CN105368817A - 宫颈细胞保存及dna快速提取一体试剂盒和提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒，其包括细胞保存液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液以及DNA纯化柱；其中，所述细胞保存液含有2～3mol/L盐酸胍或硫氰酸胍、5～50mmol/L的Tris-HCl、1～10mmol/L的EDTA和5～7.5v/v％的Trixon-100。本发明试剂盒中的保存液可室温保存宫颈样本DNA一周以上，便于采集样本的运输，在后续DNA的提取步骤也不再需要繁琐的裂解工作，整个提取步骤在10min以内即可完成，显著提高了DNA提取的效率。此外本发明的保存提取操作只涉及移液器和离心机两种实验仪器，对仪器依赖性低，且提取得到的DNA纯度高。

Description

宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒和提取方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及宫颈细胞和病毒微生物DNA快速提取方法及保存提取一体试剂盒。

背景技术

宫颈癌是中国女性第二大常见的恶性肿瘤，研究证明，超过99％的宫颈癌都与人乳头瘤病毒(HPV)相关，同时宫颈癌还是唯一病因明确，可早期发现早期预防的癌症，因此对HPV的筛查对预防宫颈癌有着重要意义。HPV的检测过程都要涉及宫颈样本的采样、保存、运输及DNA的提取。同时，由于HPV检测多数是用于临床检测，因此简单的实验操作和对仪器设备更少的依赖是HPV检测用DNA提取试剂盒必须拥有的一个特点。

目前宫颈细胞多使用液基细胞保存液进行保存，液基细胞保存液可以保证细胞形态的完整性，用于后期的病理检测。但是液基细胞学中加有甲醇、甲醛等固定液，其对DNA有较强的破坏性，对后期的PCR等检测有着较为严重的影响。而且甲醛和甲醇都具有一定毒性，对操作人员的健康也存在着一定的危害。另外，目前大部分保存液都需要在干冰或冰盒的保护下进行运输，这样也无疑增加了运输成本和工作量。

目前使用DNA提取试剂盒进行DNA的提取工作一般主要分为裂解、洗涤和洗脱等几个步骤，而对DNA产量最为关键的步骤为裂解步骤，如果裂解的时间较短，会导致DNA产量过低，从而使得后期检测的灵敏度下降，目前一般是将细胞样本置于裂解液中，并于一定温度下孵育10～15min，在孵育期间还需颠倒混匀几次，以保证裂解的充分进行，裂解步骤较为繁琐，

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒，其保护液可对置于其中的宫颈样本DNA稳定性进行长时间的保持，以保证临床检验质量，且在DNA的后续提取时无需裂解步骤，操作简便快捷。

本发明还有一个目的是通过提供一种DNA提取的方法，其利用简单的取液器和离心机设备即可进行DNA的提取，且提取快速，得到的DNA纯度高，保证了后续的PCR检验结果的准确性。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒，其包括细胞保存液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液及DNA纯化柱；

其中，所述细胞保存液含有2～3mol/L盐酸胍或硫氰酸胍、5～50mmol/L的Tris-HCl、1～10mmol/L的EDTA和5～7.5v/v％的Trixon-100。

其中，细胞保存液中的Trixon-100可破坏细胞膜，并解聚胞内与DNA结合的蛋白，较高浓度盐酸胍或硫氰酸胍的加入可进一步破坏核蛋白的二级结构，并使胞内的核酸酶失活，不但利于DNA的提取，且可防止其在后期贮存过程中的降解。此外，EDTA的添加也可通过螯合金属离子，抑制核酸酶对DNA的降解作用，Tris-HCl缓冲液的添加可提高DNA在贮存过程中的稳定性。将采集的宫颈样本置于本发明细胞保存液中10min左右，即可实现样本DNA与其余物质的分离，且DNA在细胞保存液中的室温储存时间可长达一周以后依然维持较高的稳定性，有效避免的样本在运输过程中可能会发生降解或污染而对检测结果的可靠性和敏感性所带来的影响，此外在后续DNA的提取步骤也不再需要繁琐的裂解工作，显著降低了DNA提取时间，提高了提取效率。

优选的是，其中，所述DNA纯化柱包括硅胶膜柱及套设于所述硅胶膜柱外部的集液管，其中硅胶膜可对DNA进行特异性的吸附，再经后续洗涤除杂和洗脱步骤，即可得到高质量的DNA。

