CN116555248A - 一种细菌中高分子量dna提取试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种细菌中高分子量DNA提取试剂盒及提取方法，属于生物技术领域。本发明中裂解液等缓冲体系与提取方法的搭配，可直接提取菌液沉淀，无需将菌液进行包埋处理，大大缩短了提取流程与时间，增加了HMW DNA的提取效率，保证了HMW DNA的完整性。具体的，本发明中提供的裂解液和DNA助提剂等缓冲液，可以迅速破坏细菌的细胞壁以达到渗透并溶解细胞的目的，可以最大效率释放HMW DNA，并且其中裂解液与其他缓冲体系的协同作用保证了提取的HMW DNA的完整性，可广泛应用于二代测序，尤其是三代测序，解决了HMW DNA提取困难、通量低的问题，具有广阔的市场前景和巨大的经济价值。
Description
技术领域
本申请涉及一种细菌中高分子量DNA提取试剂盒及提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
随着高通量测序技术的发展，三代测序技术（Third-Generation Sequencing，TGS）也逐渐受到研究者们的关注，三代测序技术（也称为单分子实时测序技术）是一种基于单个DNA分子直接测序的技术，它具有快速、高通量、准确度高等优点。相较于前两代测序技术，三代测序技术有着更高的读长、更低的错配率和更少的GC偏差，可以更准确地解析基因组的结构与功能。
而为了更好地发挥三代测序技术的优势，需要从样本中提取高质量的High-Molecular Weight DNA（HMW DNA）。HMW DNA是指高分子量（通常大于50 kb）的DNA分子。在三代测序中，HMW DNA的提取是非常重要的，相较于短链DNA，HMW DNA有着更高的完整性、更少的断裂和更少的交叉污染。由于HMW DNA分子量很高，避免了DNA片段化和损伤，从而确保所得到的测序数据准确度和可靠性。同时，HMW DNA可以提高DNA读取长度，有助于产生更长的连续序列，从而更好地解决基因组重复序列的难题。此外，HMW DNA还可以提供更多的DNA模板，提高测序覆盖度和深度，增强测序数据的可靠性和可重复性。
HMW DNA的提取是一项复杂的技术，在提取过程中可能会遇到一些问题，比如高分子量DNA的提取过程中，如果操作不当或提取条件不当，可能会导致DNA断裂，使得DNA片段化。在提取HMW DNA的过程中，可能会受到外源性DNA的污染，例如来自其他细菌或真菌的DNA，这些污染物可能会影响DNA的质量和浓度，并干扰后续的实验结果，以上问题是当前HMW DNA提取的瓶颈。
目前，针对HMW DNA的提取，大致可分为盐析法、酚氯仿萃取法、硅胶膜和磁珠法、琼脂糖包埋法。其中，盐析法提取过程中由于无纯化步骤，所以提取出来的HMW DNA往往有大量的污染物和抑制剂成分；酚氯仿萃取法含有有毒试剂，长期使用对人体有害；硅胶膜和磁珠法由于频繁的离心和吹吸震荡，对HMW DNA产生明显的剪切作用，容易变成小分子DNA；琼脂糖包埋法提取效果最佳，但是由于此提取方法的过程比较繁琐，需要耗时1~2天，对技术要求较高，对于一般实验者来说较难实现。因此目前亟需一种能够解决上述技术困难的高分子量DNA提取方法。
发明内容
为了解决上述问题，提供了一种细菌中高分子量DNA提取试剂盒及提取方法，该提取试剂盒中裂解液和DNA助提剂等缓冲液，可以迅速破坏细菌的细胞壁以达到渗透并溶解细胞的目的，可以最大效率释放HMW DNA，并且其中裂解液与其他缓冲体系的协同作用保证了提取的HMW DNA的完整性，可广泛应用于二代测序，尤其是三代测序，解决了HMW DNA提取困难、通量低的问题。
根据本申请的一个方面，提供了一种细菌中高分子量DNA提取试剂盒，所述提取试剂盒包括以下组分：
裂解液，所述裂解液包括50±5 mM Tris、100±10 mM氯化钠、200±20mM磷酸钠、1~5% N-月桂酰肌氨酸钠、20±2 mg/ml蛋白酶K；
DNA助提剂，所述DNA助提剂包括1~3 M异硫氰酸胍或盐酸胍、50±5mM Tris、25±2mM氯化钠、0.6~1.0% TritonX-100、25±2mM EDTA、45~55%异丙醇；
漂洗液1，所述漂洗液1包括1~3 M异硫氰酸胍或盐酸胍、50±5mM Tris、25±2mM氯化钠；
漂洗液2，所述漂洗液2包括75%乙醇；
洗脱液，所述洗脱液包括10±1mM Tris。
可选的，所述提取试剂盒包括以下组分：
裂解液，所述裂解液包括50mM Tris、100mM氯化钠、200mM磷酸钠、1~5% N-月桂酰肌氨酸钠、20mg/ml蛋白酶K；
