KR101193765B1 - 초고속 핵산의 정제방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 초고속 핵산의 정제방법에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 초고속 핵산의 분리방법은 질병원의 진단이나 목적하는 유전자의 검출을 위하여 매우 유용한 방법으로, 복잡하고 특수한 장비를 사용해야 하는 기존 핵산 분리 방법과 비교하여 신속하고 간편하게 질병원의 분자 진단에 사용될 수 있으며, 숙련된 기술이 요구되지 않기 때문에 일반인들이 직접 질병원의 분석을 위한 핵산 분리가 가능하고, 더 나아가 병, 의원 또는 검진 센터의 방문을 통해서만 가능한 기존의 번거로움을 해결해 줄 수 있고 보다 더 신속하게 질병원을 분석할 수 있는 장점이 있다.

Description

초고속 핵산의 정제방법{Rapid nucleic acid purification}
본 발명은 초고속 핵산의 정제방법으로, 보다 상세하게는 실리카 막(silica membrane)과 케오트로픽 염 및 사코시네이트(sarcosinate) 성분의 완충액을 이용한 초고속 핵산의 정제방법에 관한 것이다.
핵산이 포함된 시료에서부터 핵산을 정제하기 위해서는 물리적 및/또는 화학적인 정제 과정을 거쳐야 한다. 일반적으로, 핵산을 정제하기 위한 과정에 있어서, 입자의 크기가 큰 고형 성분을 용액상에서 제거하는 단계가 필요한 경우가 많다.
특히, 생체 시료를 용해하여 핵산을 얻고자 할 경우 세포에 함유된 각종 단백질 성물을 포함한 불순물 등이 제거될 필요가 있는데, 일반적으로 사용되는 방법은 원심분리를 이용한 침전법을 통해 제거하거나, 필터에 의해 여과하여 제거하는 방법이 있다. 전자의 방법은 실험실에서 흔히 사용되고 있으나 대량의 시료를 처리하는 데는 부적합하고 자동화하기가 곤란하다. 반면에, 후자의 방법은 감압 또는 가압 장치가 부착된 자동화기기에 적용시켜 대량의 시료를 연속적으로 처리하기에 적합하다.
형질전환 된 대장균 또는 박테리아 세포에서 플라스미드만을 추출하는 과정에 있어서, 염색체 DNA를 분리해야 하는데, 이는 유전자 증폭, 염기서열 분석, 유전자 재조합 과정 등에서 염색체 DNA에 의해 원하지 않는 반응이 진행되는 것을 막아야 하기 때문이다.
조직 시료로부터 핵산을 분리하는 방법은 크게 2 가지의 단계로 나누어진다. 첫 번째 과정은 조직 세포를 용해해서 모든 핵산을 포함한 모든 세포 구성물들을 용출시키는 과정이다. 이 세포의 용해 과정은 물리적인 혹은 화학적인 방법에 의해서 이루어질 수 있다. 그러나 핵산의 분리를 위하여 핵산의 손상을 최소화하고 조직 세포를 효과적으로 용해하기 위하여 화학적인 방법이 널리 사용되며, 특히 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)과 같은 음이온성 계면 활성제가 주로 이용된다.
두 번째 과정은 세포 파쇄액으로부터 불순물을 제거하고 순수한 핵산을 분리하는 과정이다. 이런 핵산을 추출하는 방법은 주로 페놀-클로로포름과 같은 유기용매의 처리, 염석, 케오트로픽 염 등을 사용한다.
상기 두 가지의 과정을 통해 조직 세포로부터 핵산을 분리하는 방법이 널리 사용되고 있기 때문에 기존의 핵산 분리 방법들은 조직 세포로부터 핵산의 용출을 용이하게 하기 위하여 계면활성제가 포함된 세포 파쇄액을 첫 번째 핵산 추출용 완충액으로 사용한다. 핵산 분리과정에서 두 번째로 중요한 완충액은 케오트로픽 염과 같은 고 농도의 염이 포함된 완충액을 사용하는 것이다. 이런 고농도의 염이 포함된 완충액은 염석을 통해 핵산으로부터 불순물을 제거하는데 매우 중요한 역할을 한다.
고순도의 핵산을 분리하기 위하여 상기 두 가지 형태의 완충액은 단계적으로 조직 세포에 적용되어 세포 용해 및 염석을 통한 불순물 제거에 사용된다. 특히, 도데실 황산 나트륨이 포함된 세포 파쇄액으로 용해된 세포 파쇄액은 고농도의 염이 포함된 완충액과 혼합된 후 염석을 통한 불순물의 침전을 용이하게 해주며 이것은 고순도의 핵산 분리에 매우 중요하며, 기존 핵산 분리 방법에서 효과적인 세포 용해를 위한 세포 파쇄 완충액에 가장 널리 사용된다.
