CN108070585A - 一种基于磁珠技术提取血液基因组dna的试剂盒及其方法 - Google Patents

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    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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Abstract

本发明公开了一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒及其方法，属于分子生物学领域。该试剂盒包括裂解液、红细胞裂解液、磁珠、磁珠漂洗液及DNA洗脱液五种成分。本发明试剂盒不包含有机溶剂，对全血细胞进行裂解后，通过磁珠吸附DNA分子，再通过漂洗去除杂质，最后对磁珠上的DNA分子进行洗脱，获得高质量的基因组DNA。该试剂盒具有操作简单快速、提取效率高、成本低廉等优点；提取的血液基因组DNA纯度高，能够满足后续如PCR扩增、基因测序等科研或临床诊断分析。

Description

一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒，可应用于不同物种的新鲜或冷冻抗凝血液DNA提取。本发明还涉及应用该试剂盒从血液样本中提取DNA的方法。
背景技术
血液是流动在心脏和血管内的不透明红色液体，主要成分为血浆和血细胞。全基因组DNA(genomic DNA)是遗传信息的载体，为单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部基因信息。从人体或动物的血液中提取高质量的DNA是基因检测、精准医疗及其他分子生物学研究的重要前提。血液DNA提取和纯化的一般程序为：破碎红细胞、离心沉淀白细胞、破碎白细胞、沉淀去蛋白、分离和纯化DNA。
酚/仿抽提沉淀法是DNA的经典提取方法，其标准程序是多次重复苯酚、氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的。该法提取的DNA纯度高，但操作步骤繁琐，工作量大，且提取效率低下，难以实现工业化应用。另外，酚、氯仿和异丙醇等有机溶剂易造成环境污染，同时有损操作者健康。
非有机溶剂提取法采用细胞裂解液使白细胞释放DNA，使用蛋白酶K、蛋白酶E和强碱(NaOH或KOH)等对蛋白质和RNA进行充分消化分解，在高盐的条件下用乙醇直接沉淀分离纯化DNA。该方法避免了使用有毒的有机溶剂，提取的DNA纯度较高，但其需要的血液样本量大，单独使用蛋白酶消化时间长，可能对白细胞裂解不充分，另外使用强碱对操作者健康不利，也会影响后续PCR扩增效率。此外，硅胶膜离心吸附柱法也较为常见，但提取的gDNA容易产生拖尾，表明纯度不高，或有降解的产生，同样不适合大规模使用。
近年来，磁珠法开始应用于不同体系DNA的提纯工作中。利用磁珠表面以共聚合及表面修饰等方式引入的活性基团和单克隆抗体，制备成带有磁性的亲和吸附剂。在生物样品与这些具有磁性作用的亲和吸附剂共同孵育时，目标分子能够迅速被磁珠捕获，在磁场作用下从液相中沉降下来，经过简单的洗涤，从而分离得到表面结合有目标分子的磁珠复合物。
磁珠法操作简单，在微量的血液样本中也能高效提取全基因组DNA，并且可以在微孔板中以自动化的方式进行，省时省力，同时减少有毒试剂的危害，相比传统的DNA提取方法，具备无法比拟的优势，是未来核酸提取发展的重要方向。当前，基因测序、精准医疗等研究领域单个项目需要处理的DNA样品数量就可以达到几万、几十万甚至上百万个，为更有效的配合磁珠法使用，研究人员迫切需求一种基于磁珠的高效、方便、可靠、高通量的提取血液全基因组DNA的方法。
发明内容
本发明提供一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，克服了现在常用方法中有害溶剂对人体危害的影响，省时省力，节约成本，且提取的基因组DNA纯度高。
在本发明的一方面，提供一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒，包含裂解液、红细胞裂解液、自研磁珠、磁珠漂洗液、DNA洗脱液；所述细胞裂解液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl及SDS；所述红细胞裂解液包括NH4Cl、KHCO3和Na2EDTA；所述磁珠为粒径1-2μm单分散磁性微球；所述磁珠漂洗液为乙醇溶液；所述DNA洗脱液为Tris-HCl。
优选的，所述的裂解液中Tris-HCl的浓度为50-100mmol/L(pH7.0-8.0)，EDTA浓度为10-20mmol/L，NaCl浓度为0.5-1.0mol/L，SDS体积分数为1.0-1.5％。
优选的，所述的红细胞裂解液中NH4Cl浓度为100-200mmol/L、KHCO3浓度为10-20mmol/L，Na2EDTA浓度为0.1-0.2mmol/L。
优选的，所述的磁珠漂洗液中乙醇溶液的体积分数为70％。
优选的，所述的DNA洗脱液中Tris-HCl浓度为10-20mmol/L(pH7.0-8.0)。
在本发明的另一方面，提供一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒的应用方法，包括以下步骤：
①取血液样品200μL，加红细胞裂解液400μL，混合均匀后室温静置1-3min，12000g离心1-3min，吸弃上清。
②在沉淀中加入100-200μL裂解液，混匀后60-70℃孵育10-15min。
③加入100-200μL磁珠溶液，混合均匀后室温静置5-10min，磁力架放置5-10min，吸弃上清。
④加入200-300μL磁珠漂洗液重悬磁珠核酸混合物，洗涤2-3次，吸干残余液体。
⑤开盖室温静置5-10min，加入20-50μL DNA洗脱液，吹打混匀后室温静置2-5min。
⑥磁力架上放置5-10min，转移上清至一个新的无核酸酶管，定量质检后备用或-20℃保存。
本发明技术方案的有益之处在于：
1.操作简单快速，无需对全血进行预处理，1h即可快速完成提取操作，大大缩短了全血基因组DNA提取时间；
2.本试剂盒不使用氯仿、苯酚等有机溶剂，可大幅降低对实验人员的身体伤害；
3.本试剂盒的提取方法可有效减少提取过程中核酸的损失，大大增加提取效率，基因组DNA产物纯度高，片段更完整。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为本发明实施例2中提取的人类全血基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳条带。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明发明内容，但不应理解为对该发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
全血基因组DNA提取试剂盒中试剂的配制。
(1)裂解液：50mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.5M NaCl与体积分数1％的SDS组成的混合溶液。具体配制方法：称取7.88g Tris-HCl、2.92g EDTA和29.22g NaCl，加入800mL去离子水搅拌溶解，加入10mL SDS，继续加入去离子水定容至1L。
(2)红细胞裂解液：100mM NH4Cl、10mM KHCO3和0.1mM Na2EDTA的混合溶液。具体配制方法：称取5.34g NH4Cl、1.0g KHCO3和0.03g Na2EDTA，加去离子水搅拌均匀，定容至1L。
(3)磁珠漂洗液：体积分数为70％的乙醇溶液。具体配制方法：量取700mL无水乙醇加入300mL去离子水，混合均匀。
(4)DNA洗脱液：10mM的Tris-HCl溶液，pH值为8.0。具体配制方法：称取1.58gTris-HCl加入去离子水定容至1L，浓盐酸调节pH值至8.0。
实施例2
使用实施例1中的试剂盒提取10份人类冷冻抗凝血液基因组DNA。
①取解冻的血液样品200μL，加红细胞裂解液400μL，混合均匀后室温静置1min，12000g离心2min，吸弃上清。
②在沉淀中加入100μL裂解液，混匀后70℃孵育10min。
③加入100μL磁珠溶液，混合均匀后室温静置5min，磁力架放置5min，吸弃上清。
④加入200μL磁珠漂洗液重悬磁珠核酸混合物，洗涤2次，吸干残余液体。
⑤开盖室温静置5min，加入50μL DNA洗脱液，吹打混匀后室温静置2min。
⑥磁力架上放置5min，转移上清至一个新的无核酸酶管，定量及质检后备用。
⑦琼脂糖凝胶电泳检测：对所得10份DNA回收产物，分别取2μL上样，进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示所获得全基因组DNA产物平行性好，条带清晰，无拖尾和杂带，表明提取的基因组DNA完整性好，且无其它DNA污染。
⑧OD值检测：使用超微量紫外-可见光分光光度计对10份基因组DNA回收产物进行了OD值检测。检测结果显示使用本方法对血液基因组DNA进行提取得到的DNA产物含量高且纯度良好。