DNA助提剂，所述DNA助提剂包括1~3 M异硫氰酸胍或盐酸胍、50mM Tris、25mM氯化钠、0.8% TritonX-100、25mM EDTA、45~50%异丙醇；
漂洗液1，所述漂洗液1包括1~3 M异硫氰酸胍或盐酸胍、50mM Tris、25mM氯化钠；
漂洗液2，所述漂洗液2包括75%乙醇；
洗脱液，所述洗脱液包括10mM Tris。
可选的，所述提取试剂盒各组分中Tris溶液的pH为7.5~8.5；和/或，
所述EDTA溶液的pH为7.5~8.5。
可选的，还包括大粒径磁珠，所述大粒径磁珠的加入量为20~60μl。
可选的，所述大粒径磁珠的粒径为300nm~1μm。
可选的，所述大粒径磁珠的粒径为500nm~700nm。
根据本申请的另一个方面，提供了一种利用任一项上述的细菌中高分子量DNA提取试剂盒进行DNA提取的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）样本裂解：向菌液样本中加入裂解液，轻柔混合均匀后静置孵育；
（2）析出DNA：继续加入DNA助提剂，轻柔混合均匀；
（3）磁珠结合：加入磁珠后轻柔混合均匀，放置于磁力架上静置，吸弃上清获得结合有DNA的磁珠；
（4）一次漂洗DNA：继续加入漂洗液1，轻柔混合均匀后放置于磁力架上静置，吸弃上清；
（5）二次漂洗DNA：继续加入漂洗液2，轻柔混合均匀后放置于磁力架上静置，吸弃上清；
（6）洗脱DNA：继续加入洗脱液，轻柔混合均匀孵育处理，放置于磁力架上静置后吸取上清，即提取得到含有DNA的上清液。
可选的，所述步骤中轻柔混合均匀的方式为使用枪头按照顺时针或逆时针方向旋转3~7圈。
可选的，所述步骤（1）中孵育条件为60~70℃孵育5~15min；和/或，
所述步骤（6）中孵育条件为65~75℃孵育3~7min。
可选的，对于非革兰氏阴性菌所述步骤（1）之前还包括向菌液样本中添加溶菌酶进行孵育处理的步骤。
本申请的有益效果包括但不限于：
1.本发明中特殊的裂解液和DNA助提剂等缓冲液，可以迅速破坏细菌的细胞壁以达到渗透并溶解细胞的目的，可以最大效率释放HMW DNA；裂解液与其他缓冲体系的协同作用保证了提取的HMW DNA的完整性。
2.本发明方法中的混匀方式采取按照顺时针搅拌5圈的方法，保证了HMW DNA不受震荡离心等剪切力的影响，从而保证其具有完整性。
3.本发明中裂解液等缓冲体系与提取方法的搭配，可直接提取菌液沉淀，无需将菌液进行包埋处理，大大缩短了提取流程与时间，增加了HMW DNA的提取效率，保证了HMWDNA的完整性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1.本申请测试例一涉及的HMW DNA脉冲场凝胶电泳图；
图2.本申请实验例一涉及的普通凝胶电泳图；
图3.本申请实验例二涉及的琼脂糖凝胶电泳图；
图4.本申请实验例三涉及的琼脂糖凝胶电泳图；
图5.本申请实验例五涉及的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例，除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。
鉴于背景技术中提到的现有技术所存在的问题，为此本发明提供了下述方案，具体的提供了磁珠法细菌中高分子量（HMW）DNA的提取试剂盒以及提取方法，可以在日常实验室条件下进行高效、快速、完整的提取细菌微生物中的HMW DNA，具有提取纯度高、提取量高的优点，且提取过程安全快速、简单方便。
本发明提供的细菌高分子量（HMW）DNA提取试剂盒的组成为：裂解液包括50mMTris，pH=8.0、100mM氯化钠、200mM磷酸钠、1~5% N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）、20mg/ml蛋白酶K；DNA助提剂包括1~3M异硫氰酸胍或盐酸胍、50mM Tris，pH=8.0、25mM氯化钠、0.8%TritonX-100、25mM EDTA，pH=8.0、50%异丙醇；大粒径纯化磁珠的加入量为20~60 μl；漂洗液1包括1~3M异硫氰酸胍或盐酸胍、50mM Tris，pH=8.0、25mM氯化钠；漂洗液2包括75%乙醇；洗脱液包括10mM Tris，pH=8.0。
