WO2012157831A1 - 초고속 핵산의 정제방법 - Google Patents

초고속 핵산의 정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초고속 핵산의 정제방법에 관한 것으로,상기 본 발명에 따른 초고속 핵산의 분리방법은 질병원의 진단이나 목적하는 유전자의 검출을 위하여 매우 유용한 방법으로，복잡하고 특수한 장비를 사용해야 하는 기존 핵산 분리 방법과 비교하여 신속하고 간편하게 질병원의 분자 진단에 사용될 수 있으며，숙련된 기술이 요구되지 않기 때문에 일반인들이 직접 질병원의 분석을 위한 핵산 분리가 가능하고, 더 나아가 병,의원또는 검진 센터의 방문을 통해서만 가능한 기존의 번거로움을 해결해 줄 수 있고 보다 더 신속하게 질병원을 분석할 수 있는 장점이 있다.

Description

명세서
발명의명칭:초고속핵산의정제방법 기술분야
[1] 본발명은초고속핵산의정제방법으로,보다상세하게는실리카막 (silica membrane)과케오트로픽염및사코시네이트 (sarcosinate)성분의완층액을 이용한초고속핵산의정제방법에관한것이다.
배경기술
[2] 핵산이포함된시료에서부터핵산을정제하기위해서는물리적및 /또는
화학적인정제과정을거쳐야한다.일반적으로，핵산을정제하기위한과정에 있어서，입자의크기가큰고형성분을용액상에서제거하는단계가필요한 경우가많다.
[3] 특히,생체시료를용해하여핵산을얻고자할경우세포에함유된각종단백질 성물을포함한불순물둥이제거될필요가있는데，일반적으로사용되는방법은 원심분리를이용한침전법을통해제거하거나，필터에의해여과하여제거하는 방법이있다.전자의방법은실험실에서흔히사용되고있으나대량의시료를 처리하는데는부적합하고자동화하기가곤란하다.반면에，후자의방법은감압 또는가압장치가부착된자동화기기에적용시켜대량의시료를연속적으로 처리하기에적합하다.
[4] 형질전환된대장균또는박테리아세포에서플라스미드만을추출하는과정에 있어서，염색체 DNA를분리해야하는데，이는유전자증폭，염기서열분석， 유전자재조합과정등에서염색체 DNA에의해원하지않는반응이진행되는 것을막아야하기때문이다.
[5] 조직시료로부터핵산을분리하는방법은크게 2가지의단계로나누어진다.첫 번째과정은조직세포를용해해서모든핵산을포함한모든세포구성물들을 용출시키는과정이다.이세포의용해과정은물리적인혹은화학적인방법에 의해서이루어질수있다.그러나핵산의분리를위하여핵산의손상을 최소화하고조직세포를효과적으로용해하기위하여화학적인방법이널리 사용되며,특히도데실황산나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)과같은 음이온성계면활성제가주로이용된다.
[6] 두번째과정은세포파쇄액으로부터불순물올제거하고순수한핵산을
분리하는과정이다.이런핵산을추출하는방법은주로페놀-클로로포름과같은 유기용매의처리，염석,케오트로픽염둥을사용한다ᅳ
[7] 상기두가지의과정을통해조직세포로부터핵산을분리하는방법이널리 사용되고있기때문에기존의핵산분리방법들은조직세포로부터핵산의 용출을용이하게하기위하여계면활성제가포함된세포파쇄액을첫번째핵산 추출용완충액으로사용한다.핵산분리과정에서두번째로중요한완층액은 케오트로픽염과같은고농도의염이포함된완층액을사용하는것이다.이런 고농도의염이포함된완층액은염석을통해핵산으로부터불순물을
제거하는데매우중요한역할을한다.
[8] 고순도의핵산올분리하기위하여상기두가지형태의완층액은단계적으로 조직세포에적용되어세포용해및염석을통한불순물제거에사용된다.특히, 도데실황산나트륨이포함된세포파쇄액으로용해된세포파쇄액은고농도의 염이포함된완층액과흔합된후염석을통한블순물의침전을용이하게해주며 이것은고순도의핵산분리에매우증요하며，기존핵산분리방법에서효과적인 세포용해를위한세포파쇄완층액에가장널리사용된다.
[9] 최근에는알려진핵산분리기술들은실리카막 (silica membrane)또는이온 교환크로마토그래피법을이용하여세포파쇄액 (lysate)으로부터핵산을 분리하는데사용한다.특히,현재가장널리사용되고있는방법은실리카막에 핵산을결합시켜다른불순물로부터핵산을분리하고결합된핵산을
세척 (washing)및용출 (elution)을통해얻어내는방법 [Process for isolating nucleic acid (US patent 5,234,809)]이다.
[10] 그러나이방법은실리카막에핵산을결합시켜불순물로부터분리할수
있으나，핵산을분리하는거의모든단계에원심분리단계가필수적이며，이로 인하여핵산분리과정이복잡하고실험실수준에서만수행되어야하는단점이 있다.
