CN109306349A - 一种基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，包括以下步骤：步骤一，进行生物样品的制备和处理，经处理后取用5‑10mg的生物样品置于1.5ml离心管一中，加入细胞裂解液破碎细胞，并通过离心分离收集上清液；步骤二，对步骤一中上清液加入纳米磁珠悬浮液进行核酸吸附，收集吸附后的核酸‑纳米磁珠复合物；步骤三，将步骤二中核酸‑纳米磁珠复合物进行纯化及洗脱，获得纯度在1.7‑2.1以及得率在9‑40μg的核酸溶液。本发明采用该方法，能够基于纳米磁珠法实现由几毫克至十几毫克范围内的生物样品中提取纯化出完整性好、纯度高且得率高的DNA及或RNA生物大分子，以有效避免生物样品需求量过多对珍贵或稀有的人体组织、生物标本、考古及法医鉴定等样品的损伤。
Description
技术领域
本发明涉及磁珠法提取纯化核酸生物技术领域，尤其涉及一种基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法。
背景技术
核酸包括脱氧核糖核酸(RNA)和核糖核酸(DNA)两类，其在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些嗜菌体DNA有时为单链环状分子，RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子，不同类型的RNA分子可以具有不同的结构特点，至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。目前，在生物医学的各个领域都离不开核酸的提取和纯化，但是，现有的用于生物样品核酸提取及纯化的方法在实际使用过程中存在如下问题：
1、采用苯酚氯仿等有机溶剂法进行生物样品核酸的提取和纯化时，苯酚氯仿等往往有毒且会产生异味，影响操作人员的健康，该方法还需要多次离心，故使得核酸的提取和纯化过程耗时长，同时难以实现自动化。
2、柱膜法提取纯化生物样品核酸的方法虽然能够简化操作流程，然而其在核酸提取及纯化过程中小片段易丢失，且仍需要多次离心或负压进行提取纯化，另外还容易造成交叉污染。
3、磁珠法作为新的核酸提取方法，因其操作简单，不需要负压或反复离心，且易于自动化等优点受到了越来越广泛的应用，但是，该方法大多依据于现有核酸提取纯化步骤进行操作，对起始生物样品的需求量仍在上百毫克，故难以保证对珍贵或稀有的人体组织、生物标本、考古及法医鉴定等样品的核酸的高效提取纯化。
发明内容
本发明的主要目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种能够基于纳米磁珠法实现由几毫克至十几毫克范围内的生物样品中提取纯化出完整性好、纯度高且得率高的的DNA及或RNA生物大分子，以有效避免生物样品需求量过多对珍贵或稀有的人体组织、生物标本、考古及法医鉴定等样品的损伤，并直接将提取的核酸再经调配和稀释即可满足生物、医药、食品、诊断及疾控等领域核酸大分子制备需要的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其中所述基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法包括以下步骤：
步骤一，进行生物样品的制备和处理，经处理后取用5-10mg的生物样品置于1.5ml离心管一中，加入细胞裂解液破碎细胞，形成裂解的细胞溶液，并通过离心分离收集上清液；
步骤二，对步骤一中所述上清液加入纳米磁珠悬浮液进行核酸吸附，并弃掉完成核酸吸附后的上清液，收集吸附后的核酸-纳米磁珠复合物；
步骤三，将步骤二中所述核酸-纳米磁珠复合物进行纯化及洗脱，并保留含核酸的上清液，从而获得纯度在1.7-2.1以及得率在9-40μg的核酸溶液；
所述纳米磁珠悬浮液中的纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒或伽马三氧化二铁磁性颗粒，直径为20-400nm。
进一步地，所述步骤一的主要工艺过程如下：
(1)在1.5ml离心管一中加入500-600μl的细胞裂解液，以进行生物样品细胞的破碎，使生物样品细胞释放出核酸，从而获得所述裂解的细胞溶液；
(2)将步骤一(1)中的1.5ml离心管一于50-70℃下水浴加热10分钟，并进行间断混合；
(3)向步骤一(2)中的1.5ml离心管一加入100-120μl的多糖-蛋白去除液和100-120μl的无水乙醇，并进行混匀；
(4)将步骤一(3)中的1.5ml离心管一室温下放置5分钟后，再对该1.5ml离心管一以13000r/min的转速离心分离3min后，收集所述上清液。
进一步地，所述步骤二的主要工艺过程如下：
(1)取步骤一(4)所述上清液500-700μl置于1.5ml离心管二中，再加入300-420μl的异丙醇并进行混匀；
(2)向步骤二(1)中的1.5ml离心管二再加入10-30μl的混匀的所述纳米磁珠悬浮液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速混匀1-20分钟；
