CN109576378B - 一种复合体系及其检测不平衡混合检材的方法和应用 - Google Patents

一种复合体系及其检测不平衡混合检材的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合体系及其检测不平衡混合检材的方法和应用。该复合体系包括扩增18个SNP‑STR位点的引物，每个位点包括一条共用后引物和两条增加突变的特异性前引物，具体序列见SEQ ID NO.1～54。本发明建立的SNP‑STR复合扩增体系，简化了操作过程，能在现有法医物证常规检验设备的基础上广泛使用，对法医现场二人混和样本进行检测，同一STR分型样本区分，无创产前诊断和无创产前亲子鉴定，提供了新的技术手段，为破案提供线索与证据。

Description

一种复合体系及其检测不平衡混合检材的方法和应用
技术领域
本发明属于法医检测技术领域，具体涉及一种复合体系及其检测不平衡混合检材的方法和应用。
背景技术
在法医物证检验所需要分析的各类检材中，混合检材是重要的常见检材之一。混合检材的复杂程度随着组成个体的数量增加而增加，同时其检测难度也会随着组成成分DNA占比变化而不同。
分析鉴定混合检材的关键在于对不同组分的信息进行有效分离。目前在实际案件工作中分析混合检材的方法主要有三种：
(1)在DNA提取阶段将组成成分分离后再进行检测，如精液-阴道分泌液混合检材，一般采用差异裂解法提取男性精子细胞DNA从而获得男性成分DNA分型。但在此方法中，女性成分可能会因男性上皮细胞的存在而无法分离。另外，通过细胞分离技术或显微切割技术直接分离混合检材中组成成分的细胞，但由于这类方法对检材质量以及实验设备等方面要求较高，限制了其应用推广。
(2)在DNA扩增阶段进行分离，此阶段主要通过使用特殊遗传标记来实现，如利用男性特有的Y-STR遗传标记对男-女性混合检材中男性成分Y染色体信息进行分析，但由于此类标记为父系遗传且属于单倍型，不能直接用于个人识别，也无法用于男-男及女-女混合检材。除Y-STR外，还有线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)，但由于mtDNA具有异质性，为母系遗传并属于单倍型，不能直接用于组成成分的个体识别。
STR位点和与之物理距离很近的DIP(Deletion/Insertion polymorphism，缺失/插入多态性)位点遗传时相互连锁形成复合连锁遗传标记DIP-STR，能够对比例高达1:1000的不平衡混合检材中次要成分进行分析，不受主要成分的影响，而且不受混合检材性别组成的限制，能同时获得DIP和STR的分型，具有比STR更高的多态性。但是，DIP-STR在基因组中分布较少，法医DNA分析中常规使用的STR基因座核心重复序列侧翼区都没有DIP分布，因此该标记无法与现有的STR数据库进行比对，实用性受到限制。
(3)在混合检材DNA分型结果得出后，对组成成分的分型进行分离分析，此类方法主要依赖于法医统计学和概率软件完成，容易受混合检材比例和扩增过程中随机效应的影响。如果混合检材不平衡比例过大，扩增阶段已造成低比例成分被高比例成分遮盖，分型图谱低比例成分信息出现过少甚至不会显示出低比例成分信息，统计学方法和软件的使用将会受到限制。
目前对不平衡混合检材的分析在实际工作中还没有行之有效的解决方法和手段，不平衡混合检材中少量成分的分离分析仍在研究当中。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种复合体系及其检测不平衡混合检材的方法和应用，能够用于法医现场案件混合样本的检测。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种复合体系，该复合体系包括扩增18个SNP-STR位点的引物，每个位点包括一条共用后引物和两条增加突变的特异性前引物；
SNP-STR位点包括rs11642858-D16S539、rs58390469-D2S441、rs2325399-D6S1043、rs2070018-FGA、rs25768-D5S818、rs9531308-D13S317、rs17651965-CSF1PO、rs4847015-D1S1656、rs7962284-D12S391、rs7275705-PentaD、rs7786079-D7S820、rs57346531-D8S1179、rs8031604-PentaE、rs2246512-D10S1248、rs17077990-D3S1358、rs6736691-D2S1338、rs13413321-TPOX，以及rs9362476-SE33；
引物具体序列如下所示：
rs11642858-D16S539-R:GGCAGATCCCAAGCTCTTCCTC；(SEQ ID NO.1)
rs11642858-D16S539-F-A:GCATGTATCTATCATCCATCTCTaT；(SEQ ID NO.2)
rs11642858-D16S539-F-C:GCATGTATCTATCATCCATCTCTtG；(SEQ ID NO.3)
rs58390469-D2S441-R:GCTAAGTGGCTGTGGTGTTA；(SEQ ID NO.4)
rs58390469-D2S441-F-A:TGAAAGGAGTGCAAGAGAAGcTA；(SEQ ID NO.5)
rs58390469-D2S441-F-C:TGAAAGGAGTGCAAGAGAAGcTC；(SEQ ID NO.6)
rs2325399-D6S1043-R:GAGCCACTTCCCATAATAAATCCT；(SEQ ID NO.7)
rs2325399-D6S1043-F-C:AAGTACCCTAACAAGTAACTCATCcT；(SEQ ID NO.8)
rs2325399-D6S1043-F-G:AAGTACCCTAACAAGTAACTCAgGcTC；(SEQ ID NO.9)