[11] 뿐만아니라기존의통상의상기두가지형태의완충액은흔합되면심하게 결정화가됨으로써혼합된형태로사용될수없으며，이를이용하여용해된세포 파쇄액은실리카막에적용될수없으며，초고속핵산추출용액으로서 사용되기에매우부적합하다.
[12] 한편이온교환크로마토그래피법을이용하여핵산을분리하는기술은양이온 교환수지에음전하를띠는핵산을결합시키고불순물로부터핵산을분리하는 기술로,원심분리를이용한핵산분리가필수적이며숙련된기술과복잡한 단계로인하여현장진단을위한핵산분리에적합하지않다.
[13] 또한，핵산이포함된시료로부터카르복실기가결합된마그네틱입자 (magnetic particle)를이용하여핵산을결합시킨후,불순물로부터핵산을분리하는방법의 경우，많은양의시료를사용해야하며마그네틱입자를사용하는복잡한분리 단계와원심분리또는자석을이용하여핵산이결합된마그네틱입자를 분리하는등의복잡한핵산분리단계로인하여유전자현장진단 (POCT, Point-of-Care Testing)을위한핵산분리에적합하지못하다.
발명의상세한설명
기술적과제
[14] 본발명자들은핵산을함유하는생체시료에서핵산을효율적으로분리해내기 위하여지속적인노력을한결과,케오트로픽염및사코시네이트 (sarcosinate) 성분의 완층액 이 세포 용해 및 용출된 핵산에 대한 실리카 막에 흡착력을 향상시켜 혈액 및 조직 시료 내 고순도의 핵산을 빠르고 간편하게 분리할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
[15] 본 발명 의 목적은 종래의 핵산 분리방법 보다 소량의 시료로부터 특수한 장비를 사용하지 않고，빠르고 간편하게 핵산을 분리하여 핵산 분리과정을 단순화함으로써 현장진단과 같은 신속한 진단을 위 한 초고속 핵산 분리방법을 제공하고자 한다.
과제 해결 수단
[16] 상기 목적을 달성하기 위하여，본 발명은 페이퍼크로마토그래피 법 (paper chromatography)으로 고순도의 핵산을 생물학적 시료로부터 분리하는，초고속 핵산의 정 제방법을 제공한다.
[17] 본 발명에 따른 초고속 핵산의 정 제방법은 실리카 막 상에 시료 내 핵산이 포함된 세포 파쇄 액을 점 적 (spotting)한 후, 점 적 된 세포 파색 액으로부터 실리카 막 상에 핵산의 흡착，액체 이동상 완층액에 의 한 오염물의 분리 및 핵산의 정제가 단계적으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
[18] 본 발명 에 따른 초고속 핵산의 정제방법은 순차적 인 3가지 완층액 시스템을 이용하는 것으로，보다 상세하게는 실리카 막을 구아니 딘
티오시 안네이트 (Guanidine thiocyanate), 소듐 라우릴 사르코시 네이트 (sodium lauryl sarcosinate)를 주성분으로 하는 세포 파쇄 액, 구아니 딘
티오시 안네이트 (Guanidine thiocyanate)를 주성분으로 하는 이동상 완충액 및 알코올 성분의 핵산 세척 완층액에 순차적으로 담가 진행함으로써 고 순도의 핵산만을 용출시 키는 것을 특징으로 한다.
[19] 본 발명 에 따른 초고속 핵산의 정제방법은 상기 방법으로 수득되는 실리카 막 상에 집적된 핵산을 증합효소 연쇄반웅에 직접 사용함으로써
POCT(Point-of-Care Testing) 분자 진단에 효율적으로 이용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
[20] 이하, 본 발명을 상세히 설명 한다.
[21] 본 발명은 페 이퍼크로마토그래피 법 (paper chromatography)으로 고순도의 핵산을 생물학적 시료로부터 분리하는，초고속 핵산의 정제방법에 있어서，
[22] 1) 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 실리카 막 (silica membrane)에
흡착시키는 단계 ;
[23] 2) 상기 핵산이 흡착된 실리카 막으로부터 페이 퍼크로마토그래피 법올
이용하여 오염물을 분리시 키는 단계 ; 및
[24] 3) 상기 오염물이 분리된 실리카 막으로부터 완층용액을 이용하여 고순도의 핵산만을 용출 또는 실리카 막에 결합된 핵산을 직접 PCR,
역 전사 -PCR(RT-PCR), 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR로부터 선택되는 1종 이상에 적용하는 단계 ; [25] 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법을 제공한다.