(3)将步骤二(2)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(4)将步骤二(3)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上3-5分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的所述纳米磁珠悬浮液吸附核酸后的上清液，收集吸附后的所述核酸-纳米磁珠复合物。
进一步地，所述步骤三的主要工艺过程如下：
(1)向步骤二(4)所述核酸-纳米磁珠复合物中加入600μl核酸洗涤液，使得所述核酸-纳米磁珠复合物与所述核酸洗涤液混合10秒钟；
(2)将步骤三(1)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(3)将步骤三(2)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上1-3分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的上清液，收集洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物；
(4)依次重复步骤三(1)、步骤三(2)和步骤三(3)0-2次，以保证对1.5ml离心管二中所述核酸-纳米磁珠复合物上杂质的充分洗涤；
(5)向步骤三(4)洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物中加入50-200μl的核酸洗脱液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速混匀1-10分钟，以保证洗脱所述纳米磁珠上的核酸样品；
(6)将步骤三(5)中的1.5ml离心管二放置于磁力分离架上5分钟后，收集1.5ml离心管二中含核酸的上清液，从而获得纯度在1.7-2.1以及得率在9-40μg的所述核酸溶液。
进一步地，所述细胞裂解液包括：三羟甲基氨基甲烷20mM，浓度在0.05-5％的细胞及蛋白变性剂，浓度在1-5mM的乙二胺四乙酸，所述细胞裂解液的pH值＝7.5-8.5，且该细胞裂解液经121℃高温及灭菌处理20分钟，所述细胞及蛋白变性剂设置为包括十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温20、曲拉通X100。
进一步地，所述多糖-蛋白去除液采用浓度在0.1-10％的多糖蛋白去除剂，且该多糖-蛋白去除液的pH值＝5-6，所述多糖蛋白去除剂包括：十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇盐酸胍、硫酸胍、琼脂糖、尿素、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温20，曲拉通X100。
进一步地，所述异丙醇的纯度设置为99.6-99.9％。
进一步地，所述核酸洗涤液包括：浓度在50％的所述异丙醇，浓度在60-80％的无水乙醇，吐温20。
进一步地，所述核酸洗脱液包括：10-20mM的三羟甲基氨基甲烷，TE缓冲液，碳酸氢钠，硼酸钠，所述核酸洗脱液的pH值＝7.5-8.5，且该核酸洗脱液经121℃高温及灭菌处理20分钟。
本发明具有的优点和积极效果是：
(1)通过基于纳米磁珠法进行的生物样品中核酸的提取方法，操作简单，不需要负压或反复离心，且易于自动化，并能够有效避免采用苯酚氯仿等有机溶剂法进行生物样品核酸的提取和纯化时，苯酚氯仿等对操作人员健康的影响，且可缩短核酸的提取和纯化时长。
(2)通过细胞破碎、纳米磁珠核酸吸附以及核酸的纯化及洗脱工艺过程中各条件的控制，能够由几毫克至十几毫克范围内的生物样品中提取纯化出完整性好、纯度高且得率高的的DNA及或RNA生物大分子，以有效避免生物样品需求量过多对珍贵或稀有的人体组织、生物标本、考古及法医鉴定等样品的损伤。
(3)通过细胞裂解液以及物理、化学或酶学方法的配合，能够实现生物细胞的充分破碎研磨，使样品细胞释放出核酸，且该细胞裂解液的组分可以有效保护核酸免受核酸酶的降解，从而获得良好的裂解的细胞溶液，进一步提高生物样品的核酸提取工艺。
(4)通过直接将提取的核酸再经调配和稀释即可满足生物、医药、食品、诊断及疾控等领域核酸大分子制备需要。
附图说明
图1是本发明的工艺流程示意图。
图2是核酸溶液的凝胶电泳对比图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的描述。
如图1、图2(a)和图2(b)所示，一种基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，包括以下步骤：
步骤一，进行生物样品的制备和处理，经处理后取用5-10mg的生物样品置于1.5ml离心管一中，加入细胞裂解液破碎细胞，形成裂解的细胞溶液，并通过离心分离收集上清液，该步骤主要工艺过程如下：
