P40, CHAPS o Sulfobetaina 14. Es preferido que el valor de pH de la mezcla de la etapa (b) esté entre 8.5 y 4. Es más preferido que el valor de pH de la mezcla de la etapa (b) sea entre 7.5 y 5. Es incluso más preferido que el valor de pH de la mezcla de la etapa (b) sea entre 7 y 6. Es incluso más preferido que el valor de pH de la mezcla de la etapa (b) sea aproximadamente 6. Es mucho más preferido que la mezcla de la etapa (b) contenga la muestra biológica, tiocianato de gunidinio en una concentración entre 1.5 M y 3 M, Sal Tris en una concentración de entre 20 mM y 40 mM, Triton-X100 en una concentración de entre 5% y 20% en volumen por volumen, y proteinasa K, donde la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla está entre 1 U/ml y 5 U/ml y donde el pH de la mezcla está entre 8.5 y 6.0. En este aspecto se entiende que la actividad de la proteinasa K es determinada como se describe en el Ejemplo 1.
Es altamente preferido que la mezcla de la etapa (b) contenga la muestra biológica, tiocianato de guanídinio en una concentración entre 1.5 M y 2.5 M, Sal Tris en una concentración de entre 20 mM y 30 mM, Triton-XlOO en una concentración de entre 5% y 15% en volumen por volumen, y proteinasa K, donde la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla está entre 2 U/ml y 4 U/ml, y donde el pH de la mezcla está entre 8.5 y 6.0. Es altamente preferido que la mezcla de la etapa (b) contenga la muestra biológica, tiocianato de guanidinio en una concentración de aproximadamente 2 M, sal Tris en una concentración de aproximadametne 25 mM, Triton-X100 en una concentración de aproximadamente 10% volumen por volumen, y proteinasa K, donde la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla es aproximadamente 3 U/ml y donde el pH de la mezcla es aproximadamente 6. Incluso más preferido es un pH de 6. Un ejemplo por lo tanto es la mezcla de lisis (es decir la mezcla de acuerdo a la etapa (b) ) usada en el experimento 4 del Ejemplo 2. Es también altamente preferido que la mezcla de la etapa (b) contenga la muestra biológica, clorhidrato de guanidinio en una concentración de aproximadamente 2.7 M, urea en una concentración de aproximadamente 5 mM, sal Tris en una concentración de aproximadamente 5 mM, Triton-XlOO en una concentración de 9% volumen por volumen y proteinasa K, donde la actividad proteolítica de proteinasa K en la mezcla es aproximadamente 3 U/ml, y donde el pH de la mezcla está entre 4.4 y 6.5. Es también altamente preferido que la mezcla de la etapa (b) contenga la muestra biológica, clorhidrato de guanidinio en una concentración de aproximadamente 2.4 M, urea en una concentración de aproximadamente 1.6 mM, sal Tris en una concentración de aproximadamente 85 mM, EDTA en una concentración de aproximadamente 88 mM, NaCl en una concentración de aproximadamente 8 mM, Triton-XlOO en una concentración de aproximadamente 99% volumen por volumen y proteinasa K, donde la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla es aproximadamente 3 U/ml, y donde el pH de la mezcla está entre 4.4 y 6.5. Es además preferido que la mezcla de la etapa (b) la cual incluye una proteasa sea incubada para una cierta cantidad de tiempo y en condiciones ambiente que permiten la actividad proteolítica. Es preferido que la mezcla de la etapa (b) sea incubada por 10 minutos a 30 minutos en una temperatura entre 20°C y 75°C, donde se agita la mezcla. Un medio de agitación preferida es un mezclador de rodillo o un termomezclador . Los términos "agitación" y "agitar" son entendidos como mover el tubo de prueba el cual contiene la mezcla de la etapa (b) como para invertir el tubo de prueba una vez un segundo. Los términos también incluyen movimientos que tienen un efecto equivalente con respecto a provocar turbulencia en la mezcla de la etapa (b) . El grado de agitación puede también ser influida por el tamaño del ácido nucleico a ser aislado. Demasiada agitación puede llevar a fuerzas de esfuerzo cortante que resultan en restricción de tamaño de las moléculas de ácido nucleico en la mezcla. Por lo tanto, agitación más lenta puede ser seleccionada por el experto. Es más preferido que la mezcla de la etapa (b) sea incubada por 30 minutos en temperatura ambiente, donde se agita la mezcla usando un mezclador de rodillo. Es incluso más preferido