[26] 본 발명에 있어서，상기 1) 단계는 세포 파쇄 완층액에 의해 파쇄된 세포로부터 용출된 핵산을 페이퍼크로마토그래피 법으로 실리카 막에 흡착시키는 것을 특징으로 한다，
[27] 상기 본 발명 의 생물학적 시료는 소량의 Na-EDTA 또는 헤파린으로 처 리 된 비웅고 혈액 (non-coagulating blood) 또는 조직 시료를 사용할 수 있으며，실리카 막에 핵산이 잘 결합하는 성 질 및 본 발명에 따른 완충액 이동상에 의해 특정 한 장비 없이도 핵산으로부터 불순물을 제거하여 초고속으로 고순도의 핵산을 분리할 수 있는 것을 특징으로 한다.
[28] 본 발명에 있어서 , 상기 세포 파쇄 완충액은 조직 세포를 효과적으로
용해 (lysis)하여 파쇄된 세포로부터 DNA를 용출하기 위 한 완충액으로 구아니 딘 티오시 안네이트 (Guanidine thiocyanate), 소듐 라우릴 사르코시 네이트 (sodium lauryl sarcosinate)를 주성분으로 하고， RNA를 용출하기 위 한 완층액의 경우 항산화 화학 물질，보다 바람직하게는 2-메르캅토에탄을 (2-mercaptoethanol) 또는 디티오트레이 를 (Dithiothreitol)을 더 포함할 수 있다.
[29] 본 발명에 있어서，상기 2) 단계는 핵산이 흡착된 실리카 막을 이동상
완충액으로 일차 용출시 켜 오염물을 분리시 키는 것으로，상기 이동상 완층액은 구아니 딘 티오시 안네 이트 (Guanidine thiocyanate)를 주성분으로 하는 것을 특징으로 한다.
[30] 본 발명 에 있어서，상기 2) 단계 후 진행되는 3) 단계는 2) 단계의 오염물이
분리 된 실리카 막을 핵산 세척 완충액으로 이차 전개시 킴으로써 세포 파쇄 완층액과 2) 단계의 이동상 완충액에 포함된 고농도의 염을 제거하여 고순도의 핵산이 정제할 수 있다.
[31] 보다 상세하게는 고순도의 핵산을 수득하기 위하여，조직 세포로부터
효과적으로 핵산을 용출하고，실리카 막 상에 핵산을 효율적으로 결합시키며 핵산과 흔합된 불순물을 효과적으로 제거하고，핵산의 순도를 높이 기 위하여 세척하는 단계가 필요하다.
[32] 본 발명 에 따른 정 제방법은 실리카 막을 이용한 페 이퍼 크로마토그래피 법으로 실리카 막에 흡착된 핵산을 고순도의 핵산으로 분리하는 것으로, 상기 단계적 인 페이 퍼 전개는 액체 이동상의 완층액에 의하여 실리카 막 상에 핵산의 흡착， 오염물의 분리 및 핵산의 정제가 단계적으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
[33] 보다 상세하게는 본 발명에 사용되는 순차적 인 3가지 완충액 시스템을 통하여 생물학적 시료로부터 고순도의 핵산을 단계적으로 분리 할 수 있는 것으로 첫 번째 단계로，세포 파쇄 완층액을 이용하여 조직 세포의 효과적 인 파쇄 및 이로부터 핵산을 효율적으로 용출시 켜 실리카 막 상에 결합시 킬 수 있다. 상기 세포 파쇄 완충액은 소듐 라우릴 사르코시 네이트 (sodium lauryl sarcosinate)를 ' 포함하고 있어 조직 세포를 효과적으로 용해시 켜 핵산의 용출을 용이하게 하며， 또한 고농도의 구아니 딘 티오시 안네이트 (Guanidine thiocyanate)를 포함하고 있어서용출된핵산이실리카막에효과적으로결합할수있게해준다.
[34] 두번째단계로，고농도의구아니딘티오시안네이트 (Guanidinethiocyanate)가 포함된이동상완층액을이용하여실리카막에결합된핵산으로부터수용성의 단백질및기타불순물을이동상에의한크로마토그래피법을통해효과적으로 제거하면서동시에핵산의실리카막에대한결합력을높일수있다.상기 이동상완층액은고농도의구아니딘티오시안네이트 (Guanidinethiocyanate)가 포함된핵산결합완충액 (Binding Buffer)을사용한다.
[35] 마지막으로，핵산의순도를높이고지질성분의불순물을제거하기위하여 에탄올성분의핵산세척완충액 (Washing buffer)을이동상으로사용하였다.
[36] 본발명의구체적인실시예에서본발명에따른페이퍼크로마토그래피법및 기존의원심분리를이용한스핀컬럼 (spin column)방식을이용하여
혈액으로부터핵산을분리한후,역전사중합효소연쇄반응및실시간역전사 중합효소연쇄반웅을이용하여목적유전자의증폭능을확인하였다.