최근에는 알려진 핵산 분리 기술들은 실리카 막(silica membrane) 또는 이온 교환 크로마토그래피법을 이용하여 세포 파쇄액(lysate)으로부터 핵산을 분리하는 데 사용한다. 특히, 현재 가장 널리 사용되고 있는 방법은 실리카 막에 핵산을 결합시켜 다른 불순물로부터 핵산을 분리하고 결합된 핵산을 세척(washing) 및 용출(elution)을 통해 얻어내는 방법[Process for isolating nucleic acid (US patent 5,234,809)]이다.
그러나 이 방법은 실리카 막에 핵산을 결합시켜 불순물로부터 분리할 수 있으나, 핵산을 분리하는 거의 모든 단계에 원심분리 단계가 필수적이며, 이로 인하여 핵산 분리 과정이 복잡하고 실험실 수준에서만 수행되어야 하는 단점이 있다.
뿐만 아니라 기존의 통상의 상기 두 가지 형태의 완충액은 혼합되면 심하게 결정화가 됨으로써 혼합된 형태로 사용될 수 없으며, 이를 이용하여 용해된 세포 파쇄액은 실리카 막에 적용될 수 없으며, 초고속 핵산 추출 용액으로서 사용되기에 매우 부적합하다.
한편 이온 교환 크로마토그래피법을 이용하여 핵산을 분리하는 기술은 양이온 교환 수지에 음전하를 띠는 핵산을 결합시키고 불순물로부터 핵산을 분리하는 기술로, 원심분리를 이용한 핵산 분리가 필수적이며 숙련된 기술과 복잡한 단계로 인하여 현장 진단을 위한 핵산 분리에 적합하지 않다.
또한, 핵산이 포함된 시료로부터 카르복실기가 결합된 마그네틱 입자(magnetic particle)를 이용하여 핵산을 결합시킨 후, 불순물로부터 핵산을 분리하는 방법의 경우, 많은 양의 시료를 사용해야 하며 마그네틱 입자를 사용하는 복잡한 분리 단계와 원심분리 또는 자석을 이용하여 핵산이 결합된 마그네틱 입자를 분리하는 등의 복잡한 핵산 분리 단계로 인하여 유전자 현장진단(POCT, Point-of-Care Testing)을 위한 핵산 분리에 적합하지 못하다.
본 발명자들은 핵산을 함유하는 생체 시료에서 핵산을 효율적으로 분리해내기 위하여 지속적인 노력을 한 결과, 케오트로픽 염 및 사코시네이트(sarcosinate) 성분의 완충액이 세포 용해 및 용출된 핵산에 대한 실리카 막에 흡착력을 향상시켜 혈액 및 조직 시료 내 고순도의 핵산을 빠르고 간편하게 분리할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 종래의 핵산 분리방법 보다 소량의 시료로부터 특수한 장비를 사용하지 않고, 빠르고 간편하게 핵산을 분리하여 핵산 분리과정을 단순화함으로써 현장진단과 같은 신속한 진단을 위한 초고속 핵산 분리방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 페이퍼크로마토그래피법(paper chromatography)으로 고순도의 핵산을 생물학적 시료로부터 분리하는, 초고속 핵산의 정제방법을 제공한다.
본 발명에 따른 초고속 핵산의 정제방법은 실리카 막 상에 시료 내 핵산이 포함된 세포 파쇄액을 점적(spotting)한 후, 점적된 세포 파색액으로부터 실리카 막 상에 핵산의 흡착, 액체 이동상 완충액에 의한 오염물의 분리 및 핵산의 정제가 단계적으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 초고속 핵산의 정제방법은 순차적인 3가지 완충액 시스템을 이용하는 것으로, 보다 상세하게는 실리카 막을 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate), 소듐 라우릴 사르코시네이트(sodium lauryl sarcosinate)를 주성분으로 하는 세포 파쇄액, 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate)를 주성분으로 하는 이동상 완충액 및 알코올 성분의 핵산 세척 완충액에 순차적으로 담가 진행함으로써 고 순도의 핵산만을 용출시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 초고속 핵산의 정제방법은 상기 방법으로 수득되는 실리카 막 상에 집적된 핵산을 중합효소 연쇄반응에 직접 사용함으로써 POCT(Point-of-Care Testing) 분자 진단에 효율적으로 이용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 페이퍼크로마토그래피법(paper chromatography)으로 고순도의 핵산을 생물학적 시료로부터 분리하는, 초고속 핵산의 정제방법에 있어서,
1) 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 실리카 막(silica membrane)에 흡착시키는 단계;
2) 상기 핵산이 흡착된 실리카 막으로부터 페이퍼크로마토그래피법을 이용하여 오염물을 분리시키는 단계; 및
3) 상기 오염물이 분리된 실리카 막으로부터 완충용액을 이용하여 고순도의 핵산만을 용출 또는 실리카 막에 결합된 핵산을 직접 PCR, 역전사-PCR(RT-PCR), 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR로부터 선택되는 1종 이상에 적용하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 1) 단계는 세포 파쇄 완충액에 의해 파쇄된 세포로부터 용출된 핵산을 페이퍼크로마토그래피법으로 실리카 막에 흡착시키는 것을 특징으로 한다,
상기 본 발명의 생물학적 시료는 소량의 Na-EDTA 또는 헤파린으로 처리된 비응고 혈액(non-coagulating blood) 또는 조직 시료를 사용할 수 있으며, 실리카 막에 핵산이 잘 결합하는 성질 및 본 발명에 따른 완충액 이동상에 의해 특정한 장비 없이도 핵산으로부터 불순물을 제거하여 초고속으로 고순도의 핵산을 분리할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 파쇄 완충액은 조직 세포를 효과적으로 용해(lysis)하여 파쇄된 세포로부터 DNA를 용출하기 위한 완충액으로 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate), 소듐 라우릴 사르코시네이트(sodium lauryl sarcosinate)를 주성분으로 하고, RNA를 용출하기 위한 완충액의 경우 항산화 화학 물질, 보다 바람직하게는 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 또는 디티오트레이 톨(Dithiothreitol)을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2) 단계는 핵산이 흡착된 실리카 막을 이동상 완충액으로 일차 용출시켜 오염물을 분리시키는 것으로, 상기 이동상 완충액은 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate)를 주성분으로 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 2) 단계 후 진행되는 3) 단계는 2) 단계의 오염물이 분리된 실리카 막을 핵산 세척 완충액으로 이차 전개시킴으로써 세포 파쇄 완충액과 2) 단계의 이동상 완충액에 포함된 고농도의 염을 제거하여 고순도의 핵산이 정제할 수 있다.