优选的是，其中，所述第一洗涤液含有50～60v/v％的乙醇、0.1～1mol/L的盐酸胍或硫氰酸胍、10～100mmol/L的Tris-HCl和1～10mmol/L的EDTA，用于去除硅胶膜和DNA表面的蛋白质、糖、脂类等物质，其中盐酸胍或硫氰酸胍的可溶解蛋白，适当浓度的添加提高蛋白的去除效率。

优选的是，其中所述第二洗涤液含有65～80v/v％的乙醇、10～100mmol/L的Tris-HCl和1～10mmol/L的EDTA，用以去除硅胶膜和DNA表面的盐等杂质。

其中第一和第二洗涤液中均添加有乙醇，其目的主要是维持DNA的沉淀状态，以保证DNA与硅胶膜的紧密结合，防止在去除杂质的时候部分DNA的损失。

优选的是，其中，所述洗脱液含有10～100mmol/L的Tris-HCl和1～10mmol/L的EDTA，用以有效得将吸附于硅胶膜上的DNA洗脱下来，可得到较高的DNA洗脱浓度。

本发明的目的还可以进一步由应用所述试剂盒的DNA提取方法来实现，该方法包括如下步骤：

1)将采集的宫颈细胞放入加有所述细胞保存液的保存管内混合均匀，得到细胞样本液；

2)取200～500ul所述细胞样本液，加入150～250ul的无水乙醇混合均匀后，置入所述DNA纯化柱，离心1min，弃去集液管中的滤液，其中在样本DNA溶液中加入一定比例的乙醇可提高DNA与硅胶膜的结合能力；

3)向所述DNA纯化柱中加入500～750ul所述第一洗涤液，离心1min，弃去集液管中的滤液；

4)向所述DNA纯化柱中加入500～750ul所述第二洗涤液，离心1min，弃去集液管中的滤液；

5)将所述DNA纯化柱内的硅胶膜柱置于新的集液管内，加入50～200ul洗脱液，依次静置1min和离心1min后，集液管中的液体即为提取得到的DNA。

优选的是，其中，所述步骤1)中宫颈细胞采用宫颈刷进行采集取样，所述细胞保存液的体积为0.8～1.2ml。

优选的是，其中，所述步骤2)～5)中离心的速度均高于10000rpm，以保证DNA表面杂质去除的效果。

优选的是，其中，所述步骤2)～5)中离心的温度均为室温，降低了对仪器的依赖及仪器成本。

优选的是，其中，所述步骤5)中静置的温度为室温。

本发明至少包括以下有益效果：

(1)本发明试剂盒中的保存液可室温保存宫颈样本DNA一周以上，有效提高了采集样本在运输过程中质量的稳定性，从而可以保证后续PCR检验的准确性；

(2)本发明后续DNA的提取中不需要繁琐的裂解工作，整个提取步骤在10min以内即可完成，显著提高了DNA提取的效率，且提取得到的DNA纯度高，避免了杂质对PCR检验的干扰，保证了检验结果的可靠性；

(3)本发明的保存提取操作只涉及到移液器和离心机两种实验仪器，对仪器依赖性低。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

<实例1>

采用某妇幼保健院宫颈细胞采样结果，将宫颈刷采集到的宫颈细胞置于1ml的细胞保存液中混合均匀得到细胞样本液，其中所述细胞保存液组分为：2mol/L盐酸胍、5mmol/L的Tris-HCl、5mmol/L的EDTA和5v/v％的Trixon-100，其余为去离子水。样本采集后室温运输2天后随机抽取1例样本进行提取，提取试剂组分如下：

其中第一洗涤液含有50v/v％的乙醇、1mol/L的硫氰酸胍、10mmol/L的Tris-HCl和5mmol/L的EDTA；第二洗涤液含有65v/v％的乙醇、100mmol/L的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA；洗脱液含有10mmol/L的Tris-HCl和10mmol/L的EDTA。

DNA提取步骤如下：

1)取250ul所述细胞样本液，加入150ul的无水乙醇混合均匀后，置入所述DNA纯化柱，10000rpm离心1min，弃去集液管中的滤液；

2)向所述DNA纯化柱中加入500ul所述第一洗涤液，10000rpm离心1min，弃去集液管中的滤液；

3)向所述DNA纯化柱中加入750ul所述第二洗涤液，15000rpm离心1min，弃去集液管中的滤液；

4)将所述DNA纯化柱内的硅胶膜柱置于新的集液管内，加入50ul洗脱液，依次室温静置1min和12000rpm离心1min后，集液管中的液体即为提取得到的DNA。