[37] 그결과,종래의핵산분리방법보다소량의시료로부터특수한장비를
사용하지않고빠르고간편하게핵산을분리할수있음을확인할수있었다. 발명의효과
[38] 본발명에따른초고속핵산의분리방법은질병원의진단이나목적하는
유전자의검출을위하여매우유용한방법으로，복잡하고특수한장비를 사용해야하는기존핵산분리방법과비교하여신속하고간편하게질병원의 분자진단에사용될수있으며,특히현장진단 (POCT)을위한최적의핵산 분리방법으로사용될수있는장점이 있다.
[39] 또한본발명에따론초고속핵산의분리방법은숙련된기술이요구되지않기 때문에일반인들이직접질병원의분석을위한핵산분리가가능하여,병，의원 또는검진센터의방문을통해서만질병원검진을위한핵산분리가가능한 기존의번거로움을해결해줄수있는장점이있다.
도면의간단한설명
[40] 도 1은본발명의세포파쇄완충액에 Proteinase K첨가여부에따른초고속 DNA분리방법의비교모식도를보여주는것이며，
[41] 도 2는상기도 3에서확인된초고속핵산의정제방법으로분리한 DNA로부터 목적 DNA에대한증합효소연쇄반웅분석결과를보여주는것이고,
[42] 도 3은본발명에따른변형된세포파쇄완층액을이용하여전체핵산의분리 여부를전기영동으로확인한결과이며,
[43] 도 4는본발명에따른초고속핵산의정제방법으로분리한전체핵산으로부터 목적 RNA에대한역전사증합효소연쇄반웅분석결과를보여주는것이고，
[44] 도 5는본발명에따른초고속핵산의정제방법으로분리한전체핵산으로부터 목적 RNA에대한 Rotor-Spin방식의 Qiagen otorGene Q실시간정량 PCR 분석기를이용한분석결과를보여주는것이며， [45] 도 6은본발명에따른초고속핵산의정제방법으로분리한전체핵산으로부터 목적 RNA에대한 Thermo Block방식의 ΑΒΓ7900ΗΤ실시간정량 PCR분석기를 이용한분석결과를보여주는것이고，
[46] 도 7은본발명에따른초고속핵산의정제방법에대한모식도및분석방법에 대한개략도를보여주는것이다.
발명의실시를위한형태
[47] 본발명은하기실시예에의하여더욱구체적으로설명한다.그러나,하기
실시예는본발명의이해를돕기위한것일뿐,어떤의미로든본발명의범위가 이러한실시예에의하여한정되는것은아니다.
[48] 이때,사용되는기술용어및과학용어에있어서다른정의가없다면，이
발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자가통상적으로이해하고 있는의미를가지며，하기의설명및첨부도면에서본발명의요지를
.불필요하게흐릴수있는공지기능및구성에대한설명은생략한다.
[49] [실시예 1]실리카막 (silica membrane)을이용한핵산분리여부확인
[50] 비웅고혈액시료로부터세포파쇄완층액 (Cell Lysis Buffer)으로핵산을추출 후, silica membrane에핵산의결합및분리가가능한지여부를테스트하였다.
[51] 핵산분리의재료로소량의 Na-EDTA또는헤파린으로처리된사람의비웅고 혈액 (non-coagulating blood)시료를사용하였다.25 μί또는 50 /의혈액시료를 각각서로다른하기표 1의조성을가진 3가지세포파쇄완층액 (A, Β, C) 500 ^에넣고혼합하여물리적인힘을가하여강하게섞어 (vortexing)주었다.각 세포파쇄액에파쇄액 0.6배의부피비로이소프로파놀 (2-propanol)을흔합한후, 실리카막 (가로 0.5 cmx세로 0.5 cm)을세포파쇄액에담가두었다.
[52] [표 1] 세포 파쇄 완충액
Figure imgf000008_0001
이후,실라카막을 80%에틸알코올로세척후건조하고,실리카막을 100 ^의 TE완층액 (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA)이담긴튜브에서실리카막에 결합된핵산을용출 (elution)하였다.이방법에의해서분리된핵산의분리여부와 양을확인하기위하여남아있는세포파쇄액으로부터기존의원심분리를 이용한스핀컬럼 (spin column)방식으로핵산을추출하여비교분석하여하기표 2에나타내었다.상기분석은 Nano-DropUV-Spectrophotometer (분광광도계)를 이용하여 260 nm 파장에서 분리 된 DNA의 파장 흡수 값을 통한 정 량법으로 확인하여 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2] 실리카 막을 이용하여 분리된 DNA의 양
Figure imgf000009_0001
[55] 그 결과 상기 표 2에서도 확인할 수 있듯이，세포 파쇄 완충액으로부터 용출된 핵산이 실리카 막에 잘 결합하고 분리됨을 확인할 수 있었고，더군다나 기존의 원심분리를 이용한 스핀 컬럼 (spin column) 방식 으로 추출한 핵산 보다 많은 양의 핵산을 추출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[56] [실시 예 2] 페이퍼 크로마토그래피 법을 적용한 초고속 DNA의 분리
[57] (1) 초고속 DNA의 분리
[58] 상기 실시 예 1의 실험을 통해 비웅고 혈액 시료로부터 용출된 핵산이 실리카 막 (silica membrane)에 잘 결합하고 분리될 수 있음을 확인하였다. 또한 3 가지 의 세포 파쇄 완충액 중에서 DNA 성분의 핵산을 분리하는데 sodium citrate가 포함된 여부와는 상관없이 모든 완충액에서 핵산 추출 및 실리카 막에 흡착을 통한 용출이 가능하기 때문에 테스트한 3 가지 세포 파쇄 완충액 중에서 pH 7.0의 완충액 A를 선택하고，상기 결과를 토대로 초고속 핵산 분리를 위하여 페이퍼 크로마토그래피 법을 적용하여 핵산의 분리 여부 확인 및 목적 DNA의 PCR 증폭 확인 여부를 테스트 하였다.