本发明提供的提取试剂盒中，采用特殊搭配的裂解液，可以迅速破坏细菌的细胞壁以达到渗透并溶解细胞的目的，可以最大效率释放HMW DNA，而DNA助提剂可以在裂解液裂解完细胞后，进一步有效去除裂解后产生的可溶性蛋白、多糖等杂质，漂洗液1有效去除样本中残留的蛋白、多酚等杂质，漂洗液2最后去除残留的胍盐等杂质，本发明提供的提取试剂盒中裂解液与其他缓冲体系的协同作用下，保证了所提取的HMW DNA的完整性以及高纯度、高浓度，适合应用于三代测序。
另外本发明提供的提取试剂盒中采用大粒径纯化磁珠，具体的为经过羟基特殊修饰的500 nm大粒径纯化磁珠，可以有效吸附HMW DNA，而不会吸附细菌裂解后产生的蛋白质沉淀，保证了HMW DNA的纯度与得率，具有高度的可操作性和普适性，并因此后续可以通过研究搭配合适的提取仪对样本进行高通量提取，为HMW DNA的提取提供了更方便、快速、简单和可靠的方法。
本发明提供了用于提取细菌中的HMW DNA的方法，采用上述的试剂盒并具体操作如下：
（1）样本前处理：收集1~3ml 菌液（根据菌液浓度确定最佳体积）到2 ml 离心管中，8000 rpm离心1 min，尽可能弃掉上清，保留菌体沉淀；将溶菌酶干粉全部转移至溶菌酶缓冲液中，颠倒混匀。每个样本加入250 µl（20 mg/ml）溶菌酶缓冲液，37℃静置孵育30 min（革兰氏阴性菌无需使用溶菌酶孵育）；
（2）样本裂解：加入350 µl 裂解液，使用枪头按照顺时针方向旋转5圈，65℃静置孵育10 min，孵育结束后溶液变得清亮且粘稠（注意此步骤震荡一定要轻柔，否则会使HMWDNA断裂）；
（3）析出HMW DNA：加入500 µl DNA助提剂，用枪头按照顺时针方向旋转5圈（注意此步骤一定要轻柔，否则会使HMW DNA断裂）；
（4）磁珠结合HMW DNA：加入30 µl 纯化磁珠，轻柔的上下颠倒混匀离心管，室温放置10 min，期间每隔2-3分钟颠倒混匀（注意动作轻柔）；将离心管放在磁力架上静置2 min，吸弃上清，从磁力架上移开离心管；
（5）漂洗HMW DNA：将离心管中加入500 µl 漂洗液1，轻柔的上下颠倒混匀后，放在磁力架上静置2 min，吸弃上清，从磁力架上移开离心管；将离心管中加入500 µl 漂洗液2，轻柔的上下颠倒混匀后，放在磁力架上静置2 min，吸弃上清，从磁力架上移开离心管；重复步骤以上一次；室温开盖干燥5 min，直到磁珠表面无明显镜面反射；
（6）洗脱HMW DNA：加入100 µl 洗脱液，轻柔的上下颠倒混匀后，70℃ 孵育5 min，注意需要每隔2~3分钟轻柔的上下颠倒混匀，放在磁力架上静置2 min，然后将上清转移至新的1.5 ml 离心管中，即可得到所需的HMW DNA。
本发明方法中，借助于裂解液较强的提取效果，得以能够采用轻柔的混匀方式，如此既能保证较好的DNA完整性，又能保证较高的提取浓度，具体的混匀方式可以采取按照顺时针搅拌5圈的方法，有效保证了HMW DNA不受震荡离心等剪切力的影响，从而保证其具有完整性。另外，本发明中裂解液等缓冲体系与提取方法的搭配，可直接提取菌液沉淀，无需将菌液进行包埋处理，大大缩短了提取流程与时间，增加了HMW DNA的提取效率，保证了HMWDNA的完整性。
本发明具体实施方式中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明具体实施方式中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南（第三版）；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
下面通过具体的实施例、试验例以及测试例对本发明的方案进行具体说明。
实施例一 大粒径纯化磁珠的制备
在本实施例中，大粒径纯化磁珠的制备步骤包括磁核合成、磁珠合成和洗涤与后处理，具体包括以下步骤：
（1）磁核合成：磁核合成步骤为将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O(摩尔比2:1)装入三颈烧瓶，溶解在100 ml 无离子水中，然后当温度升至40℃后缓慢滴入浓氨水搅拌30 min，然后，使用永磁磁场收集Fe3O4纳米颗粒，用水冲洗去除未反应的氨，整个过程中都使用了氮气，以防止颗粒氧化；
（2）磁珠合成：磁珠合成步骤为将正硅酸四乙酯加入到氢氧化铵和分散的Fe3O4与乙醇溶液中制备了Fe3O4/SiO2纳米复合材料，通常，将1.0 g的Fe3O4纳米颗粒加入到50 ml水/乙醇(1：10)溶液中，将正硅酸乙酯溶液(1 ml正硅酸乙酯在49 ml无水乙醇中)一滴一滴地加入到剧烈搅拌的溶液中，滴加完成后持续反应4.0 h；
（3）洗涤与后处理：洗涤与后处理为将得到的黑色磁珠用去离子水洗涤3次，然后将浓度标定为100 mg/ml即可得到大粒径纯化磁珠。