(1)在1.5ml离心管一中加入500-600μl的细胞裂解液，以进行生物样品细胞的破碎，使生物样品细胞释放出核酸，从而获得裂解的细胞溶液；
(2)将步骤一(1)中的1.5ml离心管一于50-70℃下水浴加热10分钟，并进行间断混合；
(3)向步骤一(2)中的1.5ml离心管一加入100-120μl的多糖-蛋白去除液和100-120μl的无水乙醇，并进行混匀；
(4)将步骤一(3)中的1.5ml离心管一室温下放置5分钟后，再对该1.5ml离心管一以13000r/min的转速离心分离3min后，收集上清液。
步骤二，对步骤一中上清液加入纳米磁珠悬浮液进行核酸吸附，并弃掉完成核酸吸附后的上清液，收集吸附后的核酸-纳米磁珠复合物，该步骤主要工艺过程如下：
(1)取步骤一(4)上清液500-700μl置于1.5ml离心管二中，再加入300-420μl的异丙醇并进行混匀；
(2)向步骤二(1)中的1.5ml离心管二再加入10-30μl的混匀的纳米磁珠悬浮液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速混匀1-20分钟，优选地，对该1.5ml离心管二以60-100r/min的转速混匀3-10分钟，其混匀时间可根据溶液的粘稠度优化；
(3)将步骤二(2)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(4)将步骤二(3)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上3-5分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的纳米磁珠悬浮液吸附核酸后的上清液，收集吸附后的核酸-纳米磁珠复合物。
步骤三，将步骤二中核酸-纳米磁珠复合物进行纯化及洗脱，并保留含核酸的上清液，从而获得纯度在1.7-2.1以及得率在9-40μg的核酸溶液，该步骤主要工艺过程如下：
(1)向步骤二(4)核酸-纳米磁珠复合物中加入600μl核酸洗涤液，使得核酸-纳米磁珠复合物与核酸洗涤液混合10秒钟；
(2)将步骤三(1)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(3)将步骤三(2)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上1-3分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的上清液，收集洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物；
(4)依次重复步骤三(1)、步骤三(2)和步骤三(3)0-2次，以保证对1.5ml离心管二中核酸-纳米磁珠复合物上杂质的充分洗涤；
(5)向步骤三(4)洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物中加入50-200μl的核酸洗脱液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速混匀1-10分钟，以保证洗脱纳米磁珠上的核酸样品，优选地，对该1.5ml离心管二以60-100r/min的转速混匀3-5分钟；
(6)将步骤三(5)中的1.5ml离心管二放置于磁力分离架上5分钟后，收集1.5ml离心管二中含核酸的上清液，从而获得纯度在1.7-2.1以及得率在9-40μg的核酸溶液。
纳米磁珠悬浮液中的纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒或伽马三氧化二铁磁性颗粒，直径为20-400nm。
细胞裂解液包括：三羟甲基氨基甲烷20mM，浓度在0.05-5％的细胞及蛋白变性剂，浓度在1-5mM的乙二胺四乙酸，细胞裂解液的pH值＝7.5-8.5，且该细胞裂解液经121℃高温及灭菌处理20分钟，细胞及蛋白变性剂设置为包括十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温20、曲拉通X100，该细胞裂解液既可进行裂解细胞，同时还可保护核酸免受核酸酶的降解。其中，20mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris.HCl)作为缓冲系，且细胞及蛋白变性剂的浓度范围优选为0.1-1％，而乙二胺四乙酸(EDTA)作为核酸酶抑制剂，以上组份可以预先配成10倍的母液，用时加水及各组份混合备用，一次需要的量大的话，可以加水直接进行配制。
