CN109207474A - 一种外周血基因组dna快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种外周血基因组DNA快速提取方法，包括如下步骤：1）取100‑150μL血液样品，加入200‑250μL Lysis Buffer和20‑35μL Proteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，60℃放置10min，95℃放置10min，期间颠倒混匀数次；2）室温放置2‑5min后，12000rpm离心2min，取50μL左右上清；3）将90‑92μL磁珠加入至装有上述上清的PCR管中，轻轻吹打混匀6次，室温静置孵育5‑10min，将PCR管置于磁力架上3‑5min。本发明具有如下技术效果：1）本发明在整个DNA的提取过程中只涉及了3种试剂，且试剂使用量和样品需求量均较低，因此成本较低；2）整个提取过程耗时较短，每一个步骤简单明确，对PCR的扩增效果影响较小；3）通过实际项目验证，采用该方法提取的DNA，符合绝大部分PCR反应以及MassARRAY平台的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种外周血基因组DNA快速提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
目前外周血基因组DNA提取的常规方法有酚/氯仿法、碘化钾法，酚/氯仿法的DNA提取质量OD260/OD280为1.97左右，碘化钾法的DNA提取质量OD260/OD280为2.30左右。为了增加DNA的提取量和纯度，操作繁琐、成本和时间都会增加。
随着检测技术的不断发展，仪器本身的灵敏度增加，成本较低、操作简洁、耗时较短，并且所获得DNA能符合绝大部分平台的方法成为绝大部分基因检测行业者的首选。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术存在的问题，提供一种外周血基因组DNA快速提取方法。
本发明的技术方案如下：
一种外周血基因组DNA快速提取方法，包括如下步骤：
1)取100-150μL血液样品，加入200-250μL Lysis Buffer和20-35μL ProteinaseK的预混溶液，充分颠倒混匀。60℃放置10min，95℃放置10min，期间颠倒混匀数次。
2)室温放置2-5min后，12000rpm离心2min，取50μL左右上清。
3)将90-92μL磁珠加入至装有上述上清的PCR管中，轻轻吹打混匀6次，室温静置孵育5-10min，将PCR管置于磁力架上3-5min。
4)移除上清，将PCR管继续放置于磁力架上，向PCR管中加入300-350μL 75％乙醇溶液，静置30S。
5)移除上清，再向PCR管中加入300-350μL 75％乙醇溶液，静置30S后彻底移除上清(建议使用10μL移液器移除底部残留乙醇溶液)。
6)室温静置2-5min，使残留乙醇彻底挥发。
7)加入10-12μL的Nuclease free water，把PCR管从磁力架取下，轻轻吹打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2-3min；
8)将PCR管置于磁力架上2min；
9)用移液器吸取10-11μL上清液，转移到新的PCR管中，在反应管上标记样本编号。
本发明的方法中，主要包括如下创新点:
相对于现有的方法，省略了试剂且应用效果良好。现有的DNA提取一般采用试剂盒提取，试剂盒通常对应多种平台，因此试剂盒中包括的试剂种类较多，成本较高。本发明的方法专门针对MassARRAY平台，只涉及了4种试剂，成分十分简单并且成本低廉，针对性强。
本发明选用的试剂、仪器都是常见的实验用品，无需购买昂贵的试剂盒，在任何地方均能很好的开展，可重复性高。
本发明具有如下技术效果：
1)本发明在整个DNA的提取过程中只涉及了3种试剂，且试剂使用量和样品需求量均较低，因此成本较低；
2)整个提取过程耗时较短，每一个步骤简单明确，对PCR的扩增效果影响较小；
3)通过实际项目验证，采用该方法提取的DNA，符合绝大部分PCR反应以及MassARRAY平台的检测。
4)本方法是针对DNA纯度(OD260/OD280)在1.8左右的高效提取方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的方法。
实施例1
使用静脉采血的方式采集12个人的血液样品；
按照下列操作步骤，进行DNA的提取：
1)取100μL血液样品，加入200μL Lysis Buffer和20μLProteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀。60℃放置10min，95℃放置10min，期间颠倒混匀数次。
2)室温放置2min后，12000rpm离心2min，取50μL上清。
3)将90μL磁珠加入至装有上述上清的PCR管中，轻轻吹打混匀6次，室温静置孵育5min，将PCR管置于磁力架上3min。
4)移除上清，将PCR管继续放置于磁力架上，向PCR管中加入300μL 75％乙醇溶液，静置30S。
5)移除上清，再向PCR管中加入300μL 75％乙醇溶液，静置30S后彻底移除上清(建议使用10μL移液器移除底部残留乙醇溶液)。
6)室温静置2min，使残留乙醇彻底挥发。
7)加入10μL的Nuclease free water，把PCR管从磁力架取下，轻轻吹打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
8)将PCR管置于磁力架上2min；
9)用移液器吸取10μL上清液，转移到新的PCR管中，在反应管上标记样本编号。
获得12个DNA样本，分别标记1-12。
1-12号样本检测DNA质量，见表一的样本浓度和样本纯度；
12个样本统一使用MassARRAY平台进行检测，所使用的试剂和方法参考iplex Gold多重分型反应说明书。12个样本的检测结果，见表一的分型失败个数以及分型失败比率。
MassARRAY分型技术是建立在多重PCR反应的基础上，本次实施例是含有12个多重PCR反应的项目，正常情况下会存在一定程度的引物二聚体等情况，这均属于技术范围内可接受的失败，其失败率进行检测的项目有关。正常情况下，该项目的分型失败率是低于15％的，从这一指标来看，新的外周血基因组DNA快速提取方法的样本质量是符合MassARRAY的分型。
另外从DNA的检测结果来看，其浓度均高于10ng/ul，OD260/OD280绝大部分都在1.8左右，说明通过本方法获得的DNA符合绝大部分检测平台的要求，实用性相对较广。
Claims (1)
1.一种外周血基因组DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）取100-150μL血液样品，加入200-250μL Lysis Buffer和20-35μL Proteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，60℃放置10min，95℃放置10min，期间颠倒混匀数次；
2）室温放置2-5min后，12000rpm离心2min，取50μL左右上清；
3）将90-92μL磁珠加入至装有上述上清的PCR管中，轻轻吹打混匀6次，室温静置孵育5-10min，将PCR管置于磁力架上3-5min；
4）移除上清，将PCR管继续放置于磁力架上，向PCR管中加入300-350μL 75%乙醇溶液，静置30S；
5）移除上清，再向PCR管中加入300-350μL 75%乙醇溶液，静置30S后彻底移除上清；
6）室温静置2-5min，使残留乙醇彻底挥发；
7）加入10-12μL的Nuclease free water ，把PCR管从磁力架取下，轻轻吹打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2-3min；
8）将PCR管置于磁力架上2min；
9）用移液器吸取10-11μL上清液，转移到新的PCR管中，在反应管上标记样本编号。
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