[59] 일반적으로 조직 세포로부터 핵산을 분리하기 위하여 불순물을 제거하는 과정 이 매우 중요하다. 특히，조직 세포의 파쇄로 인하여 생성된 단백질 성분의 불순물을 제거하는 것은 고순도의 핵산을 분리하는데 매우 중요하다. 이를 위하여 많은 핵산 분리 방법에서 효과적 인 단백질 제거를 위하여 핵산 분리용 완층액에 단백질 분해 효소를 적용한다. 단백질 분해 효소의 적용은 단백질 성분의 불순물을 제거하는데는 효과적 이나 혈액 시료와 같은 특정 조직 시료에서는 이 효소를 적용하지 않고 고순도의 핵산을 분리 할 수. 있다. 이에 실시 예 2에서 확인된 완충액 B에서 단백질 분해 효소인 Proteinase K를 적용한 세포 파쇄 완층액 (A-1)과 적용하지 않은 세포 파쇄 완충액 (A-2)를 이용하여 페이 퍼크로마토그래피 법을 적용한 핵산 분리 여부를 테스트하였다.
[60] 이를 위 하여 25 ^의 하기 표 3의 조성을 가진 세포 파쇄 완층액 (A-l, A-2)이 들어 있는 튜브에 5 의 비웅고 혈액 시료를 첨가하고 흔합 후 물리 적 인 힘을 가하여 강하게 섞 어 (vortexing)주었다. 그 다음 세포 파쇄 액에 파쇄액의 0.6배 부피 비에 해당하는 이소프로파놀 (isoproanol)을 첨가하고 흔합하여 세포 파쇄액 (lysate)을준비하였다.
[표 3] 세포 파쇄 완충액
Figure imgf000010_0001
[62] 상기세포파쇄액에용출된핵산을실리카막에결합시켜
페이퍼크로마토그래피법에의한이동상용액의전개를통해불순물을 제거시키는방법으로핵산을분리하기위하여도 1에서제시한방법으로핵산 분리를테스트하였다.이를위하여상기세포파쇄액을실리카막 (가로 0.5 cmx 세로 10 cm)의밑부분에서 0.5 cm부분을담그고,용출된핵산을결합시켰다. 세포파쇄액에담가졌던실리카막의끝부분을 100 의첫번째이동상 완층액인하기표 4의조성을가진핵산결합완충액 (Binding buffer)이들어있는 류브에담근후,실리카막에결합된핵산은그대로유지하면서불순물을이동상 용액으로페이퍼크로마토그래피법에의하여분리후제거하였다.
[63] [표 4] 핵산 결합 완층액 (이동상 완충액 -1)
Figure imgf000010_0002
다음으로,두번째이동상완충액인핵산세척완층액 (washing buffer) 400 ^(80 ethanol)이들어있는튜브에실리카막의끝부분을담그고，불순물을 추가로제거하고핵산을세척 (washing)하였다.그리고세포파쇄액에담가졌던 실리카막의일부분에서직경 2mm크기의조각을편칭을통해분리후목적 DNA의 PCR검출테스트를하였으며，나머지부분은 100 ul의 DNA용출 완층액 (elutkm buffer)인 TE완층액에담가 DNA를녹여내어 Nano-Drop
UV-Spectrophotometer (분광광도계)를이용하여분리된 DNA를정량하여하기표 5에나타내었다. [65] [표 5] Proteinase K사용 여부에 따라실리카 막을 이용하여 분리된 DNA의 양
Figure imgf000011_0001
[66] 그결과표 5에서도확인할수있듯이,두가지의세포파쇄완층액 A-1과
Α-2에서단백질분해효소인 proteinase Κ의적용여부에상관없이효율적으로 핵산이추출됨을확인할수있었다.이는본발명의페이퍼크로마토그래피법을 이용한초고속핵산분리방법에있어단백질분해효소를처리하는과정은 핵산을분리하는데사용되는조직시료에따라적용될수있음을보여주는 결과이기도하다.