多糖-蛋白去除液采用浓度在0.1-10％的多糖蛋白去除剂，且该多糖-蛋白去除液的pH值＝5-6，多糖蛋白去除剂包括：十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇盐酸胍、硫酸胍、琼脂糖、尿素、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温20，曲拉通X100。其中，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的浓度范围优选为3-8％，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的浓度范围优选为5-10％，硫酸胍的浓度范围优选为5-10％，十二烷基磺酸钠的浓度范围优选为0.1-1％及吐温20的浓度范围优选为1-3％，另外，在进行配制时，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)需要在50℃的水浴下加热促进溶解，其余组分则可以常温水溶液配制。
异丙醇的纯度设置为99.6-99.9％，优选在99.7％以上的异丙醇。
核酸洗涤液包括：浓度在50％的异丙醇，浓度在60-80％的无水乙醇，吐温20。
核酸洗脱液包括：10-20mM的三羟甲基氨基甲烷，TE缓冲液，碳酸氢钠，硼酸钠，核酸洗脱液的pH值＝7.5-8.5，且该核酸洗脱液经121℃高温及灭菌处理20分钟。
实施例一，由微量植物细胞中提取核酸，其主要按照如下步骤实施：
步骤一，植物样品准备：用灭菌水冲洗表面上的浮土，快速沥干，称取5-10mg嫩叶，5-10mg花瓣，5-10mg种子，20-40mg茎块或50-100mg幼根，放入1.5ml干净离心管中备用，再进行下述工艺过程：
(1)在1.5ml离心管一中加入约500μl的植物细胞裂解液，辅助以物理、化学或酶学方法破碎植物细胞，实现充分破碎研磨，使植物样品细胞释放出核酸，从而获得裂解的细胞溶液；
(2)将步骤一(1)中的1.5ml离心管一于70℃下水浴加热10分钟，并进行间断混合；
(3)向步骤一(2)中的1.5ml离心管一加入100μl的多糖-蛋白去除液和100μl的无水乙醇，并进行混匀；
(4)将步骤一(3)中的1.5ml离心管一室温下放置5分钟后，再对该1.5ml离心管一以13000r/min的转速离心分离3min后，收集上清液。
步骤二：
(1)取步骤一(4)上清液约500μl置于1.5ml干净离心管二中，再加入约300μl的异丙醇并进行混匀；
(2)向步骤二(1)中的1.5ml离心管二再加入10-30μl的刚刚混匀的纳米磁珠悬浮液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速轻轻混匀1-20分钟，以利于纳米磁珠吸附核酸，优选地，对该1.5ml离心管二以60-100r/min的转速轻轻混匀3-10分钟，其混匀时间可根据溶液的粘稠度优化；
(3)将步骤二(2)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(4)将步骤二(3)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上3-5分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的纳米磁珠悬浮液吸附核酸后的上清液，收集吸附后的核酸-纳米磁珠复合物。
步骤三：
(1)向步骤二(4)核酸-纳米磁珠复合物中加入约600μl植物核酸洗涤液，使得核酸-纳米磁珠复合物与核酸洗涤液混合10秒钟；
(2)将步骤三(1)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(3)将步骤三(2)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上1-3分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的上清液，收集洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物；
(4)依次重复步骤三(1)、步骤三(2)和步骤三(3)1次，以保证对1.5ml离心管二中核酸-纳米磁珠复合物上杂质的充分洗涤；
(5)向步骤三(4)洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物中加入50-200μl的核酸洗脱液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速轻轻混匀1-10分钟，以保证洗脱纳米磁珠上的核酸样品，优选地，对该1.5ml离心管二以60-100r/min的转速轻轻混匀3-5分钟；
(6)将步骤三(5)中的1.5ml离心管二放置于磁力分离架上5分钟后，收集1.5ml离心管二中含核酸的上清液。
最后，进行核酸溶液的检测，包括以下两方面：
(一)取上述步骤三(6)中含核酸的上清液进行核酸的A260、A230及A280吸光度、纯度及得率检测，并由现有方法采用上百毫克植物样品获得的核酸吸光度、纯度、得率稀释为与本方法采用相同质量样品测量其吸光度时获得的核酸吸光度、纯度、得率数据进行对比，从而得到如下表1：
表1本发明植物样品提取的核酸与现有技术植物样品提取的核酸数据对比