보다 상세하게는 고순도의 핵산을 수득하기 위하여, 조직 세포로부터 효과적으로 핵산을 용출하고, 실리카 막 상에 핵산을 효율적으로 결합시키며 핵산과 혼합된 불순물을 효과적으로 제거하고, 핵산의 순도를 높이기 위하여 세척하는 단계가 필요하다.
본 발명에 따른 정제방법은 실리카 막을 이용한 페이퍼 크로마토그래피법으로 실리카 막에 흡착된 핵산을 고순도의 핵산으로 분리하는 것으로, 상기 단계적인 페이퍼 전개는 액체 이동상의 완충액에 의하여 실리카 막 상에 핵산의 흡착, 오염물의 분리 및 핵산의 정제가 단계적으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는 본 발명에 사용되는 순차적인 3가지 완충액 시스템을 통하여 생물학적 시료로부터 고순도의 핵산을 단계적으로 분리할 수 있는 것으로 첫 번째 단계로, 세포 파쇄 완충액을 이용하여 조직 세포의 효과적인 파쇄 및 이로부터 핵산을 효율적으로 용출시켜 실리카 막 상에 결합시킬 수 있다. 상기 세포 파쇄 완충액은 소듐 라우릴 사르코시네이트(sodium lauryl sarcosinate)를 포함하고 있어 조직 세포를 효과적으로 용해시켜 핵산의 용출을 용이하게 하며, 또한 고농도의 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate)를 포함하고 있어서 용출된 핵산이 실리카 막에 효과적으로 결합할 수 있게 해준다.
두 번째 단계로, 고농도의 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate)가 포함된 이동상 완충액을 이용하여 실리카 막에 결합된 핵산으로부터 수용성의 단백질 및 기타 불순물을 이동상에 의한 크로마토그래피법을 통해 효과적으로 제거하면서 동시에 핵산의 실리카 막에 대한 결합력을 높일 수 있다. 상기 이동상 완충액은 고농도의 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate)가 포함된 핵산 결합 완충액(Binding Buffer)을 사용한다.
마지막으로, 핵산의 순도를 높이고 지질 성분의 불순물을 제거하기 위하여 에탄올 성분의 핵산 세척 완충액(Washing buffer)을 이동상으로 사용하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명에 따른 페이퍼크로마토그래피법 및 기존의 원심분리를 이용한 스핀 컬럼(spin column) 방식을 이용하여 혈액으로부터 핵산을 분리 한 후, 역전사 중합효소 연쇄반응 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 목적 유전자의 증폭능을 확인하였다.
그 결과, 종래의 핵산 분리 방법보다 소량의 시료로부터 특수한 장비를 사용하지 않고 빠르고 간편하게 핵산을 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 초고속 핵산의 분리방법은 질병원의 진단이나 목적하는 유전자의 검출을 위하여 매우 유용한 방법으로, 복잡하고 특수한 장비를 사용해야 하는 기존 핵산 분리 방법과 비교하여 신속하고 간편하게 질병원의 분자 진단에 사용될 수 있으며, 특히 현장 진단(POCT)을 위한 최적의 핵산 분리방법으로 사용될 수 있는 장점이 있다.