que la mezcla de la etapa (b) sea incubada por aproximadamente 10 a 20 minutos en una temperatura entre 50°c y 75°C, donde se agita la mezcla usando un termomezclado . Es incluso más preferido que la mezcla de la etapa (b) sea incubada por 10 minutos a 20 minutos en aproximadamente 56°C, donde se agita la mezcla usando un mezclador de rodillo o un termomezclador. Es incluso más preferido que la mezcla de la etapa (b) sea incubada por 15 minutos en 56°C, donde se agita la mezcla usando un mezclador de rodillo o un termomezclador. Es también mucho más preferido que la mezcla de la etapa (b) sea incubada por 10 minutos a 20 minutos en aproximadamente 72°C, donde se agita la mezcla usando un mezclador de rodillo o un mezclador de rodillo o un termomezclador. Es incluso más preferido que la mezcla de la etapa (b) sea incubada por 10 minutos en 72 °C, donde se agita la mezcla usando un mezclador de rodillo o un termomezclador. Después de adsorber los ácidos nucleicos a partir de la mezcla de la etapa (c) a la fase sólida, se separa el ácido nucleico enlazado a partir de la fase líquida. Esto puede ser logrado en general por gravedad o en el caso conveniente de ácidos nucleicos enlazados a partículas de vidrio magnéticas por separar el material enlazado a las partículas magnéticas por aplicar un campo magnético. Por ejemplo, las partículas magnéticas pueden ser jaladas a la pared del vaso en el cual se realiza la incubación. El líquido que contiene los contenidos de muestra que no son enlazados a las partículas magnéticas pueden entonces ser removidos. El procedimiento de remoción usado depende del tipo de vaso en el cual se realiza la incubación. Etapas adecuadas incluyen remover el líquido por medio de pipeteo o aspiración. En el caso de que la fase sólida sea un filtro (tal como un filtro el cual comprende cuarzo o fibras de vidrio) la mezcla de la etapa (c) es pasada preferen emente a través del filtro. La separación de la fase líquida a partir de la fase sólida es entonces efectuada por jalado gravitacional , por la aplicación de presión o por la aplicación de succión. La fase sólida con el ADN o ARN enlazado puede entonces ser lavada. Esta etapa es opcional, dependiendo de la naturaleza y la cantidad de material indeseado en la muestra biológica así como también en la pureza deseada del ácido nucleico aislado. Si se desea una etapa de lavado, es preferido que la fase sólida se lava por lo menos una vez, por ejemplo, con una mezcla de 1-90% volumen por volumen de un alcohol tal como alcohol isopropílico o etanol . Ejemplos de soluciones de lavado son el "amortiguador de remoción de inhibidor" y el "amortiguador de lavado" descritos en el Ejemplo 2(A) . Generalmente, se usa una solución de lavado que no provoca que sea liberado el ácido nucleico a partir de la superficie de la fase sólida pero que lave los contaminantes indeseados como sea totalmente posible . Esta etapa de lavado toma lugar preferentemente por incubar el material con el ácido nucleico enlazado con la solución de lavado. La fase sólida es preferentemente resuspendida durante esta etapa. En el caso de que la fase sólida sea un filtro se prefiere que la solución de lavado se pase a través del filtro. La solución de lavado contaminada es removida preferentemente justo como en la etapa descrita anteriormente para enlazar los ácidos nucleicos. Es incluso más preferido realizar dos etapas de lavado consecutivas, donde la primera etapa de lavado se realiza usando un amortiguador de remoción de inhibidor y la segunda etapa de lavado es realizada usando amortiguador de lavado. Un amortiguador de remoción de lavado está caracterizado porque contiene un agente caotrópico. Al lavar con el amortiguador de remoción de inhibidor se remueven las substancias tóxicas o inhibidores que pueden interferir con reacciones enzimáticas tales como, por ejemplo reacciones realizadas por enzima de restricción o polimerasas. El lavado con amortiguador de lavado remueve el agente caotrópico residual de los ácidos nucleicos enlazados. Después de la última etapa de lavado, el material puede ser secado brevemente en vacio, o el fluido puede ser permitido para evaporarse. Una etapa de pretratamiento usando acetona puede también ser realizado. Después de esto, las condiciones pueden ser invertidas, por ejemplo la concentración de sal es disminuida para eluir el ADN o ARN enlazado al material . Los amortiguadores de elución son conocidos de la Patente Alemana 37 24 442 y Jakobi R, et al.. Anal. Biochem. 