其中，A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长；A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，且A260nm的最佳测量值范围为0.1-1.0，若核酸在此位置的吸光度小于0.1，则说明样品中的杂质和颗粒等不纯物较多，这些杂质对光有一定吸收；A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长；A260与A230的比值以及A260与A280的比值用于进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230＝2.1，纯DNA的A260/A280＝1.8，纯RNA的A260/A280＝2.0。
通过表1中数据可知，植物样品发明样本1和发明样本2在A260的吸光度均大于0.1，而采用现有方法进行植物样品核酸提取后换算为与本方法采用相同质量样品时的现有样本1和现有样本2在A260的吸光度均小于0.1，则现有样本中的杂质和颗粒等不纯物较多；植物样品发明样本1和发明样本2的A260/A230、A260/A280的比值均在1.9以上，而现有样本1和现有样本2的A260/A230、A260/A280的比值均在1.5以下，则发明样本的纯度范围更接近纯核酸的纯度，且其在核酸提取过程中受添加试剂的破损较小；植物样品发明样本1和发明样本2的核酸得率均在14微克以上，而现有样本1和现有样本2的核酸得率均在1.4微克以下，综上数据对比，采用本发明方法能够由几毫克至十几毫克范围内的植物样品中提取出完整性好、纯度高且得率高的核酸。
(二)取上述步骤三(6)中含核酸的上清液进行核酸溶液跑凝胶电泳，获得图2(a)中发明样本1和发明样本2的核酸溶液的凝胶电泳图，并由现有方法采用上百毫克植物样品获得的核酸换算为与本方法采用相同质量样品时获得的核酸进行核酸溶液跑凝胶电泳，获得图2(b)中现有样本1和现有样本2的核酸溶液的凝胶电泳图。
实施例二，由微量动物细胞中提取核酸，其主要按照如下步骤实施：
步骤一，动物样品准备：称取5mg肝脏,5-10mg肌肉,或5-10mg心脏，放入1.5ml干净离心管中备用，再进行下述工艺过程：
(1)在1.5ml离心管一中加入约600μl的动物细胞裂解液，辅助以物理、化学或酶学方法破碎动物细胞，实现充分破碎研磨，使动物样品细胞释放出核酸，从而获得裂解的细胞溶液；
(2)将步骤一(1)中的1.5ml离心管一于50℃下水浴加热10分钟，并进行间断混合；
(3)向步骤一(2)中的1.5ml离心管一加入120μl的多糖-蛋白去除液和120μl的无水乙醇，并进行混匀；
(4)将步骤一(3)中的1.5ml离心管一室温下放置5分钟后，再对该1.5ml离心管一以13000r/min的转速离心分离3min后，收集上清液。
步骤二：
(1)取步骤一(4)上清液约600μl置于1.5ml干净离心管二中，再加入约360μl的异丙醇并进行混匀；
(2)向步骤二(1)中的1.5ml离心管二再加入20μl的刚刚混匀的纳米磁珠悬浮液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速轻轻混匀1-20分钟，以利于纳米磁珠吸附核酸，优选地，对该1.5ml离心管二以60-100r/min的转速轻轻混匀3-10分钟，其混匀时间可根据溶液的粘稠度优化；
(3)将步骤二(2)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(4)将步骤二(3)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上3分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的纳米磁珠悬浮液吸附核酸后的上清液，收集吸附后的核酸-纳米磁珠复合物。
步骤三：
(1)向步骤二(4)核酸-纳米磁珠复合物中加入约600μl动物核酸洗涤液，使得核酸-纳米磁珠复合物与核酸洗涤液混合10秒钟；
(2)将步骤三(1)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(3)将步骤三(2)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上1分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的上清液，收集洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物；
(4)依次重复步骤三(1)、步骤三(2)和步骤三(3)1次，以保证对1.5ml离心管二中核酸-纳米磁珠复合物上杂质的充分洗涤；
(5)向步骤三(4)洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物中加入50-200μl的核酸洗脱液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速轻轻混匀1-10分钟，以保证洗脱纳米磁珠上的核酸样品，优选地，对该1.5ml离心管二以60-100r/min的转速轻轻混匀3-5分钟；