또한 본 발명에 따른 초고속 핵산의 분리방법은 숙련된 기술이 요구되지 않기 때문에 일반인들이 직접 질병원의 분석을 위한 핵산 분리가 가능하여, 병, 의원 또는 검진 센터의 방문을 통해서만 질병원 검진을 위한 핵산 분리가 가능한 기존의 번거로움을 해결해줄 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 실리카 막으로 분리한 DNA의 분리 여부를 전기영동으로 확인한 결과이고,
도 2는 본 발명의 세포 파쇄 완충액에 Proteinase K 첨가 여부에 따른 초고속 DNA 분리 방법의 비교 모식도를 보여주는 것이며,
도 3은 상기 도 2의 방법에 따라 초고속 핵산의 정제방법으로 분리한 DNA를 전기영동을 통해 확인한 사진이고,
도 4는 상기 도 3에서 확인된 초고속 핵산의 정제방법으로 분리한 DNA로부터 목적 DNA에 대한 중합효소 연쇄반응 분석 결과를 보여주는 것이며,
도 5는 본 발명에 따른 변형된 세포 파쇄 완충액을 이용하여 전체 핵산의 분리 여부를 전기영동으로 확인한 결과이고,
도 6은 본 발명에 따른 초고속 핵산의 정제방법으로 분리한 전체 핵산으로부터 목적 RNA에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응 분석 결과를 보여주는 것이며,
도 7은 본 발명에 따른 초고속 핵산의 정제방법으로 분리한 전체 핵산으로부터 목적 RNA에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 분석 결과를 보여주는 것이고,
도 8은 본 발명에 따른 초고속 핵산의 정제방법에 대한 모식도 및 분석 방법에 대한 개략도를 보여주는 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1] 실리카 막(silica membrane)을 이용한 핵산 분리 여부 확인
비응고 혈액 시료로부터 세포 파쇄 완충액(Cell Lysis Buffer)으로 핵산을 추출 후, silica membrane에 핵산의 결합 및 분리가 가능한 지 여부를 테스트 하였다.
핵산 분리의 재료로 소량의 Na-EDTA 또는 헤파린으로 처리된 사람의 비응고 혈액(non-coagulating blood) 시료를 사용하였다. 25 ㎕ 또는 50 ㎕의 혈액 시료를 각각 서로 다른 하기 표 1의 조성을 가진 3 가지 세포 파쇄 완충액(A, B, C) 500 ㎕에 넣고 혼합하여 물리적인 힘을 가하여 강하게 섞어(vortexing)주었다. 각 세포 파쇄액에 파쇄액 0.6배의 부피비로 이소프로파놀(2-propanol)을 혼합한 후, 실리카 막(가로 0.5 cm× 세로 0.5 cm)을 세포 파쇄액에 담가 두었다. 이 후, 실리카 막을 80% 에틸 알코올로 세척 후 건조하고, 실리카 막을 100 ㎕의 TE 완충액 (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA)이 담긴 튜브에서 실리카 막에 결합된 핵산을 용출(elution)하였다. 이 방법에 의해서 분리된 핵산의 분리 여부와 양을 확인하기 위하여 남아 있는 세포 파쇄액으로부터 기존의 원심분리를 이용한 스핀 컬럼(spin column) 방식으로 핵산을 추출하여 비교 분석하였다. 이 분석은 1% 아가로스 겔(agarose gel)상에서 전기영동을 통하여 확인하였다.
Figure 112011036304103-pat00001
그 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 세포 파쇄 완충액으로부터 용출된 핵산이 실리카 막에 잘 결합하고 분리됨을 확인할 수 있었고, 더군다나 기존의 원심분리를 이용한 스핀 컬럼(spin column) 방식으로 추출한 핵산 보다 많은 양의 핵산을 추출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 2] 페이퍼 크로마토그래피법을 적용한 초고속 DNA 의 분리
(1) 초고속 DNA 의 분리
상기 실시예 1의 실험을 통해 비응고 혈액 시료로부터 용출된 핵산이 실리카 막(silica membrane)에 잘 결합하고 분리될 수 있음을 확인하였다. 또한 3 가지의 세포 파쇄 완충액 중에서 DNA 성분의 핵산을 분리하는데 sodium citrate가 포함된 여부와는 상관없이 모든 완충액에서 핵산 추출 및 실리카 막에 흡착을 통한 용출이 가능하기 때문에 테스트한 3 가지 세포 파쇄 완충액 중에서 pH 7.0의 완충액 A를 선택하고, 상기 결과를 토대로 초고속 핵산 분리를 위하여 페이퍼 크로마토그래피법을 적용하여 핵산의 분리 여부 확인 및 목적 DNA의 PCR 증폭 확인 여부를 테스트 하였다.
일반적으로 조직 세포로부터 핵산을 분리하기 위하여 불순물을 제거하는 과정이 매우 중요하다. 특히, 조직 세포의 파쇄로 인하여 생성된 단백질 성분의 불순물을 제거하는 것은 고순도의 핵산을 분리하는데 매우 중요하다. 이를 위하여 많은 핵산 분리 방법에서 효과적인 단백질 제거를 위하여 핵산 분리용 완충액에 단백질 분해 효소를 적용한다. 단백질 분해 효소의 적용은 단백질 성분의 불순물을 제거하는데는 효과적이나 혈액 시료와 같은 특정 조직 시료에서는 이 효소를 적용하지 않고 고순도의 핵산을 분리할 수 있다. 이에 실시예 2에서 확인된 완충액 B에서 단백질 분해 효소인 Proteinase K를 적용한 세포 파쇄 완충액(A-1)과 적용하지 않은 세포 파쇄 완충액(A-2)를 이용하여 페이퍼크로마토그래피법을 적용한 핵산 분리 여부를 테스트하였다.
