CN112251492A - 一种提取病毒核酸的试剂盒和提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提取病毒核酸的试剂盒和提取方法。本发明第一方面提供了一种提取病毒核酸的试剂盒，包括裂解液、磁珠悬浮液、蛋白酶K溶解液、核酸助沉剂溶液、洗涤液和洗脱液；其中，裂解液包括Tris‑HCL、异硫氰酸胍、N‑月桂酰肌氨酸钠、EDTA、TritonX‑100、CTAB和Antifoam 204；洗涤液包括Tris‑HCL、PEG6000和氯化钠；洗脱液为纯水。本发明提供的试剂盒和提取方法提高了核酸的提取效果，而且可实现室温下病毒核酸的提取，避免了加热处理造成的基因污染，此外，还避免了乙醇对提取过程的影响，与常规磁珠法相比，提取时间可缩短至15min左右，提取过程更加快捷简便。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种病毒核酸提取试剂盒和提取方法。
背景技术
核酸提取技术是病毒分子生物学研究的基础，现已广泛应用于病原微生物检测、临床疾病诊断、环境微生物检测、食品安全检测以及法医学鉴定等众多领域。在提取过程中要遵循以下原则：提取尽可能充分，保证一级结构的完整性，避免蛋白质、脂类物质和多糖等生物大分子的污染，并且尽可能缩短和简化提取流程。一种提取效率高、时间短、操作简单的核酸提取试剂已成为快速分子诊断技术的关键。
目前，磁珠法技术越来越主导核酸提取市场，其主要原理是在磁珠上标记特异性吸附核酸的物质来特异性吸附核酸，并通过磁分离技术将核酸从磁珠表面洗脱。具体包括裂解、吸附、洗涤、洗脱四个步骤，其中，裂解主要是通过异硫氰酸胍提取待测样品的DNA/RNA，吸附通常是在磁力架上进行，利用改良和表面修饰后的磁珠吸附DNA/RNA，洗涤主要分三次进行，前两次主要使用主成分为盐酸胍和乙醇的buffer，用于去除蛋白杂质，第三次主要使用主成分为乙醇的buffer去除盐离子，洗涤后需要在通风处将磁珠晾干，晾干后使用Tris-HCL或水溶液对磁珠进行洗脱，现有的磁珠法存在较多的缺陷，例如，裂解过程一般需要在50-55℃下孵育15-20分钟，期间间隔每5分钟左右，需要颠倒3-4次，操作十分麻烦；晾干过程主要用于去除残留乙醇，不仅耗费时间，而且操作不当容易导致乙醇残留，影响PCR扩增速率；为了加速DNA/RNA的释放和洗脱，通常在裂解和洗脱过程进行加热处理，在加热容易造成基因污染，造成假阳性的检测结果；现有的磁珠法的整个提取时间需要40min左右，耗时太长，因此，本领域技术人员致力于开发一种病毒核酸提取试剂盒和提取方法，弥补现有缺陷。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种提取效率高、时间短的提取病毒核酸的试剂盒和提取方法。
为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种提取病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、磁珠悬浮液、蛋白酶K溶解液、核酸助沉剂溶液、洗涤液和洗脱液；
其中，所述裂解液包括Tris-HCL、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠、EDTA、TritonX-100、CTAB和Antifoam 204，所述异硫氰酸胍的浓度为2-6M；
所述蛋白酶K溶解液包括蛋白酶K、甘油、乙酸钠和氯化钙；
所述洗涤液包括Tris-HCL、PEG6000和氯化钠；
所述洗脱液为纯水。
进一步地，所述裂解液中，Tris-HCL的浓度为30-60mM、N-月桂酰肌氨酸钠的质量分数为0.05-2％、EDTA的浓度为5-10mM、TritonX-100的体积分数为1-3％、CTAB的质量分数为0.1-1％、Antifoam 204的体积分数为0.1-1％，其中，所述Tris-HCL的pH为8.0-9.5。
进一步地，所述磁珠悬浮液中磁珠的浓度为20-50mg/mL。
进一步地，所述磁珠的粒径为10-50nm。
进一步地，所述蛋白酶K溶解液中，蛋白酶K的浓度为50-100mg/mL、甘油的体积分数为30-70％、乙酸钠的浓度为10-40mM、氯化钙的浓度为0.1-0.5mM，其中，所述乙酸钠的pH为7.0-8.0。
进一步地，所述核酸助沉剂的浓度为10-30mM。
进一步地，所述洗涤液中，Tris-HCL的浓度为10-50mM、PEG6000的质量分数为5-10％，氯化钠的浓度为300-500mM，其中，所述Tris-HCL的pH为8.0-9.0。
本发明第二方面提供了一种使用上述任一所述试剂盒的提取方法，包括如下步骤：
步骤1、将待测样品、裂解液、蛋白酶K溶解液、核酸助沉剂溶液、异丙醇和磁珠悬浮液混合均匀，室温孵育5min，期间混匀2次，随后磁性分离得到吸附病毒核酸后的磁珠；