实施例二 高分子量DNA提取试剂盒
在本实施例中，高分子量DNA提取试剂盒包括裂解液、DNA助提剂、漂洗液、纯化磁珠、洗脱液1和洗脱液2；
其中，裂解液包括50 mM Tris，pH=8.0、100 mM氯化钠、200 mM磷酸钠、2% N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）、20 mg/ml蛋白酶K；
DNA助提剂包括3M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠、0.8% TritonX-100、25 mM EDTA（pH=8.0）、50%异丙醇；
纯化磁珠的加入量为20 μl；
漂洗液1包括2M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠；
漂洗液2包括75%乙醇；
洗脱液包括10 mM Tris（pH=8.0）。
实施例三 高分子量DNA提取试剂盒
在本实施例中，高分子量DNA提取试剂盒包括裂解液、DNA助提剂、漂洗液、纯化磁珠、洗脱液1和洗脱液2；
其中，裂解液包括45 mM Tris，pH=8.0、90 mM氯化钠、180 mM磷酸钠、5% N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）、18 mg/ml蛋白酶K；
DNA助提剂包括2M异硫氰酸胍、45mM Tris，pH=8.0、23 mM氯化钠、0.8% TritonX-100、23 mM EDTA（pH=8.0）、45%异丙醇；
纯化磁珠的加入量为40 μl；
漂洗液1包括3 M异硫氰酸胍、45 mM Tris，pH=8.0、23mM氯化钠；
漂洗液2包括75%乙醇；
洗脱液包括9 mM Tris（pH=8.0）。
实施例四 高分子量DNA提取试剂盒
在本实施例中，高分子量DNA提取试剂盒包括裂解液、DNA助提剂、漂洗液、纯化磁珠、洗脱液1和洗脱液2；
其中，裂解液包括55 mM Tris，pH=8.0、110 mM氯化钠、220 mM磷酸钠、1% N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）、22 mg/ml蛋白酶K；
DNA助提剂包括1M盐酸胍、55mM Tris，pH=8.0、27 mM氯化钠、0.8% TritonX-100、27mM EDTA（pH=8.0）、55%异丙醇；
大粒径纯化磁珠的加入量为60μl；
漂洗液1包括1M盐酸胍、55 mM Tris，pH=8.0、27 mM氯化钠；
漂洗液2包括75%乙醇；
洗脱液包括11 mM Tris（pH=8.0）。
实施例五 高分子量DNA提取方法
在本实施例中，高分子量DNA提取方法采用实施例二中的高分子量DNA提取试剂盒，所使用大粒径纯化磁珠均按照实施例一中制备方法制备获得，具体包括以下步骤：
（1）样本前处理：收集或富集1~3ml 菌液（实际操作过程中，操作人员可以根据菌液浓度确定最佳体积）到2 ml 离心管中，8000 rpm离心1 min，尽可能弃掉上清，保留菌体沉淀；将溶菌酶干粉全部转移至溶菌酶缓冲液中，使用移液器吹洗混匀。每个样本加入250µl（20 mg/ml）溶菌酶缓冲液，37℃静置孵育30 min（若为革兰氏阴性菌，则无需使用溶菌酶孵育）；
（2）样本裂解：加入350 µl 裂解液，使用枪头按照顺时针方向旋转5圈，65℃静置孵育10 min，孵育结束后溶液变得清亮且粘稠（注意此步骤混匀一定要轻柔，否则会使HMWDNA断裂）；
（3）析出HMW DNA：加入500 µl DNA助提剂，用枪头按照顺时针方向旋转5圈（注意此步骤震荡一定要轻柔，否则会使HMW DNA断裂）；
（4）磁珠结合HMW DNA：加入30 µl 纯化磁珠，轻柔地上下颠倒混匀离心管，室温放置10 min，期间每隔2-3分钟颠倒混匀；将离心管放在磁力架上静置2 min，吸弃上清，从磁力架上移开离心管；
（5）漂洗HMW DNA：将离心管中加入500 µl 漂洗液1，颠倒混匀后，放在磁力架上静置2 min，吸弃上清，从磁力架上移开离心管；将离心管中加入500 µl 漂洗液2，颠倒混匀后，放在磁力架上静置2 min，吸弃上清，从磁力架上移开离心管；重复步骤以上一次；室温开盖干燥5 min，直到磁珠表面无明显镜面反射；
（6）洗脱HMW DNA：加入100 µl 洗脱液，颠倒混匀后，70℃ 孵育5 min。