[67] (2) DNA로부터목적 DNA의 PCR .
[68] 상기실시예 2의 (1)의방법으로실리카막에결합된상태로분리된
DNA로부터목적 DNA를중합효소연쇄반웅 (polymerase chain reaction, PCR)을 통해검출 (detection)가능여부를확인하였다.
[69] 이를위하여사람의염색체 DNA염기서열상에서베타글로불린 (beta-globin) 유전자부위로부터디자인된프라이머세트,각각 lOpmoles의정방향 프라이머 (Forward primer) 5'-GGGATGATAGTCTGACTTTCCTAACCT-3'와 역방향프라이머 (Reverse primer) 5'-GCCTTCAGTCATGCCTAGGCCTGCA-3'및 1.25 units의 HelixAmp™ 7 DNA polymerase,최종농도 2.5 mM의 MgCl2,0.25 mM dNTP mix가포함된반응완층액 (Reaction buffer)을이용하여페이퍼 크로마토그래피법에의해분리된 DNA가결합되어 있는부분에서직경 2mm 크기의실리카막을취해서 PCR검출반응을수행하였다. PCR반웅은 95 °C, 20 초 /68°C 1분 (35 cycles)조건으로 50 ul반웅액부피 (reaction volume)에서 수행되었고， PCR반응후에 lOul의 PCR산물이 1% agarose gel에서전기영동을 통해분석되었다.
[70] 도 2에서도확인할수있듯이, PCR반응결과 DNA가결합되어있는실리카 막으로부터목적으로하는 550 bp크기의베타,글로불린 DNA부분이검출됨을 통해상기실시예 2의핵산의정제방법이고순도의핵산을생물학적시료로부터 빠르고간편하게분리하여 PCR법을이용한다양한핵산분석에사용할수 있음을확인할수있었다.
[71] [실시예 3]페이퍼크로마토그래피법을활용하여혈액시료로부터전체핵산의 분리.
[72] (n혐액시료로부터저체핵산의분리
[73] 질병원진단및분자적검출은질병원의 DNA뿐만아니라 RNA로부터실행될 수있다.이것은거의모든분자적진단에매우중요하다.그래서상기실시예 2의방법으로분리된 DNA와 RNA를모두포함하는전체핵산의분리를 테스트하고 분리된 전체 핵산으로부터 목적 RNA에 대한 RT-PCR 검출을 테스트 하였다. 일반적으로 조직 시료로부터 핵산을 분리하는 과정에서，특히 RNA를 분리하는 과정 에서 RNA 분해 효소 (RNase)의 오염으로 인한 RNA의 분해가 목적 RNA의 검출올 어 렵 게 하며 , 유전자 현장 진단에서 더욱 심각한 문제를 야기 할 수 있다. 이 러 한 핵산 분리 과정에서 RNA 분해 효소의 오염을 방지하고 효과적으로 DNA 및 RNA를 분리하기 위하여 2-메르캅토에 탄올과
Dithiothreitol과 같은 항산화 화학 물질 (antioxidant chemical)이 사용되는데 이 화학 물질들은 RNA 분해 효소 분자내의 이 황화 결합 (disulfide bond)를 끊어 RNA 분해능을 불활성화 시키는 것으로 알려져 있다.
[74] 본 실시 예에서는 DNA와 RNA를 포함하는 전체 핵산을
페이 퍼크로마토그래피 법을 적용하여 초고속으로 핵산을 분리하기 위하여 실시 예 2의 (1)의 세포 파쇄 완층액 A-2에 대하여 항산화 화학 물질인
2-메르캅토에탄올올 적용하여 DNA 및 RNA를 포함하는 전체 핵산 분리 여부를 테스트하였다. 전체 핵산의 페이퍼크로마토그래피 법을 통한 분리를 확인하기 위하여，하기 표 6에 나타낸 실시 예 2의 (1)에서 제시 된 세포 파쇄 완충액
A-2(완층액 A-2)와 2-메르캅토에 탄올을 적용한 변형된 세포 파쇄 완층액 (변형 된 완층액 A-2)을 이용하여，기존의 원심분리를 이용한 스핀 컬럼 (spin column) 방식 의 핵산 분리 방법으로 혈액으로부터 DNA 및 RNA 모두 분리되는지 여부를 확인하였다.
[75] [표 6] 전체 핵산 분리를 위한 세포 파쇄 완충액
Figure imgf000012_0001
[76] 도 3에서 변형 된 세포 파쇄 완충액 (변형된 완층액 A-2)에서는 DNA 및 RNA 가 모두 분리된 반면에 2-메르캅토에탄올이 포함되지 않은 실시 예 2에서 의 세포 파쇄 완층액 (완충액 A-2)은 DNA만이 분리되는 것을 확인할 수 있었다.