175 (1988) 19S-201. Los amortiguadores de elución con un bajo contenido de sal son en particular amortiguadores con un contenido de menos de 0.2 M. Preferentemente, el amortiguador de elución contiene la substancia Tris para propósitos de amortiguamiento. Es mucho más preferido que el amortiguador de elución sea una solución acuosa la cual contiene una sal Tris, donde la concentración de la sal Tris es 50 mM. Más preferida es una solución acuosa la cual contiene una sal Tris, donde la concentración de la sal Tris es 50 mM y el pH está entre 6.5 y 8.5. Incluso más preferido es un pH de 7.5. También preferido, el amortiguador de elución es agua desmineralizada. La solución la cual contiene ADN o ARN purificada puede ahora ser usada para otras reacciones. Opcionalmente, el ácido nucleico puede ser precipitado a partir de la solución usando, por ejemplo, etanol o isopropanol . El precipitado puede también ser sometido a etapas adicionales de lavado. Los métodos de este tipo son bien conocidos para el técnico experto y se describe en detalle en Sambrook, Fritsch & aniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edición, CSHL. Press, 2001. Los ácidos nucleicos objetivos pueden ser detectados y determinados. El método de purificación descrito anteriormente es preferido, seguido por una etapa de determinación o de deteccón o métodos de purificación seguidos por una etapa de amplificación y determinación o detección. El ácido nucleico objetivo o ácidos nucleicos de interés pueden estar contenidos en una matraz de ácidos nucleicos no objetivo, y pueden incluso ser un componente menor en la mezcla de ácidos nucleicos específicos . Los métodos de detección de ADN adecuados son conocidos para el técnico experto y. son descritos en libros de texto estándar como Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edición, CSHL, Press, 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY, 1987. Puede haber también etapas de purificación antes de que se realice la etapa de detección de ADN, como por ejemplo una etapa de precipitación. Los métodos de detección pueden incluir pero no se limitan al enlace o intercalación de tintes específicos como bromuro de etidio el cual se intercala en el ADN de doble cadena y cambia su fluorescencia después de esto. El ADN purificado puede también ser separado por métodos electroforáticos, opcionalmente después de una digetión de restricción, y se visualiza después de esto. Hay también ensayos a base de sonda los cuales explotan la hibridización de oligonucleótidos a secuencias específicas y subsecuente detección del híbrido. Es también posible secuenciar el ADN después de las etapas adicionales conocidas por el técnico experto. Otros métodos aplican una diversidad de secuencias de ADN a un chip de silicio al cual se enlazan las sondas específicas y producen una señal cuando se enlazan secuencias complementarias . La invención también comprende la mezcla de componentes no proteináceos y proteináceos que comprenden ácidos nucleicos donde los ácidos nucleicos comprenden ADN o AKN o ambos . La invención también comprende muestras biológicas, a partir de las cuales se purifican los ácidos nucleicos, que comprenden virus o células bacterianas, así como también células aisladas a partir de organismos multicelulares como por ejemplo células humanas y animales tales como leucocitos y compuestos químicos de bajo y alto peso molecular activos inmunológicamente tales como haptenos, antígenos, anticuerpos y ácidos nucleicos, plasma sanguínea, fluido cerebral, esputo, heces fecales, especímenes de biopsia, médula ósea, enjuagues orales, suero sanguíneo, tejidos, orina y mezclas de los mismos . La presente invención también comprende muestras biológicas tales como un fluido a partir del cuerpo humano o animal; preferentemente la muestra es sangre entera, plasma sanguíneo, suero sanguíneo u orina. La muestra de sangre entera es preferentemente sangre EDTA, sangre de hperaina o citrato. El plasma sanguíneo es preferentemente plasma EDTA, heparina o citado sanguíneo. En una modalidad de la invención la muestra biológica comprende