이를 위하여 25 ㎕의 하기 표 2의 조성을 가진 세포 파쇄 완충액(A-1, A-2)이 들어있는 튜브에 5 ㎕의 비응고 혈액 시료를 첨가하고 혼합 후 물리적인 힘을 가하여 강하게 섞어(vortexing)주었다. 그 다음 세포 파쇄액에 파쇄액의 0.6배 부피비에 해당하는 이소프로파놀(isoproanol)을 첨가하고 혼합하여 세포 파쇄액(lysate)을 준비하였다.
Figure 112011036304103-pat00002
상기 세포 파쇄액에 용출된 핵산을 실리카 막에 결합시켜 페이퍼크로마토그래피법에 의한 이동상 용액의 전개를 통해 불순물을 제거시키는 방법으로 핵산을 분리하기 위하여 도 2에서 제시한 방법으로 핵산 분리를 테스트하였다. 이를 위하여 상기 세포 파쇄액을 실리카 막(가로 0.5 cm× 세로 10 cm)의 밑 부분에서 0.5 cm 부분을 담그고, 용출된 핵산을 결합시켰다. 세포 파쇄액에 담가졌던 실리카 막의 끝 부분을 100 ㎕의 첫 번째 이동상 완충액인 하기 표 3의 조성을 가진 핵산결합 완충액(Binding buffer)이 들어있는 튜브에 담근 후, 실리카 막에 결합된 핵산은 그대로 유지하면서 불순물을 이동상 용액으로 페이퍼 크로마토그래피법에 의하여 분리 후 제거하였다.
Figure 112011036304103-pat00003
다음으로, 두 번째 이동상 완충액인 핵산 세척 완충액(washing buffer) 400 ㎕(80% ethanol)이 들어있는 튜브에 실리카 막의 끝 부분을 담그고, 불순물을 추가로 제거하고 핵산을 세척(washing)하였다. 그리고 세포 파쇄액에 담가졌던 실리카 막의 일부분에서 직경 2 mm 크기의 조각을 펀칭을 통해 분리 후 목적 DNA의 PCR 검출 테스트를 하였으며, 나머지 부분은 100 ul의 DNA 용출 완충액(elution buffer)인 TE 완충액에 담가 DNA를 녹여내어 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 DNA의 분리 여부를 확인하였다
그 결과 도 3에서도 확인할 수 있듯이, 두 가지의 세포 파쇄 완충액, A-1과 A-2에서 단백질 분해효소인 proteinase K의 적용 여부에 상관없이 효율적으로 핵산이 추출됨을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 페이퍼크로마토그래피법을 이용한 초고속 핵산 분리 방법에 있어 단백질 분해 효소를 처리하는 과정은 핵산을 분리하는데 사용되는 조직 시료에 따라 적용될 수 있음을 보여주는 결과이기도 하다.
(2) DNA 로부터 목적 DNA 의 PCR 검출
상기 실시예 2의 (1)의 방법으로 실리카 막에 결합된 상태로 분리된 DNA로부터 목적 DNA를 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 검출(detection) 가능 여부를 확인하였다.
이를 위하여 사람의 염색체 DNA 염기서열 상에서 베타 글로불린(beta-globin) 유전자 부위로부터 디자인된 프라이머 세트, 각각 10 pmoles의 정방향 프라이머(Forward primer) 5'-GGGATGATAGTCTGACTTTCCTAACCT-3'와 역방향 프라이머 (Reverse primer) 5'-GCCTTCAGTCATGCCTAGGCCTGCA-3' 및 1.25 units의 HelixAmpTM Taq DNA polymerase, 최종 농도 2.5 mM의 MgCl2 , 0.25 mM dNTP mix가 포함된 반응 완충액(Reaction buffer)을 이용하여 페이퍼 크로마토그래피법에 의해 분리된 DNA가 결합되어 있는 부분에서 직경 2 mm 크기의 실리카 막을 취해서 PCR 검출 반응을 수행하였다. PCR 반응은 95 ℃, 20 초/68℃ 1 분 (35 cycles) 조건으로 50 ul 반응액 부피(reaction volume)에서 수행되었고, PCR 반응 후에 10 ul의 PCR 산물이 1% agarose gel에서 전기영동을 통해 분석되었다.
도 4에서도 확인할 수 있듯이, PCR 반응 결과 DNA가 결합되어 있는 실리카 막으로부터 목적으로 하는 550 bp 크기의 베타 글로불린 DNA 부분이 검출됨을 통해 상기 실시예 2의 핵산의 정제방법이 고순도의 핵산을 생물학적 시료로부터 빠르고 간편하게 분리하여 PCR 법을 이용한 다양한 핵산 분석에 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 3] 페이퍼크로마토그래피법을 활용하여 혈액 시료로부터 전체 핵산의 분리.