(6)将步骤三(5)中的1.5ml离心管二放置于磁力分离架上5分钟后，收集1.5ml离心管二中含核酸的上清液。
最后，进行核酸溶液的检测，包括以下两方面：
(一)取上述步骤三(6)中含核酸的上清液进行核酸的A260、A230及A280吸光度、纯度及得率检测，并由现有方法采用上百毫克动物样品获得的核酸吸光度、纯度、得率稀释为与本方法采用相同质量样品测量其吸光度时获得的核酸吸光度、纯度、得率数据进行对比，从而得到如下表2：
表2本发明动物样品提取的核酸与现有技术动物样品提取的核酸数据对比
其中，A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长；A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，且A260nm的最佳测量值范围为0.1-1.0，若核酸在此位置的吸光度小于0.1，则说明样品中的杂质和颗粒等不纯物较多，这些杂质对光有一定吸收；A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长；A260与A230的比值以及A260与A280的比值用于进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230＝2.1，纯DNA的A260/A280＝1.8，纯RNA的A260/A280＝2.0。
通过表2中数据可知，动物样品发明样本3和发明样本4在A260的吸光度均大于0.1，而采用现有方法进行动物样品核酸提取后换算为与本方法采用相同质量样品时的现有样本3和现有样本4在A260的吸光度均小于0.1，则现有样本中的杂质和颗粒等不纯物较多；动物样品发明样本3和发明样本4的A260/A230、A260/A280的比值均在1.8以上，而现有样本3和现有样本4的A260/A230、A260/A280的比值均在1.8以下，则发明样本的纯度范围更接近纯核酸的纯度，且其在核酸提取过程中受添加试剂的破损较小；动物样品发明样本3和发明样本4的核酸得率均在10微克以上，而现有样本3和现有样本4的核酸得率均在0.7微克以下，综上数据对比，采用本发明方法能够由几毫克至十几毫克范围内的动物样品中提取出完整性好、纯度高且得率高的核酸。
(二)取上述步骤三(6)中含核酸的上清液进行核酸溶液跑凝胶电泳，获得图2(a)中发明样本3和发明样本4的核酸溶液的凝胶电泳图，并由现有方法采用上百毫克动物样品获得的核酸换算为与本方法采用相同质量样品时获得的核酸进行核酸溶液跑凝胶电泳，获得图2(b)中现有样本3和现有样本4的核酸溶液的凝胶电泳图。
实施例三，由微量细菌细胞中提取核酸，其主要按照如下步骤实施：
步骤一，细菌样品准备：培养细菌过夜，以7000-8000r/min的转速进行菌液离心3-5分钟后，弃掉上清，取5-10mg细菌菌体到干净的离心管，再进行下述工艺过程：
(1)在1.5ml离心管一中加入约600μl的细菌细胞裂解液，辅助以物理、化学或酶学方法破碎细菌细胞，实现充分破碎研磨，使细菌样品细胞释放出核酸，从而获得裂解的细胞溶液；
(2)将步骤一(1)中的1.5ml离心管一于70℃下水浴加热10分钟，并进行间断混合；
(3)向步骤一(2)中的1.5ml离心管一加入100μl的多糖-蛋白去除液和100μl的无水乙醇，并进行混匀；
(4)将步骤一(3)中的1.5ml离心管一室温下放置5分钟后，再对该1.5ml离心管一以13000r/min的转速离心分离3-5min后，收集上清液。
步骤二：
(1)取步骤一(4)上清液约700μl置于1.5ml干净离心管二中，再加入约420μl的异丙醇并进行混匀；
(2)向步骤二(1)中的1.5ml离心管二再加入30μl的刚刚混匀的纳米磁珠悬浮液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速轻轻混匀1-20分钟，以利于纳米磁珠吸附核酸，优选地，对该1.5ml离心管二以60-100r/min的转速轻轻混匀3-10分钟，其混匀时间可根据溶液的粘稠度优化；
(3)将步骤二(2)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(4)将步骤二(3)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上3分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的纳米磁珠悬浮液吸附核酸后的上清液，收集吸附后的核酸-纳米磁珠复合物。
步骤三：
(1)向步骤二(4)核酸-纳米磁珠复合物中加入约600μl动物核酸洗涤液，使得核酸-纳米磁珠复合物与核酸洗涤液混合10秒钟；