células bacterianas, células eucarióticas, virus o mezclas de los mismos. Es también preferido que la mezcla de ácidos nucleicos y material proteináceo comprenda ácido desorribonucleico (ADN) o un ácido ribonucleico (ARN) o ambos, preferentemente el ADN o ARN o ambos se deriva de un virus o un (por lo menos un) microorganismo. El virus puede ser el virus de hepatitis A (VHA) , virus de la hepatitis B (VHB) , virus de hepatitis C (VHC) , el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , el virus de papiloma humano (VPH) o parvovirus B19. Es también preferido que un componente de ácido nucleico objetivo y los otros ácidos nucleicos sean purificados esencialmente como se describe anteriormente. Después el componente de ácido nucleico objetivo es además manipulado y detectado, es decir es ampliicado con la reacción de cadena polimerasa la cual amplifica específicamente secuencias objetivos a cantidades detectables. Otras posibles reacciones de amplificación posibles son la reacción de cadena ligasa (LCR, Wu, D. Y y Wallace, R. B . , Genomics 4 (1989) 560-569, y Barany, F . , Proc. Nati. Acad. Sci . USA 88 (1991) 189-193); Reacción de cadena ligasa polimerasa (Barany, F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16); Gap-LCR (solicitud WO 90/01069); reacción de cadena de reparación (Patente Europea 0 439 182) ; 35R (kwoh, D.Y. , et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli, J. C., et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 87 (1990) 1874-1878; solicitud WO 92/08800) y NASBA (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,130,238). Además, están la amplificación de desplazamiento de cadena (SDA por siglas en inglés) , amplificación mediada por transcripción (??? por sus siglas en inglés) , y amplificación Q-beta (por una revisión ver por ejemplo Whelen, A C, y Persing, D.H. , Annu. Rev. Microbiol . 50 (1996) 349-373; Abramson R.D., y Myers, T.W. , Curr. Opin. Biotecnol . 4 (1993) 41-47). Es particularmente preferido el método de detección
TaqMan® descrito en la solicitud WO 92/02638 y las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica correspondientes 5,210,015; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,804,375; Patente de los Estads Unidos de Norteamérica 5,487,972. Este método explota la actividad de la exonucleasa de una polimerasa para generar una señal. En detalle, el componente de ácido nucleico objetivo es detectado por un proceso el cual comprende poner en contacto la muestra con un oligonucleótido el cual contiene una secuencia complementaria para una región del componente de ácido nucleico objetivo y un oligonucleótido etiquetado el cual contiene una secuencia complementaria a una segunda región de la misma cadena de secuencia de componente de ácido nucleico objetivo, pero no incluyendo la secuencia de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de dúplex durante condiciones de hibridización, en donde los dúplex comprenden el ácido nucleico objetivo templado al primer oligonucleótido y al oligonucleótido etiquetado de tal forma que el extremo 3' del primer oligonucleótido está adyacente al extremo 5' del oligonucleótido etiquetado. Depués se trata esta mezcla con una polimerasa de ácido nucleico dependiente a templado que tiene una actividad de nucleasa 5' a 3" bajo condiciones suficientes para permitir la actividad de nucleasa 5" a 3' de la polimerasa para escindir el oligonucleótido templado, etiquetado y liberar fragmentos etiquetados. La señal generada por la hidrólisis del oligonucleótido etiquetado es detectada y/o medida. La tecnología TaqMan® elimina la necesidad para un complejo de reacción enlazado a fase sólida para ser formada y hecha detectable. En términos más generales, un procedimiento para la purificación de un componente de ácido nucleico objetivo seguido por la etapa de detección es descrita en donde la reacción de amplificación y/o detección es una fase de solución homogénea. Se proporcionan los siguientes ejemplos, referencias y figuras para auxiliar al entendimiento de la presente invención, el alcance verdadero del cual se indica en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden hacerse modificaciones en los procedimientos indicados sin alejarse del espíritu de la invención. La Figura 1 es la actividad de la proteinasa K en