注意每隔2-3分钟颠倒混匀，放在磁力架上静置2 min，将上清转移至新的1.5 ml离心管中，然后将提取获得的HMW DNA进行0.8%琼脂糖凝胶电泳和脉冲场电泳进行质量检测。
测试例一 Nanodrop浓度与质量测定
本测试例中所使用的样本为大肠杆菌和短双歧杆菌，其中大肠杆菌设三组，编号分别为E1、E2、E3，短双歧杆菌设有三组，编号分别为B1、B2、B3。利用实施例二中的提取试剂盒并采用实施例三中的操作步骤提取获得HMW DNA，并对所获得的HMW DNA进行纯度和浓度的检测，检测步骤包括以下步骤。
分别取2μL提取获得的HMW DNA，用Nanodrop检测DNA的浓度和纯度；再分别用3μL提取获得的HMW DNA，加入1.5μL 6×Loading Dye，Lambda LadderPFG Marker(购买自上海一研生物科技有限公司)为脉冲场电泳参照M1。脉冲场电泳条件为冷凝机预设温度为14℃，泵速为1L/min，电压为120V电泳12h，实验结果分别见表1和图1。
表1 大肠杆菌、短双歧杆菌HMW DNA浓度（Nanodrop）的测定结果
由上述表格中的浓度可以看出，提取大肠杆菌和短双歧杆菌中的HMW DNA时，三个平行的提取结果基本一致，然后将以上各取两个平行样本进行琼脂糖凝胶电泳和脉冲场电泳，结果如图1中的脉冲场凝胶电泳图所示。Nanodrop测定中显示A260/A280均在1.8-2.0之间，说明提取结果无蛋白残留，DNA纯度较好，而由于琼脂糖凝胶电泳的分辨范围仅在0.2-20 Kb，无法分离辨别HMW DNA，故还需进行脉冲场电泳，脉冲场电泳的分辨上限可达2 Mb，由图1中的脉冲场电泳可以看出本试剂盒提取出的HMW DNA片段分子量高，大约在50~340kb范围内，可见DNA片段的完整性非常好。
实验例一 纯化磁珠粒径的影响
在本实验例中，对市场上已有的不同粒径大小（100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm）的纯化磁珠进行筛选，高分子量DNA提取试剂盒包括裂解液、DNA助提剂、漂洗液、纯化磁珠、洗脱液1和洗脱液2；
其中，裂解液包括50 mM Tris，pH=8.0、100 mM氯化钠、200 mM磷酸钠、2% N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）、20 mg/ml蛋白酶K；
DNA助提剂包括3M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠、0.8% TritonX-100、25 mM EDTA（pH=8.0）、50%异丙醇；
纯化磁珠的加入量为20 μl；
漂洗液1包括2M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠；
漂洗液2包括75%乙醇；
洗脱液包括10 mM Tris（pH=8.0）。
使用实施例五中的高分子量DNA提取方法。
一般来说，磁珠粒径越大，表面积就越大，结合的DNA片段可能会更长，磁珠粒径的大小并不是唯一影响DNA片段结合长度的因素，还受到其他因素的影响，如磁珠表面的化学修饰、结合缓冲液的离子浓度和pH值等。然而磁珠粒径的大小也对DNA的提取过程影响较大，一方面，较大的磁珠粒径可能会导致更多的DNA结合在磁珠表面，从而增加提取的DNA量；另一方面，过大的磁珠粒径可能会限制DNA片段的结合和释放，从而影响提取的效率和纯度，所以选择合适粒径大小的磁珠对HMW DNA的提取有至关重要的作用。
在本试验例中，为防止脉冲场电泳时15kb左右的DNA会随着迁移时间的增大而逐渐跑出凝胶范围外，故使用普通凝胶进行结果比对，使用Nanodrop测A260/A280，OD值均在1.8~2.0范围内，无蛋白残留，可继续进行普通凝胶电泳。
普通凝胶电泳结果如图2所示，图2中序号1~10的磁珠粒径分别为100nm、200nm、300nm、100nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm，由图2可以看出，由于磁珠粒径的不同，磁珠结合HMW DNA的量均有所不同，胶图结果显示当磁珠粒径在100~200nm时，磁珠会不仅会吸附少量的HMW DNA，也会吸附15kb左右的gDNA，磁珠粒径在300nm~1μm时，配合提取方法，吸附到大量的HMW DNA，其中，磁珠粒径为500~700nm吸附到的HMW DNA浓度比其他粒径磁珠吸附的浓度更高，从胶图中也可看出此时的条带更亮。
实验例二 十二烷基硫酸钠与N-月桂酰肌氨酸钠的对比