(1) 혈액 시료로부터 전체 핵산의 분리
질병원 진단 및 분자적 검출은 질병원의 DNA 뿐만 아니라 RNA로부터 실행될 수 있다. 이것은 거의 모든 분자적 진단에 매우 중요하다. 그래서 상기 실시예 2의 방법으로 분리된 DNA와 RNA를 모두 포함하는 전체 핵산의 분리를 테스트하고 분리된 전체 핵산으로부터 목적 RNA에 대한 RT-PCR 검출을 테스트 하였다. 일반적으로 조직 시료로부터 핵산을 분리하는 과정에서, 특히 RNA를 분리하는 과정에서 RNA 분해 효소(RNase)의 오염으로 인한 RNA의 분해가 목적 RNA의 검출을 어렵게 하며, 유전자 현장 진단에서 더욱 심각한 문제를 야기할 수 있다. 이러한 핵산 분리 과정에서 RNA 분해 효소의 오염을 방지하고 효과적으로 DNA 및 RNA를 분리하기 위하여 2-메르캅토에탄올과 Dithiothreitol과 같은 항산화 화학 물질(antioxidant chemical)이 사용되는데 이 화학 물질들은 RNA 분해 효소 분자내의 이황화 결합(disulfide bond)를 끊어 RNA 분해능을 불활성화 시키는 것으로 알려져 있다.
본 실시예에서는 DNA와 RNA를 포함하는 전체 핵산을 페이퍼크로마토그래피법을 적용하여 초고속으로 핵산을 분리하기 위하여 실시예 2의 (1)의 세포 파쇄 완충액 A-2에 대하여 항산화 화학 물질인 2-메르캅토에탄올을 적용하여 DNA 및 RNA를 포함하는 전체 핵산 분리 여부를 테스트하였다. 전체 핵산의 페이퍼크로마토그래피법을 통한 분리를 확인하기 위하여, 하기 표 4에 나타낸 실시예 2의(1)에서 제시된 세포 파쇄 완충액 A-2 (완충액 A-2)와 2-메르캅토에탄올을 적용한 변형된 세포 파쇄 완충액(변형된 완충액 A-2)을 이용하여, 기존의 원심분리를 이용한 스핀 컬럼(spin column) 방식의 핵산 분리 방법으로 혈액으로부터 DNA 및 RNA 모두 분리되는지 여부를 확인하였다.
Figure 112011036304103-pat00004
도 5에서 변형된 세포 파쇄 완충액(변형된 완충액 A-2)에서는 DNA 및 RNA 가 모두 분리된 반면에 2-메르캅토에탄올이 포함되지 않은 실시예 2에서의 세포 파쇄 완충액(완충액 A-2)은 DNA만이 분리되는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과를 바탕으로 변형된 세포 파쇄 완충액(변형된 완충액 A-2)을 사용하여 상기 실시예 2의 방법을 변형하여 전체 핵산을 초고속 페이퍼크로마토그래피법을 이용하여 분리하였다. 실시예 2의 핵산 분리 과정에서 세포 파쇄액에 담가 둔 실리카 막 부분은 1, 2차 이동상 완충액으로 전개 시키는 과정에서 일부 불순물이 완전히 제거되지 않는 단점이 확인되었다.
이번 테스트에서는 이 문제점을 극복하기 위하여 도 8에서 보는 바와 같이 실리카 막(가로 0.5 cm×세로 10 cm)의 끝에서 1 cm 윗 부분에 세포 파쇄액을 점적하고 이동상 완충액에는 실리카 막 끝부분의 0.5 cm 부분만을 적셔서 시료가 세포 파쇄액 점적된 부분의 불순물이 더욱 효과적으로 전개되어 제거될 수 있도록 실시하였으며, 나머지 핵산 분리 과정은 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
상기의 결과는 본 발명의 변형된 세포 파쇄 완충액(변형된 완충액 A-2)가 상기 실시예 2의 초고속 핵산의 분리 및 정제방법에 있어서, 효율적으로 전체 핵산을 분리할 뿐 아니라 목적하는 RNA(Target RNA) 역시 확인 가능함을 보여주는 결과이기도 하다.
(2) 전체 핵산으로부터 목적 RNA의 RT-PCR 검출
상기 실시예 3의 (1)의 방법으로 실리카 막에 결합된 상태로 분리된 전체 핵산으로부터 목적 RNA(target RNA)를 역전사 효소-중합효소 연쇄 반응(Reverase transcriptase-PCR, RT-PCR)을 통해 검출(detection) 가능 여부를 확인하였다.