t=0 minutos en relación a variación de concentración de tiocianato de guanidinio (valores 0 minutos) . El eje x indica la concentración molar de tiocianato de guanidinio, el eje y indica la actividad de proteinasa K en (%) . La Figura 2 es la actividad de la proteinasa en t=15 minutos en relación a variación de concentraciones de tiocianato de guanidinio (valores 15 minutos) . El eje x indica la concentración molar de tiocianato de guanidinio, el eje y indica la actividad de proteinasa K en (%) . La Figura 3 es el rendimiento de ADN en µg por mi de sangre, de acuerdo al Ejemplo 2 y Tabla 3. El eje x indica el experimento respectivo, el eje y indica el rendimiento de ADN en µg por mi de sangre. También se indican las desviaciones estándar . La Figura 4 es el rendimiento de ADN en µg por mi de sangre, de acuerdo al Ejemplo 3 y la Tabla 5. El eje x indica el experimento respectivo, el eje y indica el rendimiento de ADN en µg por mi de sangre . También se indican las desviaciones estándar. La Figura 5 es el rendimiento de ADN en µg por mi de sangre, de acuerdo al Ejemplo 4 y Tabla 7. El eje x indica el experimento respectivo, el eje y indica el rendimiento de ADN en µg por mi de sangre. También se indican las desviaciones est ndar . Ejemplo 1 (A) Incubación de proteinasa K en la presencia de un agente caotropico Se mezclan 10 µ? de mg/ml de solución de provisión de proteinasa K (Roche Diagnostics GmbH, Mannheimm, no de catálogo 745723; 90 mg se disuelven en 4.5 mi de agua) con un amortiguador caotrópico el cual contiene Tris-HCl 50 mM pH S.0, DTT al 1%, Triton-X100 al 20% y xM de tiocianato de guanidinio; x=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6). Directamente después de mezclar la proteinasa K se mide la actividad en una primera alícuota (10 µg) de la mezcla usando el ensayo descrito posteriormente (0 min de valor de actividad) . 15 minutos después de mezclar la proteinasa K se mide la actividad en una segunda alícuota (10 µg) de la mezcla usando el ensayo descrito posteriormente (15 minutos de valor de actividad) . (B) Ensayo para determinar la actividad de proteinasa K Se mezclan 10 µ9 de la proteinasa K en amortiguador caotrópico (ver anteriormente, (A) ) con amortiguador de ensayo, es decir 980 µ? de trietanolamina 0.2 PEG 6000 al 0.05% (peso por volumen) , cloruro de calcio 0.1 M y 10 µ? de una solución de substrato 200 mM. El substrato es Suc-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilida . El amortiguador de ensayo es proporcionado en una cubeta. Inmediatamente después de mezclar la cubeta se coloca en un fotómetro. Se toman las mediciones (absorpcion) sobre 15 minutos en 25°C. La actividad de la proteinasa en el amortiguador de ensayo se calcula a partir de las cinéticas como se indica por un cambio en la absorpcion en 405 nm. La Tabla 1 enlista los valores de 0 minutos de la proteinasa K, en la presencia de tiocianato de guanidinio en las concentraciones diferentes dadas en (A) . La Tabla 2 lista los valores de 15 minutos de la actividad de la proteinasa K en la presencia de tiocianato de guanidinio en las concentraciones diferentes dadas en (A) así como también el valor de control (ningún agente caotrópico presente) . Los valores se expresan en relación al valor de actividad de 0 minutos de la proteinasa K en el amortiguador de control sin agente caotrópico (ver (A)), que corresponde a 0.5 U/ml; este valor se fija en 100%. Los datos de la Tabla 1 y Tabla 2 son representados gráficamente en la Figura 1 y Figura 2.
Tabla 1 La actividad de la protexnasa K en t=0 en relación a varias concentraciones de tiocianato de guanidinio (valor de 0 minutos)
La actividad de la proteinasa K en t=15 min en relación a varias concentraciones de tiocianato de guanidinio (valor de 15 minutos) Concentración (M) Actividad (%) 0 105 1 95