在本实验例中，发明人对比了使用十二烷基硫酸钠与N-月桂酰肌氨酸钠的裂解液的提取效果，对比的对象为提取试剂盒样本1（N-月桂酰肌氨酸钠 SLS组）与提取试剂盒样本2（十二烷基硫酸钠 SDS组）。
其中，提取试剂盒1的组成为：裂解液包括50 mM Tris，pH=8.0、100 mM氯化钠、200mM磷酸钠、2% N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）、20 mg/ml蛋白酶K；DNA助提剂包括3 M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠、0.8% TritonX-100、 25 mM EDTA，pH=8.0、50%异丙醇；大粒径纯化磁珠的加入量为30 μl；漂洗液1包括3 M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25mM氯化钠；漂洗液2包括75%乙醇；洗脱液包括10 mM Tris，pH=8.0。
其中，提取试剂盒2的组成为：裂解液包括50 mM Tris，pH=8.0、100 mM氯化钠、200mM磷酸钠、2% 十二烷基硫酸钠（SDS）、20 mg/ml蛋白酶K；DNA助提剂包括3 M异硫氰酸胍、50mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠、0.8% TritonX-100、 25 mM EDTA，pH=8.0；大粒径纯化磁珠的加入量为30 μl；漂洗液1包括3 M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠；漂洗液2包括75%乙醇；洗脱液包括10 mM Tris，pH=8.0。
高分子量DNA提取方法均按照实施例三中的步骤分别使用提取试剂盒样本1和提取试剂盒样本2进行高分子量DNA的提取。为防止脉冲场电泳时15kb左右的DNA会随着迁移时间的增大而逐渐跑出凝胶范围外，故使用普通凝胶进行结果比对（跑胶前需要用Nanodrop测A260/A280，若OD值在1.8~2.0范围内，说明无蛋白残留，可继续进行普通凝胶电泳）。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，由图3琼脂糖凝胶电泳可以看出，使用2%浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）的裂解液进行提取虽然也会提取出部分HMW DNA，但是更多得到的是15kb左右的基因组DNA；而使用2%浓度N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）作为裂解液进行提取得到绝大部分的HMW DNA，因此在胶图中显示出在胶孔处无法被分离的状态。
实验例三 提取方法中混匀方式的对比
在本实验例中，发明人对比了提取方法中两种混匀方式对提取效果的影响，两种混匀方式一种为实施例三中的混匀方式，另一种为将步骤（2）裂解过程中的“枪头按照顺时针方向旋转5圈”、其他步骤中的“上下颠倒”的轻柔混匀方式替换成，裂解过程中“震荡混匀”、其他步骤中的“震荡混匀”的震荡混匀方式。
两种提取方式所使用的提取试剂盒相同，均为以下提取试剂盒组成：裂解液包括50 mM Tris，pH=8.0、100 mM氯化钠、200 mM磷酸钠、2% N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）、20 mg/ml蛋白酶K；DNA助提剂包括3 M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠、0.8%TritonX-100、 25 mM EDTA，pH=8.0、50%异丙醇；磁珠的加入量为30 μl；漂洗液1包括3 M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠；漂洗液2包括75%乙醇；洗脱液包括10 mMTris，pH=8.0。
为防止脉冲场电泳时15kb左右的DNA会随着迁移时间的增大而逐渐跑出凝胶范围外，故使用普通凝胶进行结果比对（跑胶前需要用Nanodrop测A260/A280，若OD值在1.8~2.0范围内，说明无蛋白残留，可继续进行普通凝胶电泳）。由图4琼脂糖凝胶电泳可以看出，由于混匀方式的不同，使得HMW DNA所受的剪切力不同，结果显示震荡混匀更多得到的是15kb左右的基因组DNA，而使用轻柔混匀方式提取得到绝大部分的HMW DNA，因此在胶图中显示出在胶孔处无法被分离的状态。