[77] 상기의 결과를 바탕으로 변형된 세포 파쇄 완층액 (변형된 완충액 A-2)을
사용하여 상기 실시 예 2의 방법을 변형하여 전체 핵산을 초고속
페이 퍼크로마토그래피 법을 이용하여 분리하였다. 실시 예 2의 핵산 분리 과정 에서 세포 파쇄 액에 담가 둔 실리카 막 부분은 1， 2차 이동상 완층액으로 전개 시키는 과정에서 일부 불순물이 완전히 제거되지 않는 단점 이 확인되 었다.
[78] 이 번 테스트에서는 이 문제점을 극복하기 위하여 도 7에서 보는 바와 같이
실리카 막 (가로 0.5 cmx세로 10 cm)의 끝에서 1 cm 윗 부분에 세포 파쇄액을 점 적하고 이동상 완층액에는 실리카 막 끝부분의 으5 cm 부분만을 적셔서 시료가 세포 파쇄 액 점적된 부분의 불순물이 더욱 효과적으로 전개되어 제거 될 수 있도록 실시하였으며，나머지 핵산 분리 과정은 실시 예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
상기의 결과는 본 발명의 변형된 세포 파쇄 완층액 (변형된 완층액 A-2)과 상기 실시 예 2의 초고속 핵산의 분리 및 정제방법에 있어서，효율적으로 전체 핵산을 분리 할 뿐 아니 라 목적하는 RNA(Target RNA) 역시 확인 가능함을 보여주는 결과이 기도 하다.
(2) 저 체 핵산으로부터 목적 RNA의 RT-PCR 검출
상기 실시 예 3의 (1)의 방법으로 실리카 막에 결합된 상태로 분리된 전체 핵산으로부터 목적 RNA(target RNA)를 역전사 효소-증합효소 연쇄
반응 (Reverase transcriptase-PCR, RT-PCR)을 통해 검출 (detection) 가능 여부를 확인하였다.
이를 위하여 사람의 베타-글로불린 (beta-globin) 유전자에 대한 전사체 염기서 열 (transcript sequence)로부터 디자인된 프라이머 세트, 각각 lO pmoles의 정방향 프라이머 (Forward primer) 5'-CAAGGTGAACGTGGATGAAG-3'와 역방향 프라이머 (Reverse primer) 5'-GGCAGAATCCAGATGCTCAA-3' 및 1.25 units의 HelixAmp™Hot-7 <? DNA polymerase (Nanohelix, 한국)와 25 units의 HelixCript™ Thermo Reverse transcriptase(Nanohelix, 한국)，최종 농도 2.5 mM의 MgCl2, 0.25 mM dNTP mix가 포함된 반웅 완충액 (Reaction buffer)를 이용하여， 50°C (40분)， 1 cycle/950C(15분), 1 cycle/95°C(20초) -55oC(40초) -720C(1분)， 35 cycles 조건으로， 상기 실시 예 3의 (1)의 방법으로 실리카 막에 결합된 상태로 분리 된 전체 핵산 부분에서 직 경 2 mm 크기의 실리카 막을 취 해서 목적 RNA의 RT-PCR 검출 반웅을 수행하였다.
도 4에서 확인할 수 있듯이， RT-PCR 결과 전체 핵산이 결합되어 있는 실리카 막으로부터 400 bp 크기 의 베타-글로불린 (beta-globin) RNA 전사체를 검출할 수 있었고, 목적 RNA의 검출은 전체 세포 파쇄 액 (lysate)중에서 5 ^만
점 적한 (spotting) 실리카 막에서도 확인을 할 수가 있었다.
상기의 결과로부터 본 발명 의 초고속 핵산의 분리 방법은 종래의 핵산 분리 방법보다 소량의 시료로부터 특수한 장비를 사용하지 않고 빠르고 간편하게 핵산을 분리 할 수 있음을 확인할 수 있었다.
(3) 저체 핵산의 심시 ?> PCR 증폭 확이
최근의 분자 진단은 중합효소 연쇄반웅 (PCR) 및 역 전사 중합효소
연쇄반웅 (RT-PCR)과 함께 실시 간 역 전사 증합효소 연쇄반응 (Real-time PCR)이 목적 DNA 또는 RNA의 검출에 사용된다.
본 발명 에서는 페이퍼크로마토그래피 방법으로 분리되 어 실리카 막에 결합된 핵산으로부터 실시간 역 전사 증합효소 연쇄반응을 통하여 목적 RNA의 검출 가능성을 테스트 하였다. 사람의 베타-글로블린 (beta-globin) 유전자에 대한 전사체 염 기서 열 (transcript sequence) 로부터 디자인된 프라이 머 세트，정 방향 프라이머 (Forward primer) 5'-CAAGGTGAACGTGGATGAAG-3'와역방향 프라이머 (Reverse primer) 5'-ATTAGCCACACCAGCCACCAC-3'를이용하여， 상기실시예 3의 (1)의방법으로실리카막에결합된상태로분리된전체핵산 부분에서직경 2mm크기의실리카막을취해서실시간역전사중합효소 연쇄반웅에사용하였다.