为验证本实例提取试剂盒的效率，取相同样本，采用市售某品牌DNA提取试剂盒对该样本进行重复提取。该试剂盒首先加入蛋白酶K和RNA酶后孵育2分钟，同时裂解10分钟。

提取完毕后进行荧光定量PCR实验，其中PCRMastermix体积为20ul，临床样本DNA体积为10ul，45个循环，实验结果见表1。

<实例2>

采用另一妇幼保健院宫颈细胞采样结果，将宫颈刷采集到的宫颈细胞置于0.8ml的细胞保存液中混合均匀得到细胞样本液，其中所述细胞保存液组分为：3mol/L盐酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、1mmol/L的EDTA和7.5v/v％的Trixon-100，其余为去离子水。样本采集后室温运输4天后随机抽取1例样本进行提取，提取试剂组分如下：

其中第一洗涤液含有60v/v％的乙醇、0.1mol/L的盐酸胍、10mmol/L的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA；第二洗涤液含有80v/v％的乙醇、10mmol/L的Tris-HCl和10mmol/L的EDTA；洗脱液含有100mmol/L的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA。

DNA提取步骤如下：

1)取500ul所述细胞样本液，加入250ul的无水乙醇混合均匀后，置入所述DNA纯化柱，12000rpm室温离心1min，弃去集液管中的滤液；

2)向所述DNA纯化柱中加入750ul所述第一洗涤液，13000rpm室温离心1min，弃去集液管中的滤液；

3)向所述DNA纯化柱中加入500ul所述第二洗涤液，13000rpm离心1min，弃去集液管中的滤液；

4)将所述DNA纯化柱内的硅胶膜柱置于新的集液管内，加入200ul洗脱液，依次室温静置1min和16000rpm室温离心1min后，集液管中的液体即为提取得到的DNA。

为验证本实例提取试剂盒的效率，取相同样本，采用市售某品牌DNA提取试剂盒对该样本重复提取。该试剂盒首先加入蛋白酶K和RNA酶后孵育2分钟，同时裂解10分钟。

提取完毕后进行荧光定量PCR实验，其中PCRMastermix体积为20ul，临床样本DNA体积为10ul，45个循环，实验结果见表1。

<实例3>

采用另一市立医院宫颈细胞采样结果，将宫颈刷采集到的宫颈细胞置于1.2ml的细胞保存液中混合均匀得到细胞样本液，其中所述细胞保存液组分为：2.5mol/L硫氰酸胍、25mmol/L的Tris-HCl、5mmol/L的EDTA和6v/v％的Trixon-100，其余为去离子水。样本采集后室温运输5天后随机抽取1例样本进行提取，提取试剂组分如下：

其中第一洗涤液含有55v/v％的乙醇、0.6mol/L的硫氰酸胍、60mmol/L的Tris-HCl和9mmol/L的EDTA；第二洗涤液含有75v/v％的乙醇、80mmol/L的Tris-HCl和8mmol/L的EDTA；洗脱液含有50mmol/L的Tris-HCl和5mmol/L的EDTA。

DNA提取步骤如下：

1)取300ul所述细胞样本液，加入200ul的无水乙醇混合均匀后，置入所述DNA纯化柱，10000rpm离心1min，弃去集液管中的滤液；

2)向所述DNA纯化柱中加入600ul所述第一洗涤液，11000rpm离心1min，弃去集液管中的滤液；

3)向所述DNA纯化柱中加入600ul所述第二洗涤液，15000rpm离心1min，弃去集液管中的滤液；

4)将所述DNA纯化柱内的硅胶膜柱置于新的集液管内，加入150ul洗脱液，依次静置1min和14000rpm离心1min后，集液管中的液体即为提取得到的DNA。

为验证本实例提取试剂盒的效率，取相同样本，采用市售某品牌DNA提取试剂盒对该样本重复提取。该试剂盒首先加入蛋白酶K和RNA酶后孵育2分钟，同时裂解10分钟。

提取完毕后进行荧光定量PCR实验，其中PCRMastermix体积为20ul，临床样本DNA体积为10ul，45个循环，实验结果见表1。

表1实施例试剂盒与市售试剂盒的临床样本效果对比

上表中Ct值是荧光信号(扩增产物)到达阈值时所经过的扩增循环次数，其与初始模板浓度的对数值成线性关系，从上表可以看出，分别对采用各实例和市售某品牌试剂盒提取得到的DNA进行荧光定量PCR实验，各实例和相对应某品牌达到阈值的循环数Ct值基本没有差别，由此说明了本发明的快速提取一体试剂盒提取DNA效率与市售其他试剂盒提取效率没有明显差异。