(2)将步骤三(1)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(3)将步骤三(2)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上1-3分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的上清液，收集洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物；
(4)依次重复步骤三(1)、步骤三(2)和步骤三(3)1次，以保证对1.5ml离心管二中核酸-纳米磁珠复合物上杂质的充分洗涤；
(5)向步骤三(4)洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物中加入50-200μl的核酸洗脱液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速轻轻混匀1-10分钟，以保证洗脱纳米磁珠上的核酸样品，优选地，对该1.5ml离心管二以60-100r/min的转速轻轻混匀3-5分钟；
(6)将步骤三(5)中的1.5ml离心管二放置于磁力分离架上5分钟后，收集1.5ml离心管二中含核酸的上清液。
最后，进行核酸溶液的检测，包括以下两方面：
(一)取上述步骤三(6)中含核酸的上清液进行核酸的A260、A230及A280吸光度、纯度及得率检测，并由现有方法采用上百毫克细菌样品获得的核酸吸光度、纯度、得率稀释为与本方法采用相同质量样品测量其吸光度时获得的核酸吸光度、纯度、得率数据进行对比，从而得到如下表3：
表3本发明细菌样品提取的核酸与现有技术细菌样品提取的核酸数据对比
其中，A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长；A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，且A260nm的最佳测量值范围为0.1-1.0，若核酸在此位置的吸光度小于0.1，则说明样品中的杂质和颗粒等不纯物较多，这些杂质对光有一定吸收；A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长；A260与A230的比值以及A260与A280的比值用于进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230＝2.1，纯DNA的A260/A280＝1.8，纯RNA的A260/A280＝2.0。
通过表3中数据可知，细菌样品发明样本5和发明样本6在A260的吸光度均大于0.1，而采用现有方法进行动物样品核酸提取后换算为与本方法采用相同质量样品时的现有样本5和现有样本6在A260的吸光度均小于0.1，则现有样本中的杂质和颗粒等不纯物较多；细菌样品发明样本5和发明样本6的A260/A230、A260/A280的比值均在1.9以上，而现有样本5和现有样本6的A260/A230、A260/A280的比值均在1.8以下，则发明样本的纯度范围更接近纯核酸的纯度，且其在核酸提取过程中受添加试剂的破损较小；细菌样品发明样本5和发明样本6的核酸得率均在12微克以上，而现有样本5和现有样本6的核酸得率均在1.3微克以下，综上数据对比，采用本发明方法能够由几毫克至十几毫克范围内的细菌样品中提取出完整性好、纯度高且得率高的核酸。
(二)取上述步骤三(6)中含核酸的上清液进行核酸溶液跑凝胶电泳，获得图2(a)中发明样本5和发明样本6的核酸溶液的凝胶电泳图，并由现有方法采用上百毫克细菌样品获得的核酸换算为与本方法采用相同质量样品时获得的核酸进行核酸溶液跑凝胶电泳，获得图2(b)中现有样本5和现有样本6的核酸溶液的凝胶电泳图。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。
Claims (10)
1.一种基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法包括以下步骤：
步骤一，进行生物样品的制备和处理，经处理后取用5-10mg的生物样品置于1.5ml离心管一中，加入细胞裂解液破碎细胞，形成裂解的细胞溶液，并通过离心分离收集上清液；
步骤二，对步骤一中所述上清液加入纳米磁珠悬浮液进行核酸吸附，并弃掉完成核酸吸附后的上清液，收集吸附后的核酸-纳米磁珠复合物；
步骤三，将步骤二中所述核酸-纳米磁珠复合物进行纯化及洗脱，并保留含核酸的上清液，从而获得纯度在1.7-2.1以及得率在9-40μg的核酸溶液；
所述纳米磁珠悬浮液中的纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒或伽马三氧化二铁磁性颗粒，直径为20-400nm。
2.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述步骤一的主要工艺过程如下：
(1)在1.5ml离心管一中加入500-600μl的所述细胞裂解液，以进行生物样品细胞的破碎，使生物样品细胞释放出核酸，从而获得所述裂解的细胞溶液；