이를 위하여 사람의 베타-글로불린(beta-globin) 유전자에 대한 전사체 염기서열(transcript sequence)로부터 디자인된 프라이머 세트, 각각 10 pmoles의 정방향 프라이머(Forward primer) 5'-CAAGGTGAACGTGGATGAAG-3'와 역방향 프라이머 (Reverse primer) 5'-GGCAGAATCCAGATGCTCAA-3' 및 1.25 units의 HelixAmpTM Hot-Taq DNA polymerase (Nanohelix, 한국)와 25 units의 HelixCriptTM Thermo Reverse transcriptase(Nanohelix, 한국), 최종 농도 2.5 mM의 MgCl2, 0.25 mM dNTP mix가 포함된 반응 완충액(Reaction buffer)를 이용하여, 50℃ (40분), 1 cycle/95℃(15분), 1 cycle/95℃(20초)-55℃(40초)-72℃(1분), 35 cycles 조건으로, 상기 실시예 3의 (1)의 방법으로 실리카 막에 결합된 상태로 분리된 전체 핵산 부분에서 직경 2 mm 크기의 실리카 막을 취해서 목적 RNA의 RT-PCR 검출 반응을 수행하였다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, RT-PCR 결과 전체 핵산이 결합되어 있는 실리카 막으로부터 400 bp 크기의 베타-글로불린(beta-globin) RNA 전사체를 검출할 수 있었고, 목적 RNA의 검출은 전체 세포 파쇄액(lysate)중에서 5 ㎕만 점적한(spotting) 실리카 막에서도 확인을 할 수가 있었다.
상기의 결과로부터 본 발명의 초고속 핵산의 분리방법은 종래의 핵산 분리 방법보다 소량의 시료로부터 특수한 장비를 사용하지 않고 빠르고 간편하게 핵산을 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다.
(3) 전체 핵산의 실시간 PCR 증폭 확인
최근의 분자 진단은 중합효소 연쇄반응(PCR) 및 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)과 함께 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)이 목적 DNA 또는 RNA의 검출에 사용된다.
본 발명에서는 페이퍼크로마토그래피 방법으로 분리되어 실리카 막에 결합된 핵산으로부터 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 통하여 목적 RNA의 검출 가능성을 테스트 하였다. 사람의 베타-글로불린(beta-globin) 유전자에 대한 전사체 염기서열(transcript sequence) 로부터 디자인된 프라이머 세트, 정방향 프라이머(Forward primer) 5'-CAAGGTGAACGTGGATGAAG-3'와 역방향 프라이머 (Reverse primer) 5'-ATTAGCCACACCAGCCACCAC-3'를 이용하여, 상기 실시예 3의 (1)의 방법으로 실리카 막에 결합된 상태로 분리된 전체 핵산 부분에서 직경 2 mm 크기의 실리카 막을 취해서 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응에 사용하였다.
실시간 역전사 중합효소 연쇄반응은 25 units HelixCriptTM Thermo Reverse Transcriptase 및 1.25 units HelixAmpTM Hot-Taq DNA polymerase와 0.25 mM dNTP mix, SYBR Green 형광 시약이 포함된 반응 완충액, 그리고 베타-글로불린(beta-globin) 유전자의 전사체 염기서열로부터 디자인된 각각 10 pmoles의 프라이머를 이용하여 50℃ (40분), 1 cycle/95℃(15분), 1 cycle/95℃(20초)-55℃(40초)-72℃(1분), 35 cycles 조건으로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
실시간 목적 DNA의 증폭 여부는 SYBR Green 형광 시약을 이용하여 Rotor-Spin 방식의 Qiagen RotorGene Q와 Thermo Block 방식의 ABI7900HT 실시간 정량 PCR 분석기를 이용하여 분석되었다.