2 95 3 1 4 0 5 0 6 0 Ejemplo 2 (A) Reactivos a) proteinasa K de solución de provisión: proteinasa K recombinante, grado PCR, 50 U/ml b) amortiguador de lisis: tiocianato de guanidinio 4 M, Tris-HCl 50 mM, Triton-X100 al 20%, pH 6.0 c) amortiguador de enlace: tiocianato de guanidinio, Tris-HCl 50 mM, Triton-X100 al 20%, pH 6.0 d) amortiguador de remoción de inhibidor: clorhidrato de guanidinio 5 M, Tris-HCl 20 mM, etanol al 38%, pH 6.6 e) Amortiguador de lavado: NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, etanol al 80%, pH 7.5 f) Amortiguador de elución Tris-HCl 50 mM, pH 8.2 g) Etanol (100%) Adicionalmente necesario: columnas de giro comercialmente disponibles que contienen una membrana de sílice, por ejemplo NucleoSpin Blood L, distribuida por Machery & Nagel . (B) Experimento 1 : un procedimiento de una etapa sin tratamiento de proteinasa K 1. pipetear 1, 000 µ? de sangre EDTA en un tubo Falcon de 15 mi 2. agregar 1,000 µ? de amortiguador de lisis, agitar en vortex suavemente 3. incubar por 15 minutos en temperatura ambiente en un mezclador de rodillo, agitar 4. colocar una columna de giro en un nuevo tubo Falcon 5. transferir la mezcla de las etapas 1.-2. (aproximadamente 2,000 µ?) a la columna de giro 6. centrifugar por 3 minutos en l,900x g. 7. agregar 1,000 µ? de inhibidor de amortiguador de remoción 8. centrifugar por 2 minutos en 4,500 x g 9. agregar 2,000 µ? de amortiguador de lavado 10. centrifugar por 10 minutos en 4,500 xg 11. descargar a través de flujo y colocar en columna de filtro en un nuevo tubo Falcon 12. eluir con 300 µ? de amortiguador de elución precaliente (70°C) 13. incubar por 5 minutos en temperatura ambiente 14. centrifugar por 2 minutos en 4,500 xg 15. medir OD del eluato en 260, 280 y 320 nm (C) Experimento del eluato en 260, 280 y
320 nm (1) pipetear 125 µ? de proteinasa K en un tubo
Falcon de 15 mi (2) agregar 1,000 µ? de sangre EDTA, agitar suavemente en un vortex, (3) agregar 1,000 µ? de amortiguador de lisis, agitar en vortex suavemente (4) incubar y agitar en 56°C por 15 minutos (por ejemplo usando un termomezclador) , agitar (5) colocar una columna de giro en un nuevo tubo Falcon (6) transferir la mezcla de las etapas 1.-2. (aproximadamente 2,125 µ?) a la columna de giro (7) centrifugar por 3 minutos en l,900x g. (8) agregar 1,000 µ? de inhibidor de amortiguador de remoción (9) centrifugar por 2 minutos en 4,500 x g (10) agregar 2,000 µ? de amortiguador de lavado
(11) centrifugar por 10 minutos en 4,500 xg (12) descargar a través de flujo y colocar en columna de filtro en un nuevo tubo Falcon (13) eluir con 300 µ? de amortiguador de elución precaliente (70°C) (14) incubar por 5 minutos en temperatura ambiente (15) centrifugar por 2 minutos en 4,500 xg (16) medir por OD del eluato en 260, 280 y 320 nm (D) procedimiento 3 : procedimiento de dos etapas que incluye etanol (1) pipetear 125 µ? de proteinasa en un tubo Falcon de 15 mi (2) agregar 1,000 µ? de sangre EDTA, agitar suavemente en un vortex, (3) agregar 1,000 µ? de amortiguador de lisis, agitar en vortex suavemente (4) incubar y agitar en 56°C por 15 minutos (por ejemplo usando un termomezclador) , agitar (5) agregar 1,000 µ? de etanol, agitar por vortex suavemente (6) colocar una columna de giro en un nuevo tubo Falcon (7) transferir la mezcla de las etapas 1.-5. (aproximadamente 3,125 µ?) a la columna de giro (8) centrifugar por 3 minutos en l,900x g. (9) agregar 1,000 µ? de inhibidor de amortiguador de remoción (10) centrifugar por 2 minutos en 4,500 x g (11) agregar 2,000 µ? de amortiguador de lavado (12) centrifugar por 10 minutos en 4,500 xg (13) descargar a través de flujo y colocar en columna de filtro en un nuevo tubo Falcon (14) eluir con 300 µ? de amortiguador de elución precaliente (70°C) (15) incubar por 5 minutos en temperatura ambiente (16) centrifugar por 2 minutos en 4,500 xg (17) medir OD del eluato en 260, 280 y 320 nm (E) Experimento 4 : procedimiento de dos etapas que incluye amortiguador de enlace (1) pipetear 125 µ? de proteinasa K en un tubo Falcon de 15 mi (2) agregar 1,000 µ? de sangre EDTA, agitar suavemente en un vortex, (3) agregar 1,000 µ? de amortiguador de lisis, agitar en vortex suavemente (4) incubar y agitar en 56°C por 15 minutos (por ejemplo usando un termomezclador) , agitar (5) agregar 1,000 µ? de amortiguador de enlace, agitar en vortex suavemente (6) colocar una columna de giro en un nuevo tubo Falcon (7) transferir la mezcla de las etapas 1.-5. (aproximadamente 3,125 µ?) a la columna de giro (8) centrifugar por 3 minutos en l,900x g. (9) agregar 1,000 µ? de amortiguador de remoción de inhibidor (10) centrifugar por 2 minutos en 4,500 x g (11) agregar 2,000 µ? de amortiguador lavado (12) centrifugar por 10 minutos en 4,500 x g (13) descargar a través de flujo y colocar en columna de filtro en un nuevo tubo Falcon (14) eluir con 300 µ? de amortiguador de elución precaliente (70 °C) (15) incubar por 5 minutos en temperatura ambiente (16) centrifugar por 2 minutos en 4,500 xg (17) medir OD del eluato en 260, 280 y 320 nm Tabla 3 Rendimiento de ADN humano, en (µ?/ta? de sangre)