实验例四 多因素多水平正交实验
在本实验例中，发明人通过设计多因素多水平正交实验，研究了不同浓度裂解液中的N-月桂酰肌氨酸钠、DNA助提剂中的异硫氰酸胍、漂洗液1中的异硫氰酸胍以及纯化过程中的磁珠添加量对提取效果的影响。
多因素多水平正交实验中，裂解液为1~5% N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）；DNA助提剂为1~3 M异硫氰酸胍；漂洗液1为1~3 M异硫氰酸胍；大粒径纯化磁珠的加入量为20~60 μl。根据以上不同因素，设计不同水平，参照表2。本实验例设计四因素五水平正交实验，正交实验排列见表3。根据实施案例三中的提取步骤对大肠杆菌进行提取，将提取结果进行Nanodrop测定，浓度结果见表4。
表2 四因素五水平实验
表3 四因素五水平正交实验表
表4 四因素五水平实验Nanodrop结果
通过以上25个四因素五水平的正交实验Nanodrop结果来看，其中10号实验组合和16号实验组合的HMW DNA浓度超过100 ng/μl，洗脱体积为100μl即总量超过10μg，提取浓度和提取量效果最好。发明人进一步对比了10号组合和16号组合的A260/A280结果，发现其中10号组合的A260/A280为1.912，而16号组合的A260/A280为1.535，可见10号组合的提取纯度更高，而16号组合存在蛋白污染，由此发明人确定了提取试剂盒中最佳比例组合为裂解液中N-月桂酰肌氨酸钠的配制浓度为2%，DNA助提剂中异硫氰酸胍的配制浓度为3M，漂洗液1中异硫氰酸胍的配制浓度为2M，以及大粒径纯化磁珠的加入量为20μl。
实验例五 本发明试剂盒与现有技术的比对
现有技术专利CN111996190 A和CN114934041 A同样公开了DNA提取试剂盒，然而其并非高分子量DNA提取试剂盒，具体的，两个专利的裂解液中同样使用 N-月桂酰肌氨酸钠这一成分，CN 111996190 A裂解液包含包含异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸钠、盐酸胍、蛋白酶k和Tween20；CN 114934041 A裂解液包含氯化钾、异硫氰酸胍、EDTA、N-月桂酰肌氨酸钠、Tris和无水乙醇；另选用市售天根磁珠法基因组提取试剂盒作为比对（货号：DP705-01）将以上两种裂解液和市售天根试剂盒与本发明同时提取大肠杆菌进行比对。
本发明试剂裂解液包含50 mM Tris，pH=8.0、100 mM氯化钠、200 mM磷酸钠、2% N-月桂酰肌氨酸钠（SLS）、20 mg/ml蛋白酶K；DNA助提剂包括3M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠、0.8% TritonX-100、25 mM EDTA（pH=8.0）、50%异丙醇；纯化磁珠的加入量为20 μl；漂洗液1包括2M异硫氰酸胍、50 mM Tris，pH=8.0、25 mM氯化钠；漂洗液2包括75%乙醇；洗脱液包括10 mM Tris（pH=8.0）。
琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，图5中序号1~8含义分别为：1~2为CN 111996190A裂解液，3~4为CN 114934041 A裂解液，5~6为市售天根试剂盒，7~8为本发明试剂，由图5结果可以看出，使用相同提取方法（包含混匀方式）进行提取后，CN 111996190 A和CN114934041 A只能提取出15kb左右的gDNA，而HMW DNA没有被成功提取出来，原因可能在于CN 111996190 A和CN 114934041 A的裂解液中除了N-月桂酰肌氨酸钠成分外，还加入了盐酸胍或异硫氰酸胍，导致对细胞的裂解能力变强，即使使用相同的提取方法，由于化学环境的改变，导致无法提取出HMW DNA，并且上述结果与其专利中的结果吻合；而市售天根试剂盒虽然也可以提出部分HMW DNA，但是量很少，并且提取出的大部分是15kb左右的gDNA，无论是质量还是数量都非常差。
可见，本发明中提供的裂解液和DNA助提剂等缓冲液，可以迅速破坏细菌的细胞壁以达到渗透并溶解细胞的目的，可以最大效率释放HMW DNA，并且其中裂解液与其他缓冲体系的协同作用保证了提取的HMW DNA的完整性。本发明方法中的混匀方式采取轻柔的提取方式，具体的按照顺时针搅拌5圈的方法，保证了HMW DNA不受震荡离心等剪切力的影响，从而保证其具有完整性，并且配合试剂盒，还能够提取数量足够多的HMW DNA。
