CN116376894A - 一种基于磁珠技术提取血液基因组dna的试剂盒及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒及其提取方法，包括裂解液、磁珠、磁珠漂洗液和DNA洗脱液，所述裂解液包括Tris‑HCl、EDTA、NaCl、SDS和蛋白酶K，所述磁珠为单分散磁性微球，所述磁珠漂洗液为乙醇溶液，所述DNA洗脱液为Tris‑HCl溶液。本发明优点在于：本发明的试剂盒产品避免了常规溶血红细胞等常规步骤，利用自主研发的高效能裂解液直接对全血进行裂解的方式，通过磁吸，漂洗，洗脱等步骤获得基因组DNA，该试剂盒具有操作简单、效率高、成本低等优点，能够满足后续如PCR扩增或基因诊断等操作，且本试剂盒不使用氯仿、苯酚等有机溶剂，安全无毒，可大大降低对操作者的身体伤害。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，尤其涉及一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
背景技术
血液中只要有细胞核的细胞都可以用来检测dna，通常是提取白细胞中的DNA进行检测，基因组是指细胞中一套完整单倍体的遗传物质的总和；基因组dna含有细胞中全部的遗传信息；从全血中提取DNA是遗传性疾病、胎儿产前无创诊断、肿瘤和传染性疾病等的早期确诊的重要手段和技术，DNA提取的质量和产量直接影响PCR扩增、分子克隆和限制性内切酶的酶切反应等实验的成败；血液基因组DNA的提取和纯化的一步方法步骤为：破碎红细胞、离心沉淀白细胞、裂解白细胞、沉淀去蛋白、分离和纯化DNA；
苯酚提取是基因组dna提取较传统的方法，苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制DNA酶的降解作用；用苯酚处理匀浆液时，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相；离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，用乙醇沉淀DNA；然而，苯酚能溶解10％-15％的水，从而溶解一部分DNA，造成部分DNA被损失；此外，苯酚不能完全抑制DNase的活性，导致部分DNA被降解；并且这种方法非常耗时，且不便于自动化转化，试剂可能有毒并危及健康；
硅胶膜离心吸附柱法也是常见的基因组dna提取的方法之一，通过裂解液迅速裂解细胞，然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱，但提取的gDNA容易产生拖尾，表明纯度不高，或有降解的产生，同样不适合自动化及大规模提取；
磁珠法是近年来新兴的一种核酸提取方法，磁珠法是通过裂解液裂解血液，从样本中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中；将携带核酸的磁珠移动至不同的试剂槽内，通过反复快速搅拌、混匀液体，经过细胞裂解、核酸吸附、洗涤与洗脱等步骤，最终得到纯净的核酸；
磁珠法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在：1、能够实现自动化、高通量操作，配合96孔的核酸自动提取仪，在以往做一个样品的提取时间内可同时实现对96个样品的处理，效率直接提高96倍，满足了当前生物学高通量操作的要求，使得在大规模疫情爆发时能够进行快速筛查原因，这个优点是其他方法难以赶超的；2、操作简单、用时短，整个提取流程只有裂解、结合、洗涤、洗脱四步短时间内即可完成；3、安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害少，保护了实验人员的身体健康；4、磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大；5、灵敏度高，在微量的血液样本中也能高效提取全基因组DNA，是未来核酸提取发展的重要方向；
当前，生物医疗等研究领域每个项目需要处理的DNA样品数量就可以达到万级，为更有效的配合磁珠法使用，亟需一种基于磁珠的高效、便捷、可靠、高通量的提取血液全基因组DNA的方法。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒及其提取方法，解决了常用方法中溶血素、苯酚等有害溶剂对人体危害的问题，提供的磁珠法核酸提取方法大大缩短提取时间，避免了繁琐的步骤，节约了时间和生产成本，且提取的基因组DNA纯度高，以解决背景技术中提出的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒及其提取方法，包括裂解液、磁珠、磁珠漂洗液和DNA洗脱液，所述裂解液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS和蛋白酶K，所述磁珠为单分散磁性微球，所述磁珠漂洗液为乙醇溶液，所述DNA洗脱液为Tris-HCl溶液。
优选地，述裂解液中Tris-HCl的浓度为20-50mmol/L，pH为7.0-8.0)，EDTA浓度为5-20mmol/L，NaCl浓度为0.6-2.0mol/L，SDS体积分数为0.3％-1.5％，蛋白酶K浓度为100-200μg/mL。
优选地，所述磁珠为粒径为100-400nm的单分散磁性微球。
优选地，所述磁珠漂洗液中乙醇溶液的体积分数为80％。
优选地，所述DNA洗脱液中Tris-HCl浓度为10-30mmol/L，pH7.0-8.0。
优选地，一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
①取血液样品200μL，加入800-1000μL裂解液，室温振荡孵育；
②加入250-350μL异丙醇，20-25μL磁珠溶液，混合均匀后室温静置10-15min，期间每隔5min混匀振荡，磁力架放置2-3min，吸弃上清；
③加入1mL漂洗液漂洗，洗涤，吸干残余液体；
④开盖室温静置5-10min，加入40-50μL DNA洗脱液，吹打混匀后50℃静置5min；
⑤磁力架上放置3-5min，磁吸转移上清至一个新的无核酸酶管，低温保存。
优选地，所述步骤①中振荡孵育时间10-15min。
优选地，所述步骤③中洗涤次数为2-3次。
优选地，所述步骤⑤中低温保存温度为-20℃。
本发明的有益效果在于：