(a) y (b) indican datos de experimentos duplicados: SD: desviación estándar Tabla 4 Pureza de ADK como se determina por las relacionaes 260 nm/280 nm con correción de 320 nm
(a) y (b) indican datos de los experimentos dobles (ver Tabla 3) Con respecto a la pureza de ADN, una proporción de 260 nm/280 nm (incluyendo la corrección de 320 nm) de 1.8 + 0.1 es vista como que es aceptable. Los datos muestran que el método de acuerdo a la invención, es decir el método del Experimento 4 produce igualmente (si no un ADN de mayor pureza) comparado con el método del Experimento 3. Ejemplo 3 (A) Reactivos a) Amortiguador de lisis/amortiguador de enlace, caotrópico (7M (amortiguador de lisis) /4 (amortiguador de enlace) tiocianato de guanidinio, Tris-HCl 50 mM, Triton- X100 20%, pH 6.0) t>) Amortiguador de remoción de inhibidor (HC1 de guanidinio 5M, TrisHCl 20 mM, etanol al 38%, pH 6.6) c) Amortiguador de lavado (NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, etanol al 80%, pH 7.5) d) Amortiguador de elución (Tris 50 mM, pH 8.1) e) Etanol (absoluto) Adicionalmente necesario: columnas de filtro de fibra de vidrio (con membrana de sílice, por ejemplo NucleoSpin Blood L, comercialmente disponible de Macherey-Nagel ) (B) Experimento 5, procedimiento de una etapa: amortiguador delisis: 7M, sin amortiguador de enlace Se pipetea 1,000 µ? de sngre EDTA en un tubo Falcon de 15 mi, se agregan 1, 000 amortiguador de lisis (7 M) y se gira por vortex el tubo. Se incuba la mezcla por 15 minutos en 56°C en un termomezclador. Un nuevo tubo Falcon con una columna de filtro de fibra de vidrio es proporcionada y la preparación de sangre entera (aproximadamente 2,000 µ?; concentración caotrópica 3.5 M) se transfiere a la columna de filtro. Después de la centrifugación en 1,900 x g por 3 minutos 1, 000 µ? de amortiguador de remoción de inhibidor se transfiere a la columna, seguido por otra etapa de centrifugación en 4,200 x g por 2 minutos. Después de eso, se transfiere 2,000 µ? de amortiguador de lavado a la columna, seguido por centrifugación en 4,200 x g por 10 minutos. Se descarga el flujo a través y se coloca la columna de filtro en un nuevo tubo Falcon. Los ácidos nucleicos enlazados son eluidos usando 500 µ? de amortiguador de elución precaliente (70°C) . Se transfiere el amortiguador de elución a la columna y se incuba por 5 minutos en temperatura ambiente. Después de la centrifugación en 4,200 x g por 2 minutos se analiza el flujo a través por medición de densidad óptica en 230, 260, 280 y 320 nm. (C) Experimento 6, procedimiento de dos etapas: amortiguador de lisis: 7M, amortiguador de enlace: 4M Se pipetea 1,000 µ? de sangre EDTA en un tubo Falcon de 15 mi, se agregan 1, 000 amortiguador de lisis (7 M) y se gira por vortex el tubo. Se incuba la mezcla por 15 minutos en 56°C en un termomezclador. Se agrega amortiguador de enlace (4 M) se mezcla por agitado por vortex. Un nuevo tubo Falcon con una columna de filtro de fibra de vidrio es proporcionada y la preparación de sangre entera (aproximadamente 2,500 µ?; concentración caotrópica 4.5 M) se transfiere a la columna de filtro. Después de la centrifugación en 1,900 x g por 3 minutos 1,000 µ? de amortiguador de remoción de inhibidor se transfiere a la columna, seguido por otra etapa de centrifugación en 4,200 x g por 2 minutos. Después de eso, se transfiere 2,000 µ? de amortiguador de lavado a la columna, seguido por centrifugación en 4,200 x g por 10 minutos. Se descarga el flujo a través y se coloca la columna de filtro en un nuevo tubo Falcon. Los ácidos nucleicos enlazados son eluidos usando 500 µ? de amortiguador de elución precaliente (70°C). Se transfiere el amortiguador de elución a la columna y se incuba por 5 minutos en temperatura ambiente. Después de la centrifugación en 4,200 x g por 2 minutos se analiza el flujo a través por medición de densidad óptica en 230, 260, 280 y 320 nm. Tabla 5 Rendimiento de ADN humano, en {µg/ l de sangre)