步骤2、将所述吸附病毒核酸后的磁珠重悬于洗涤液中，洗涤两次后收集洗涤后的磁珠；
步骤3、将所述洗涤后的磁珠重悬于洗脱液中，室温孵育3min，并收集洗脱液。
进一步地，步骤1中，将150-300μL的待测样品、300-500μL的裂解液、20-50μL蛋白酶K溶解液、5-20μL核酸助沉剂溶液、100-300μL异丙醇和50-100μL磁珠悬浮液混合均匀；步骤2中，洗涤液为500-1000μL；步骤3中，洗脱液为50-100μL。
进一步地，步骤1中，所述待测样品和所述裂解液的体积比为1：1～1.75。
本发明提供的病毒核酸提取试剂盒，包括浓度为2-6M的异硫氰酸胍和核酸助沉剂，可有效提高病毒核酸的提取效果，具体地，异硫氰酸胍作为蛋白变形剂，可迅速破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，释放核酸，并且其既没有RNA酶活性也没有DNA酶活性，可同时提取RNA\DNA，因此被广泛用于病毒核酸提取中，而本申请主要提高了异硫氰酸胍的浓度，配合蛋白酶K和核酸助沉剂，进一步提高了核酸的提取效果，而且可实现室温下病毒核酸的提取，避免了加热处理造成的基因污染；本发明提供的洗涤液和洗脱液中不含有乙醇，避免了乙醇对提取过程的影响，与常规磁珠法相比，提取时间可缩短至15min左右，提取过程更加快捷简便。本发明提供了一种提取病毒核酸的试剂盒和提取方法，可适用于细胞、细菌、血清、血浆、唾液、尿液和胸腹水样品的病毒核酸检测，其中，血浆和拭子样品的检测效果最优。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1为实施例1和对比例1提供的方法提取的核酸样品的RT-PCR检测的扩增曲线对比图；
图2为实施例2和对比例2提供的方法提取的核酸样品的RT-PCR检测的扩增曲线对比图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1新型冠状病毒假病毒的血浆待测样品的核酸提取
使用提取试剂盒中包括裂解液、磁珠悬浮液、蛋白酶K溶解液、核酸助沉剂溶液、洗涤液和洗脱液，
其中，裂解液中，Tris-HCL的浓度为50mM，异硫氰酸胍的浓度为4M，N-月桂酰肌氨酸钠的质量分数为2％、EDTA的浓度为5mM、TritonX-100的体积分数为1％、CTAB的质量分数为1％、Antifoam 204的体积分数为0.5％，其中，所述Tris-HCL的pH为8.0；
所述磁珠悬浮液中磁珠为羧基磁珠，粒径为20nm，磁珠的浓度为20mg/mL；
蛋白酶K溶解液中，蛋白酶K为白色冻干粉，且其浓度为50mg/mL、甘油的体积分数为45％、乙酸钠的浓度为30mM、氯化钙的浓度为0.2mM，其中，乙酸钠的pH为8.0；
核酸助沉剂溶液中核酸助沉剂的浓度为25mM；
洗涤液中，Tris-HCL的浓度为40mM、PEG6000的质量分数为5％，氯化钠的浓度为400mM，其中，所述Tris-HCL的pH为9.0；
洗脱液为纯水。
核酸提取方法包括如下步骤：
步骤1、在1.5ml离心管中加入200μL血浆待测样品、300μL裂解液、20μL蛋白酶K溶解液、5μL核酸助沉剂溶液、200μL异丙醇以及50μL磁珠悬浮液，涡旋振荡30s至样本充分混匀，室温孵育5min，期间颠倒混均两次；
步骤2、将离心管放置于磁力架上静置30s，待磁珠吸附至一侧后弃除废液，收集吸附病毒核酸后的磁珠；
步骤3、将吸附病毒核酸后的磁珠重悬于700μL洗涤液中，颠倒混匀至磁珠完全重悬，将离心管置于磁力架上，静置30s后弃除废液，完成第一次洗涤；
步骤4、重复步骤3进行第二次洗涤；
步骤5、将洗涤后的磁珠重悬于50μL洗脱液纯水中，室温孵育3min，孵育期间轻弹离心管2-3次使磁珠分散，将离心管放置于磁力架上，静置1min，弃磁珠收集洗脱液，完成病毒核酸提取。
对比例1
本对比例使用联合医学新冠状病毒试剂盒进行核酸检测，具体提取方法依据产品说明书进行。
本发明进一步取实施例1得到的洗脱液20μL进行RT-PCR检测，其中，RT-PCR体系试剂包括18.3μL 10Xbuffer、1.7μL酶混合液、20μL模板，反应程序如表1所示，其扩增曲线如图1所示，检测平均Ct值见表2：
表1实施例1和对比例1进行RT-PCR反应程序
表2实施例1和对比例1RT-PCR检测的平均Ct值
| 检测基因 | 实施例1 | 对比例1 |
| N基因 | 30.04 | 31.58 |
| 内参基因 | 24.63 | 24.59 |
根据图1和表2提供的结果可知，实施例1提供的提取方法比对比例1提供的提取方法的提取效率更高。
实施例2新型冠状病毒假病毒的咽拭子样品的核酸提取
本实施例使用的试剂盒与实施例1相同。
核酸提取方法包括如下步骤：