而现有技术中的试剂盒，即便使用本试剂盒的提取方法进行提取，也无法获得质量高的HMW DNA，并且本发明的方案不止于提取到HMW DNA，还能保证提取到高质量HMW DNA的同时，获得的HMW DNA数量也更多，本发明提供的方案为HMW DNA提取这一技术领域提供了新的方向和解决方案，能够广泛应用于三代测序并促进三代测序的发展和应用。
本发明中裂解液等缓冲体系与提取方法的搭配，可直接提取菌液沉淀，无需将菌液进行包埋处理，大大缩短了提取流程与时间，增加了HMW DNA的提取效率，保证了HMW DNA的完整性。本发明所提供的磁珠法细菌中高分子量（HMW）DNA提取试剂盒以及提取方法，可广泛应用于二代测序，尤其是三代测序，解决了HMW DNA提取困难、通量低的问题，具有广阔的市场前景和巨大的经济价值。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种细菌中高分子量DNA提取试剂盒，其特征在于，所述提取试剂盒包括以下组分：
裂解液，所述裂解液包括50±5 mM Tris、100±10 mM氯化钠、200±20mM磷酸钠、1~5%N-月桂酰肌氨酸钠、20±2 mg/ml蛋白酶K；
DNA助提剂，所述DNA助提剂包括1~3 M异硫氰酸胍或盐酸胍、50±5mM Tris、25±2mM氯化钠、0.6~1.0% TritonX-100、25±2mM EDTA、45~55%异丙醇；
漂洗液1，所述漂洗液1包括1~3 M异硫氰酸胍或盐酸胍、50±5mM Tris、25±2mM氯化钠；
漂洗液2，所述漂洗液2包括75~80%乙醇；
洗脱液，所述洗脱液包括10±1mM Tris。
2.根据权利要求1所述的细菌中高分子量DNA提取试剂盒，其特征在于，所述提取试剂盒包括以下组分：
裂解液，所述裂解液包括50mM Tris、100mM氯化钠、200mM磷酸钠、1~5% N-月桂酰肌氨酸钠、20mg/ml蛋白酶K；
DNA助提剂，所述DNA助提剂包括1~3 M异硫氰酸胍或盐酸胍、50mM Tris、25mM氯化钠、0.8% TritonX-100、25mM EDTA、45~50%异丙醇；
漂洗液1，所述漂洗液1包括1~3 M异硫氰酸胍或盐酸胍、50mM Tris、25mM氯化钠；
漂洗液2，所述漂洗液2包括75%乙醇；
洗脱液，所述洗脱液包括10mM Tris。
3.根据权利要求1或2所述的细菌中高分子量DNA提取试剂盒，其特征在于，所述提取试剂盒各组分中Tris溶液的pH为7.5~8.5；和/或，
所述EDTA溶液的pH为7.5~8.5。
4.根据权利要求1或2所述的细菌中高分子量DNA提取试剂盒，其特征在于，还包括大粒径磁珠，所述大粒径磁珠的加入量为20~60μl。
5.根据权利要求4所述的细菌中高分子量DNA提取试剂盒，其特征在于，所述大粒径磁珠的粒径为300nm~1μm。
6.根据权利要求5所述的细菌中高分子量DNA提取试剂盒，其特征在于，所述大粒径磁珠的粒径为500nm~700nm。
7.一种利用如权利要求1~6任一项所述的细菌中高分子量DNA提取试剂盒进行DNA提取的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）样本裂解：向菌液样本中加入裂解液，轻柔混合均匀后静置孵育；
（2）析出DNA：继续加入DNA助提剂，轻柔混合均匀；
（3）磁珠结合：加入磁珠后轻柔混合均匀，放置于磁力架上静置，吸弃上清获得结合有DNA的磁珠；
（4）一次漂洗DNA：继续加入漂洗液1，轻柔混合均匀后放置于磁力架上静置，吸弃上清；
（5）二次漂洗DNA：继续加入漂洗液2，轻柔混合均匀后放置于磁力架上静置，吸弃上清；
（6）洗脱DNA：继续加入洗脱液，轻柔混合均匀孵育处理，放置于磁力架上静置后吸取上清，即提取得到含有DNA的上清液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤中轻柔混合均匀的方式为使用枪头按照顺时针或逆时针方向旋转3~7圈。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中孵育条件为60~70℃孵育5~15min；和/或，
所述步骤（6）中孵育条件为65~75℃孵育3~7min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对于非革兰氏阴性菌所述步骤（1）之前还包括向菌液样本中添加溶菌酶进行孵育处理的步骤。
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