Experimento 5 Experimento 6 (a) 5.95 11.35 (b) 11.35 13.02 Media 8.65 12.18 SD 3.82 1.18 (a) y (b) indican datos de experimentos replicados: SD: desviación estándar Tabla 6 Pureza de ADN como se determina por las relaciones 260 nm/280 nm con correción de 320 nm
(b) y (b) indican datos de los experimentos dobles (ver Tabla 5) Ejemplo 4 (A) Reactivos a) Amortiguador de lisis/amortiguador de enlace, caotrópico (7 (amortiguador de lisis) /5M (amortiguador de lisis) /4M (amortiguador de enlace) tiocianato de guanidinio, Tris-HCl 50 mM, Triton-X100 20%, pH 6.0) b) Amortiguador de remoción de inhibidor (HC1 de guanidinio 5M, TrisHCl 20 M, etanol al 38%, pH 6.6) c) Amortiguador de lavado (NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, etanol al 80%, pH 7.5) d) Amortiguador de elución (Tris 50 mM, pH 8.1) e) Etanol (absoluto) Adicionalmente necesario: columnas de filtro de fibra de vidrio (con membrana de sílice, por ejemplo NucleoSpin Blood L, comercialmente disponible de Macherey-Nagel) (B) Experimento 7, procedimiento de una etapa: amortiguador de lisis: 7M, sin amortiguador de enlace Se pipetea 1,000 µ? de sngre EDTA en un tubo Falcon de
15 mi, se agregan 1,000 amortiguador de lisis (7 M) y se gira por vortex el tubo. Se incuba la mezcla por 15 minutos en 56°C en un termomezclador. Un nuevo tubo Falcon con una columna de filtro de fibra de vidrio es proporcionada y la preparación de sangre entera (aproximadamente 2,000 µ?; concentración caotrópica 3.5 M) se transfiere a la columna de filtro. Después de la centrifugación en 1,900 x g por 3 minutos 1,000 µ? de amortiguador de remoción de inhibidor se transfiere a la columna, seguido por otra etapa de centrifugación en 4,200 x g por 2 minutos. Después de eso, se transfiere 2,000 µ? de amortiguador de lavado a la columna, seguido por centrifugación en 4,200 x g por 10 minutos. Se descarga el flujo a través y se coloca la columna de filtro en un nuevo tubo Falcon. Los ácidos nucleicos enlazados son eluidos usando 500 µ? de amortiguador de elución precaliente (70°C) . Se transfiere el amortiguador de elución a la columna y se incuba por 5 minutos en temperatura ambiente. Después de la centrifugación en 4,200 x g por 2 minutos se analiza el flujo a través por medición de densidad óptica en 230, 260, 280 y 320 nm.
(c) Experimento 8, procedimiento de dos etapas: amortiguador de lisis: 5M, amortiguador de enlace: 4M Se pipetea 1,000 µ? de sangre EDTA en un tubo Falcon de 15 mi, se agregan 1,000 amortiguador de lisis (5 M) y se gira por vortex el tubo. Se incuba la mezcla por 15 minutos en 56°C en un termomezclador. Se agrega amortiguador de enlace (4 M) se mezcla por agitado por vortex. Un nuevo tubo Falcon con una columna de filtro de fibra de vidrio es proporcionado y la preparación de sangre entera (aproximadamente 2,500 µ?; concentración caotrópica 3.5 M) se transfiere a la columna de filtro. Después de la centrifugación en 1,900 x g por 3 minutos 1,000 µ? de amortiguador de remoción de inhibidor se transfiere a la columna, seguido por otra etapa de centrifugación en 4,200 x g por 2 minutos. Después de eso, se transfiere 2,000 µ? de amortiguador de lavado a la columna, seguido por centrifugación en 4,200 x g por 10 minutos. Se descarga el flujo a través y se coloca la columna de filtro en un nuevo tubo Falcon. Los ácidos nucleicos enlazados son eluidos usando 500 µ? de amortiguador de elución precaliente (70 °C) . Se transfiere el amortiguador de elución a la columna y se incuba por 5 minutos en temperatura ambiente . Después de la centrifugación en 4,200 x g por 2 minutos se analiza el flujo a través por medición de densidad óptica en 230, 260, 280 y 320 nm.
Tabla 7 Rendimiento de ADN humano, en {µ?/p?? de sangre)
(a) y (b) indican datos de experimentos replicados: SD: desviación estándar Tabla 8 Pureza de ADN como se determina por las relaciones 260 nm/280 nm con correción de 320 nm
(a) y (b) indican datos de los experimentos dobles (ver Tabla 7) Lista de referencias : Abramson, R.D., y Myers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41-47 Alderton, R.P., et al., Anal. Biochem 201 (1992) 166-169 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY, 1987 Barany, F . , PCR Methods andApplic. 1 (1985) 5-16 Barany, F . , Proc . Nati . Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193
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