도 7에서도 확인할 수 있듯이, 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응 결과 전체 핵산이 결합되어 있는 실리카 막으로부터 350 bp 크기의 베타 글로불린(beta-globin) RNA 전사체를 검출할 수 있었고, 두 가지 type의 실시간 정량 PCR 분석기에서 모두 본 발명에 따른 초고속 핵산의 분리방법으로 분리된 핵산을 이용한 분석이 가능함을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 페이퍼크로마토그래피법(paper chromatography)으로 고순도의 핵산을 생물학적 시료로부터 분리하는, 초고속 핵산의 정제방법에 있어서,
    1) 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 실리카 막(silica membrane)에 흡착시키는 단계;
    2) 상기 핵산이 흡착된 실리카 막으로부터 페이퍼크로마토그래피법을 이용하여 오염물을 분리시키는 단계; 및
    3) 상기 오염물이 분리된 실리카 막으로부터 완충용액을 이용하여 고순도의 핵산만을 용출 또는 실리카 막에 결합된 핵산을 직접 PCR, 역전사-PCR(RT-PCR), 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR로부터 선택되는 1종 이상에 적용하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 1) 단계는 세포 파쇄 완충액에 의해 용해된 핵산을 페이퍼크로마토그래피법으로 실리카 막에 흡착시키는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 세포 파쇄 완충액은 케오트로픽 염 및 사코시네이트(sarcosinate)를 주성분으로 하는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 세포 파쇄 완충액은 계면활성제, 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate), 소듐 라우릴 사르코시네이트(sodium lauryl sarcosinate)를 주성분으로 하는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 2) 단계는 핵산이 흡착된 실리카 막을 이동상 완충액으로 일차 전개시켜 오염물을 분리시키는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 이동상 완충액은 구아니딘 티오시안네이트(Guanidine thiocyanate)를 주성분으로 하는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 3) 단계는 2) 단계의 오염물이 분리된 실리카 막을 핵산 세척 완충액으로 이차 전개시킴으로써 고순도의 핵산이 정제되는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 정제방법은 실리카 막을 이용한 단계적 페이퍼 크로마토그래픽 전개 분리방법으로 실리카 막에 흡착된 핵산을 고순도의 핵산으로 분리 후 정제하는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 단계적 페이퍼 크로마토그래픽 전개 분리방법은 완충액의 액체 이동상에 의하여 실리카 막 상에 핵산의 흡착, 오염물의 분리 및 핵산의 정제가 단계적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101717181B1 (ko) 2015-09-30 2017-03-17 주식회사 디앤피바이오텍 뇌수막염 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용
KR101717192B1 (ko) 2015-09-30 2017-03-17 주식회사 디앤피바이오텍 패혈증 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용
KR20170038995A (ko) 2015-09-30 2017-04-10 주식회사 디앤피바이오텍 결핵 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용
KR20200138505A (ko) 2019-05-30 2020-12-10 주식회사 위즈바이오솔루션 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법
KR20210144999A (ko) 2020-05-22 2021-12-01 주식회사 위즈바이오솔루션 주사기형 핵산추출장치, 핵산추출키트 및 이를 이용한 핵산추출방법

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103173432B (zh) 2011-12-22 2020-08-04 通用电气公司 分离核酸的方法及装置
WO2015195949A2 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, and devices for rapid analysis of biological markers
CN108026570A (zh) * 2015-09-11 2018-05-11 康宁股份有限公司 从血液样品中纯化核酸的组合物和方法
US11401558B2 (en) 2015-12-18 2022-08-02 Clear Gene, Inc. Methods, compositions, kits and devices for rapid analysis of biological markers
CN107312771A (zh) * 2017-01-11 2017-11-03 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种高效抽提血清和血浆游离dna的方法
CN112899132B (zh) * 2021-01-13 2021-10-15 上海金鑫生物科技有限公司 一种用于核酸提取与纯化的硅胶过滤吸头
CN113604464A (zh) * 2021-07-30 2021-11-05 中国科学院合肥物质科学研究院 一种用于微量复杂性物证检材dna提取纯化的试剂盒与提取方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8900725A (nl) * 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
DE4139664A1 (de) * 1991-12-02 1993-06-03 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren
DE19856064C2 (de) * 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
WO2005026347A1 (en) * 2003-09-09 2005-03-24 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method for isolating and purifying a nucleic acid
US7638309B2 (en) * 2003-12-03 2009-12-29 Council Of Science And Industrial Research Method for detecting pathogenic mycobacteria in clinical specimens
US8586350B2 (en) * 2004-02-12 2013-11-19 Gl Sciences Incorporated Mechanism of separating and purifying DNA and the like
AU2005200670B2 (en) * 2004-02-20 2007-05-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Adsorption of nucleic acids to a solid phase
US20080026451A1 (en) * 2006-06-15 2008-01-31 Braman Jeffrey C System for isolating biomolecules from a sample
JP5060113B2 (ja) * 2006-12-04 2012-10-31 学校法人北里研究所 クロマトグラフィー用展開溶媒、クロマトグラフィー法、及びクロマトグラム、並びに検出方法
WO2009152291A1 (en) * 2008-06-11 2009-12-17 Argonide Corporation Chromatrography device with a stationary phase including a nano alumina medium
US9012208B2 (en) * 2009-02-03 2015-04-21 Netbio, Inc. Nucleic acid purification
US8039613B2 (en) * 2009-08-28 2011-10-18 Promega Corporation Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochem. J. Vol.52(4), pp.594-599 (Dec. 1952).
Biochemical Journal. Vol.123(4), pp.613-617 (July 1971).
J. Biol. Cheml. Vol.175(1), pp.315-332 (August 1948).

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101717181B1 (ko) 2015-09-30 2017-03-17 주식회사 디앤피바이오텍 뇌수막염 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용
KR101717192B1 (ko) 2015-09-30 2017-03-17 주식회사 디앤피바이오텍 패혈증 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용
KR20170038995A (ko) 2015-09-30 2017-04-10 주식회사 디앤피바이오텍 결핵 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용
KR20200138505A (ko) 2019-05-30 2020-12-10 주식회사 위즈바이오솔루션 양이온성 폴리머를 이용한 핵산추출장치 및 추출방법
KR20210144999A (ko) 2020-05-22 2021-12-01 주식회사 위즈바이오솔루션 주사기형 핵산추출장치, 핵산추출키트 및 이를 이용한 핵산추출방법

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