Claims (6)

1.一种基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒包含裂解液、红细胞裂解液、磁珠、磁珠漂洗液及DNA洗脱液，其特征在于：
所述裂解液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS；
所述红细胞裂解液包括NH4Cl、KHCO3和Na2EDTA；
所述磁珠为粒径1-2μm单分散磁性微球；
所述磁珠漂洗液为乙醇溶液；
所述DNA洗脱液为Tris-HCl。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的裂解液中Tris-HCl的浓度为50-100mmol/L(pH7.0-8.0)，EDTA浓度为10-20mmol/L，NaCl浓度为0.5-1.0mol/L，SDS体积分数为1.0-1.5％。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的红细胞裂解液中NH4Cl浓度为100-200mmol/L、KHCO3浓度为10-20mmol/L，Na2EDTA浓度为0.1-0.2mmol/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的磁珠漂洗液中乙醇溶液的体积分数为70％。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的DNA洗脱液中Tris-HCl浓度为10-20mmol/L(pH7.0-8.0)。
6.一种使用如权利要求1-5中任一项所述的基于磁珠技术提取血液基因组DNA的试剂盒的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
①取血液样品200μL，加红细胞裂解液400μL，混合均匀后室温静置1-3min，12000g离心1-3min，吸弃上清。
②在沉淀中加入100-200μL裂解液，60-70℃孵育10-15min。
③加入100-200μL磁珠溶液，混合均匀后室温静置5-10min，磁力架放置5-10min，吸弃上清。
④加入200-300μL磁珠漂洗液重悬磁珠核酸混合物，洗涤2-3次，吸干残余液体。
⑤开盖室温静置5-10min，加入20-50μL DNA洗脱液，吹打混匀后室温静置2-5min。
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