步骤1、在1.5ml离心管中加入300μL咽拭子样品、350μL裂解液、20μL蛋白酶K溶解液、6μL核酸助沉剂溶液、200μL异丙醇以及50μL磁珠悬浮液，涡旋振荡30s至样本充分混匀，室温孵育8min，期间颠倒混均两次；
步骤2、将离心管放置于磁力架上静置30s，待磁珠吸附至一侧后弃除废液，收集吸附病毒核酸后的磁珠；
步骤3、将吸附病毒核酸后的磁珠重悬于700μL洗涤液中，颠倒混匀至磁珠完全重悬，将离心管置于磁力架上，静置30s后弃除废液，完成第一次洗涤；
步骤4、重复步骤3进行第二次洗涤；
步骤5、将洗涤后的磁珠重悬于50μL洗脱液纯水中，室温孵育3min，孵育期间轻弹离心管2-3次使磁珠分散，将离心管放置于磁力架上，静置1min，弃磁珠收集洗脱液，完成病毒核酸提取。
对比例2
使用与对比例1相同的试剂盒和提取方法对新型冠状病毒假病毒的咽拭子样品进行核酸提取。
使用与实施例1和对比例1相同的RT-PCR检测方法对实施例2和对比例2提取的核酸样品进行检测，检测结果如图2和表3所示：
表3实施例2和对比例2RT-PCR检测的平均Ct值
| 检测基因 | 实施例1 | 对比例1 |
| N基因 | 28.32 | 28.84 |
| 内参基因 | 24.28 | 24.77 |
根据图2和表3提供的结果可知，实施例2提供的检测方法比对比例2提供的提取方法的提取效率更高。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种提取病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解液、磁珠悬浮液、蛋白酶K溶解液、核酸助沉剂溶液、洗涤液和洗脱液；
其中，所述裂解液包括Tris-HCL、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠、EDTA、TritonX-100、CTAB和Antifoam 204，所述异硫氰酸胍的浓度为2-6M；
所述蛋白酶K溶解液包括蛋白酶K、甘油、乙酸钠和氯化钙；
所述洗涤液包括Tris-HCL、PEG6000和氯化钠；
所述洗脱液为纯水。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液中，Tris-HCL的浓度为30-60mM，N-月桂酰肌氨酸钠的质量分数为0.05-2％、EDTA的浓度为5-10mM、TritonX-100的体积分数为1-3％、CTAB的质量分数为0.1-1％、Antifoam 204的体积分数为0.02-0.1％，其中，所述Tris-HCL的pH为8.0-9.5。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬浮液中磁珠的浓度为20-50mg/mL。
4.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠的粒径为10-50nm。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K溶解液中，蛋白酶K的浓度为50-100mg/mL、甘油的体积分数为30-70％、乙酸钠的浓度为10-40mM、氯化钙的浓度为0.1-0.5mM，其中，所述乙酸钠的pH为7.0-8.0。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸助沉剂的浓度为10-30mM。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液中，Tris-HCL的浓度为10-50mM、PEG6000的质量分数为5-10％，氯化钠的浓度为300-500mM，其中，所述Tris-HCL的pH为8.0-9.0。
8.一种使用权利要求1-7任一项所述试剂盒的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将待测样品、裂解液、蛋白酶K溶解液、核酸助沉剂溶液、异丙醇和磁珠悬浮液混合均匀，室温孵育5min，期间混匀2次，随后磁性分离得到吸附病毒核酸后的磁珠；
步骤2、将所述吸附病毒核酸后的磁珠重悬于洗涤液中，洗涤两次后收集洗涤后的磁珠；
步骤3、将所述洗涤后的磁珠重悬于洗脱液中，室温孵育5min，并收集洗脱液。
9.如权利要求8所述提取方法，其特征在于，步骤1中，将150-300μL的待测样品、300-500μL的裂解液、20-50μL蛋白酶K溶解液、5-20μL核酸助沉剂溶液、100-300μL异丙醇和50-100μL磁珠悬浮液混合均匀；步骤2中，洗涤液为500-1000μL；步骤3中，洗脱液为50-100μL。
10.如权利要求9所述的提取方法，其特征在于，步骤1中，所述待测样品和所述裂解液的体积比为1：1～1.75。
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