(2)将步骤一(1)中的1.5ml离心管一于50-70℃下水浴加热10分钟，并进行间断混合；
(3)向步骤一(2)中的1.5ml离心管一加入100-120μl的多糖-蛋白去除液和100-120μl的无水乙醇，并进行混匀；
(4)将步骤一(3)中的1.5ml离心管一室温下放置5分钟后，再对该1.5ml离心管一以13000r/min的转速离心分离3min后，收集所述上清液。
3.根据权利要求2所述的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述步骤二的主要工艺过程如下：
(1)取步骤一(4)所述上清液500-700μl置于1.5ml离心管二中，再加入300-420μl的异丙醇并进行混匀；
(2)向步骤二(1)中的1.5ml离心管二再加入10-30μl的混匀的所述纳米磁珠悬浮液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速混匀1-20分钟；
(3)将步骤二(2)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(4)将步骤二(3)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上3-5分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的所述纳米磁珠悬浮液吸附核酸后的上清液，收集吸附后的所述核酸-纳米磁珠复合物。
4.根据权利要求3所述的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述步骤三的主要工艺过程如下：
(1)向步骤二(4)所述核酸-纳米磁珠复合物中加入600μl核酸洗涤液，使得所述核酸-纳米磁珠复合物与所述核酸洗涤液混合10秒钟；
(2)将步骤三(1)中的1.5ml离心管二室温下放置5分钟，并进行间歇混匀；
(3)将步骤三(2)中的1.5ml离心管二再放置于磁力分离架上1-3分钟后，弃掉1.5ml离心管二中的上清液，收集洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物；
(4)依次重复步骤三(1)、步骤三(2)和步骤三(3)0-2次，以保证对1.5ml离心管二中所述核酸-纳米磁珠复合物上杂质的充分洗涤；
(5)向步骤三(4)洗涤后的核酸-纳米磁珠复合物中加入50-200μl的核酸洗脱液，再对该1.5ml离心管二以50-200r/min的转速混匀1-10分钟，以保证洗脱所述纳米磁珠上的核酸样品；
(6)将步骤三(5)中的1.5ml离心管二放置于磁力分离架上5分钟后，收集1.5ml离心管二中含核酸的上清液，从而获得纯度在1.7-2.1以及得率在9-40μg的所述核酸溶液。
5.根据权利要求1或2所述的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述细胞裂解液包括：三羟甲基氨基甲烷20mM，浓度在0.05-5％的细胞及蛋白变性剂，浓度在1-5mM的乙二胺四乙酸，所述细胞裂解液的pH值＝7.5-8.5，且该细胞裂解液经121℃高温及灭菌处理20分钟。
6.根据权利要求2所述的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述多糖-蛋白去除液采用浓度在0.1-10％的多糖蛋白去除剂，且该多糖-蛋白去除液的pH值＝5-6，所述多糖蛋白去除剂包括：十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇盐酸胍、硫酸胍、琼脂糖、尿素、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温20，曲拉通X100。
7.根据权利要求3所述的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述异丙醇的纯度设置为99.6-99.9％。
8.根据权利要求4所述的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述核酸洗涤液包括：浓度在50％的所述异丙醇，浓度在60-80％的无水乙醇，吐温20。
9.根据权利要求4所述的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述核酸洗脱液包括：10-20mM的三羟甲基氨基甲烷，TE缓冲液，碳酸氢钠，硼酸钠，所述核酸洗脱液的pH值＝7.5-8.5，且该核酸洗脱液经121℃高温及灭菌处理20分钟。
10.根据权利要求5所述的基于纳米磁珠的生物样品核酸提取纯化方法，其特征在于：所述细胞及蛋白变性剂设置为包括十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温20、曲拉通X100。
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