<实例4>

采用宫颈癌Hela细胞系作为研究对象，实验设计如表2，本实例的细胞保存和提取方法如实例1完全相同，工艺过程也完全相同，对提取到的基因组DNA和高危HPV18型进行荧光定量PCR实验，实验结果见表3。

表2样本的不同保存和提取方法

表3不同条件对HPV18和基因组DNA荧光定量PCR影响的对比

样品编号	HPV18Ct值	SD	基因组Ct值	SD
					1	27.4	0.1	29.1	0.1
2	26.6	0.3	28.8	0.2
					3	26.7	0.1	28.4	0.0
4	26.9	0.2	28.5	0.2
					5	26.6	0.2	28.2	0.1
6	27.1	0.1	28.6	0.2
					7	26.9	0.0	28.3	0.1

超过99％的宫颈癌与人乳头瘤病毒(HPV)相关，其中HPV18是其中的高危性HPV病毒，与宫颈癌的发生密切相关，通过对提取基因组的DNA和HPV18同时进行荧光定量PCR检测可以以细胞作为质控，避免假阳性诊断的出现，更有助于病情的准确判断。

从表3可以看出，Hela细胞系分别在本实例试剂盒的细胞保存液中放置0、1、3、7天后，HPV18和基因组DNA的PCR结果基本没有发生变化，这说明本实例保存液对样本DNA具有很好的保护效果；而且使用本实例的保存液和快速提取一体试剂盒后，和现有市售品牌试剂盒相比并没有影响HPV和基因组DNA的提取效率和PCR效果，且样本间差异很小，重复性好。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (10)

1.一种宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细胞保存液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液以及DNA纯化柱；

其中，所述细胞保存液含有2～3mol/L盐酸胍或硫氰酸胍、5～50mmol/L的Tris-HCl、1～10mmol/L的EDTA和5-7.5v/v％的Trixon-100。

2.如权利要求1所述的宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒，其特征在于，所述DNA纯化柱包括硅胶膜柱及套设于所述硅胶膜柱外部的集液管。

3.如权利要求1所述的宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒，其特征在于，所述第一洗涤液含有50～60v/v％的乙醇、0.1～1mol/L的盐酸胍或硫氰酸胍、10～100mmol/L的Tris-HCl和1～10mmol/L的EDTA。

4.如权利要求1所述的宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒，其特征在于，所述第二洗涤液含有65～80v/v％的乙醇、10～100mmol/L的Tris-HCl和1～10mmol/L的EDTA。

5.如权利要求1所述的宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒，其特征在于，所述洗脱液含有10～100mmol/L的Tris-HCl和1～10mmol/L的EDTA。

6.一种应用如权利要求1的试剂盒进行DNA提取的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将采集的宫颈细胞放入加有所述细胞保存液的保存管内混合均匀，得到细胞样本液；

2)取200～500ul所述细胞样本液，加入150～250ul无水乙醇混合均匀后，置入所述DNA纯化柱，离心1min，弃去集液管中的滤液；

3)向所述DNA纯化柱中加入500～750ul所述第一洗涤液，离心1min，弃去集液管中的滤液；

4)向所述DNA纯化柱中加入500～750ul所述第二洗涤液，离心1min，弃去集液管中的滤液；

5)将所述DNA纯化柱内的硅胶膜柱置于新的集液管内，加入50～200ul洗脱液，依次静置1min和离心1min后，集液管中的液体即为提取得到的DNA。

7.如权利要求6所述的DNA提取的方法，其特征在于，所述步骤1)中宫颈细胞采用宫颈刷进行采集取样，所述保存管内细胞保存液的体积为0.8～1.2ml。

8.如权利要求6所述的DNA提取的方法，其特征在于，所述步骤2)～5)中离心的速度均高于10000rpm。

9.如权利要求6所述的DNA提取的方法，其特征在于，所述步骤2)～5)中离心的温度均为室温。

10.如权利要求6所述的DNA提取的方法，其特征在于，所述步骤5)中静置的温度为室温。