1、操作简便，无需对全血进行溶解红细胞等预处理，30min即可快速完成提取操作，操作简单、用时短，整个提取流程只有裂解、结合、洗涤、洗脱四步短时间内即可完成。
2、本试剂盒不使用氯仿、苯酚等有机溶剂，安全无毒，可大大降低对操作者的身体伤害；
3、能够实现自动化、高通量操作，配合96孔的核酸自动提取仪，在以往做一个样品的提取时间内可同时实现对96个样品的处理，效率大幅提高，满足当前生物学高通量操作的要求，使得在大规模疫情爆发时能够进行快速筛查原因，这个优点是其他方法难以赶超的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中提取的人类全血基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳条带图；
图2为本发明实施例2中利用提取的人类全血基因组DNA的内参ACTIN的qPCR的检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1：
本发明提供了一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒及其提取方法，包括裂解液、磁珠、磁珠漂洗液和DNA洗脱液，所述裂解液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS和蛋白酶K，所述磁珠为单分散磁性微球，所述磁珠漂洗液为乙醇溶液，所述DNA洗脱液为Tris-HCl溶液。
全血基因组DNA提取试剂盒中试剂的配制。
(1)裂解液：20mM Tris-HCl、5mM EDTA、0.6M NaCl与体积分数0.3％的SDS组成的混合溶液。具体配制方法：称取3.2g Tris-HCl、1mg蛋白酶K、1.46g EDTA和35g NaCl，加入800mL去离子水搅拌溶解，加入3mL SDS，继续加入去离子水定容至1L。
(2)磁珠漂洗液：体积分数为80％的乙醇溶液。具体配制方法：量取800mL无水乙醇加入300mL去离子水，混合均匀。
(3)DNA洗脱液：20mM的Tris-HCl溶液，pH值为7.8。具体配制方法：称取3.2g Tris-HCl加入去离子水定容至1L，浓盐酸调节pH值至8.0。
实施例2
使用实施例1中的试剂盒提取15份血液基因组DNA。
①取血液样品200μL，加入800-1000μL裂解液，室温振荡孵育10-15min。
②加入250-350μL异丙醇，20-25μL磁珠溶液，混合均匀后室温静置10-15min，期间每隔5min混匀振荡一下，磁力架放置2-3min，吸弃上清。
③加入1mL漂洗液漂洗，洗涤2-3次，吸干残余液体。
④开盖室温静置5-10min，加入40-50μL DNA洗脱液，吹打混匀后50℃静置5min。
⑤磁力架上放置3-5min，磁吸转移上清至一个新的无核酸酶管，-20℃保存。
⑥琼脂糖凝胶电泳检测：对所得15份DNA回收产物，分别取1μL上样，进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示所获得全基因组DNA产物条带清晰，无拖尾，表明提取的基因组DNA完整性好，且无其它DNA污染。
⑦OD值检测：对提取的15份基因组DNA核酸进行OD值检测；检测结果显示使用本方法对血液基因组DNA进行提取得到的DNA产物含量高且纯度良好。
Claims (9)
1.一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒，其特征在于：包括裂解液、磁珠、磁珠漂洗液和DNA洗脱液，所述裂解液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS和蛋白酶K，所述磁珠为单分散磁性微球，所述磁珠漂洗液为乙醇溶液，所述DNA洗脱液为Tris-HCl溶液。
2.如权利要求1所述的一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒，其特征在于：述裂解液中Tris-HCl的浓度为20-50mmol/L，pH为7.0-8.0)，EDTA浓度为5-20mmol/L，NaCl浓度为0.6-2.0mol/L，SDS体积分数为0.3％-1.5％，蛋白酶K浓度为100-200μg/mL。
3.如权利要求1所述的一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述磁珠为粒径为100-400nm的单分散磁性微球。
4.如权利要求1所述的一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述磁珠漂洗液中乙醇溶液的体积分数为80％。
5.如权利要求1所述的一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒，其特征在于：所述DNA洗脱液中Tris-HCl浓度为10-30mmol/L，pH7.0-8.0。
6.一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
①取血液样品200μL，加入800-1000μL裂解液，室温振荡孵育；
②加入250-350μL异丙醇，20-25μL磁珠溶液，混合均匀后室温静置10-15min，期间每隔5min混匀振荡，磁力架放置2-3min，吸弃上清；
③加入1mL漂洗液漂洗，洗涤，吸干残余液体；
④开盖室温静置5-10min，加入40-50μLDNA洗脱液，吹打混匀后50℃静置5min；
⑤磁力架上放置3-5min，磁吸转移上清至一个新的无核酸酶管，低温保存。
7.如权利要求6所述的一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法，其特征在于：所述步骤①中振荡孵育时间10-15min。
8.如权利要求6所述的一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法，其特征在于：所述步骤③中洗涤次数为2-3次。
9.如权利要求6所述的一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法，其特征在于：所述步骤⑤中低温保存温度为-20℃。
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