[88] 실시간역전사중합효소연쇄반응은 25 units HelixCript™7¾ermo Reverse
' Transcriptase및 1.25 units
Figure imgf000014_0001
DNA polymerase와 0.25 mM dNTP mix, SYBR Green형광시약이포함된반웅완층액,그리고
베타-글로불린 (beta-globin)유전자의전사체염기서열로부터디자인된각각 10 pmoles의프라이머를이용하여 50oC(40분), 1 cycle/95°C(15분), 1
cycle/95oC(20초) -55oC(40초) -72°C(1분), 35 cycles조건으로실시간역전사 중합효소연쇄반응을수행하였다.
[89] 실시간목적 DNA의증폭여부는 SYBR Green형광시약을이용하여 Rotor-Spin 방식의 Qiagen RotorGene Q와 Thermo Block방식의 ΑΒΙ7900ΗΤ실시간정량 PCR분석기를이용하여분석되었다.
[90] 도 5및도 6에서도확인할수있듯이，실시간역전사중합효소연쇄반웅결과 전체핵산이결합되어있는실리카막으로부터 350 bp크기의베타
글로불린 (beta-globin) RNA전사체를검출할수있었고，두가지 type의실시간 정량 PCR분석기에서모두본발명에따른초고속핵산의분리방법으로분리된 핵산을이용한분석이가능함을확인할수있었다.

Claims

청구범위
[청구항 1] 페이 퍼크로마토그래피 법 (paper chromatography)으로 고순도의 핵산을 생물학적 시료로부터 분리하는, 초고속 핵산의 정제방법 에 있어서 ,
1) 생물학적 시료로부터 분리된 핵산을 실리카 막 (silica
membrane)에 흡착시키는 단계 ;
2) 상기 핵산이 흡착된 실리카 막으로부터
페이 퍼크로마토그래피 법을 이용하여 오염물을 분리시 키는 단계 ;
3) 상기 오염물이 분리된 실리카 막으로부터 완충용액을 이용하여 고순도의 핵산만을 용출 또는 실리카 막에 결합된 핵산을 직접 PCR, 역 전사 -PCR(RT-PCR), 실시간 PCR 및 실시 간 RT-PCR로부터 선택되는 1종 이상에 적용하는 단계 ;
를 포함하는 것을 특징으로 하는，초고속 핵산의 정제방법 .
[청구항 2] 제 1항에 있어서，
상기 1) 단계는 세포 파쇄 완충액에 의해 용해된 핵산을
페이퍼크로마토그래피 법으로 실리카 막에 흡착시 키는 것을 특징으로 하는, 초고속 핵산의 정제방법 .
[청구항 3] 제 2항에 있어서 ,
상기 세포 파쇄 완층액은 케오트로픽 염 및
사코시 네이트 (sarcosinate)를 주성분으로 하는 것을 특징으로 하는， 초고속 핵산의 정제방법 .
[청구항 4] 제 3항에 있어서，
상기 세포 파쇄 완층액은 계면활성게, 구아니 딘 티오시 안네이트 (Guanidine thiocyanate), 소듐 라우릴
사르코시 네이트 (sodium lauryl sarcosinate)를 주성분으로 하는 것을 특징으로 하는，초고속 핵산의 정제방법 .
[청구항 5] 제 1항에 있어서，
상기 2) 단계는 핵산이 흡착된 실리카 막을 이동상 완층액으로 일차 전개시 켜 오염물을 분리시키는 것을 특징으로 하는，초고속 핵산의 정제방법 .
[청구항 6] 제 5항에 있어서，
상기 이동상 완층액은 구아니 딘 티오시 안네이트 (Guanidine thiocyanate)를 주성분으로 하는 것을 특징으로 하는，초고속 핵산의 정제방법 .
[청구항 7] 제 1항에 있어서，
상기 3) 단계는 2) 단계의 오염물이 분리된 실리카 막을 핵산 세척 완층액으로이차전개시킴으로써고순도의핵산이정제되는것을 특징으로하는,초고속핵산의정제방법 .
[청구항 8] 제 1항에 있어서，
상기정제방법은실리카막을이용한단계적페이퍼
크로마토그래픽전개분리방법으로실리카막에흡착된핵산을 고순도의핵산으로분리후정제하는것을특징으로하는，초고속 핵산의정제방법.
[청구항 9] 제 8항에있어서,
상기단계적페이퍼크로마토그래픽전개분리방법은완층액의 액체이동상에의하여실리카막상에핵산의흡착，오염물의분리 및핵산의정제가단계적으로이루어지는것을특징으로하는, 초고속핵산의정제방법.
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