rs2070018-FGA-R:CCAAAATAAAATTAGGCATATTTACAAGCTAG；(SEQ ID NO.10)
rs2070018-FGA-F-C:GCCTTCCTTTTCCCTCTACTCcG；(SEQ ID NO.11)
rs2070018-FGA-F-T:GCCTTCCTTTTCCCTCTACTCcA；(SEQ ID NO.12)
rs25768-D5S818-R:AGCCACAGTTTACAACATTTGTATCT；(SEQ ID NO.13)
rs25768-D5S818-F-A:GGGTGATTTTCCTCTTTGGTATCCTTcT；(SEQ ID NO.14)
rs25768-D5S818-F-G:GGGTGATTTTCCTCTTTGGTATCCTTcC；(SEQ ID NO.15)
rs9531308-D13S317-R:CTCTGGACTCTGACCCATCTAACG；(SEQ ID NO.16)
rs9531308-D13S317-F-C:GTGGGGAAATTTGTACATTCATTAATATACAgG；(SEQ IDNO.17)
rs9531308-D13S317-F-A:GTGGGGAAATTTGTACATTCATTAATATACAgT；(SEQ IDNO.18)
rs8031604-PentaE-R:TTTGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTAC；(SEQ ID NO.19)
rs8031604-PentaE-F-T:GGGTACCAATAACAAGAAAATTGTGtA；(SEQ ID NO.20)
rs8031604-PentaE-F-G:GGGTACCAATAACAAGAAAATTGTtGC；(SEQ ID NO.21)
rs4847015-D1S1656-R:GAGAAATAGAATCACTAGGGAACC；(SEQ ID NO.22)
rs4847015-D1S1656-F-C:TGTGTTGCTCAAGGGTCAACTcTG；(SEQ ID NO.23)
rs4847015-D1S1656-F-T:TGTGTTGCTCAAGGGTCAACTGcA；(SEQ ID NO.24)
rs7962284-D12S391-R:TCCATATCACTTGAGCTAATTCCTCT；(SEQ ID NO.25)
rs7962284-D12S391-F-T:CACCACTGCACTCCAGTtT；(SEQ ID NO.26)
rs7962284-D12S391-F-C:CACCACTGCACTCCtGCG；(SEQ ID NO.27)
rs7275705-PentaD-R:GAGCAAGACACCATCTCAAGAAA；(SEQ ID NO.28)
rs7275705-PentaD-F-G:GGTTAAATATCTCTTCAAATCTTTTGCaC；(SEQ ID NO.29)
rs7275705-PentaD-F-C:GGTTAAATATCTCTTCAAATCTTTTGtCG；(SEQ ID NO.30)
rs7786079-D7S820-R:AAGGGTATGATAGAACACTTGTCATAG；(SEQ ID NO.31)
rs7786079-D7S820-F-C:CCTCATTGACAGAATTGCACCtC；(SEQ ID NO.32)
rs7786079-D7S820-F-A:CCTCATTGACAGAATTGCACCtA；(SEQ ID NO.33)
rs57346531-D8S1179-R:TACCTATCCTGTAGATTATTTTCACTGTG；(SEQ ID NO.34)
rs57346531-D8S1179-F-A:GAGCATAACAGAGGCACTGAaA；(SEQ ID NO.35)
rs57346531-D8S1179-F-G:GAGCATAACAGAGGCACTGAaG；(SEQ ID NO.36)
rs2246512-D10S1248-R:CATATTAATGAATTGAACAAATGAGTGAGT；(SEQ ID NO.37)
rs2246512-D10S1248-F-A:CCCACCCCTGGATATTATAATTAAaAT；(SEQ ID NO.38)
rs2246512-D10S1248-F-G:CCCACCCCTGGATATTATAATTAACgC；(SEQ ID NO.39)
rs17077990-D3S1358-R:CAGAGCAAGACCCTGTCTCAT；(SEQ ID NO.40)
rs17077990-D3S1358-F-C:CTCAGCTTCAGCCCATACaC；(SEQ ID NO.41)
rs17077990-D3S1358-F-G:CTCAGCTTCAGCCCATACaG；(SEQ ID NO.42)
rs17651965-CSF1PO-R:TTGCTAACCACCCTGTGTCTCAG；(SEQ ID NO.43)
rs17651965-CSF1PO-F-G:GCTCMCACTCCGATGAGgTG；(SEQ ID NO.44)
rs17651965-CSF1PO-F-C:GCTCMCACTCCGATGAGgTC；(SEQ ID NO.45)
rs6736691-D2S1338-R:GGAGGGAGCCAGTGGATTT；(SEQ ID NO.46)
rs6736691-D2S1338-F-C:CTGCAGGTGGCCCATAAaC；(SEQ ID NO.47)
rs6736691-D2S1338-F-A:CTGCAGGTGGCCCATAtTA；(SEQ ID NO.48)
rs13413321-TPOX-R:GGCACAGAACAGGCACTTAGG；(SEQ ID NO.49)
rs13413321-TPOX-F-G:GGGGAGGAACTGGGAACtC；(SEQ ID NO.50)
rs13413321-TPOX-F-T:GGGGAGGAACTGGGAACgA；(SEQ ID NO.51)
rs9362476-SE33-R:GTCATGCCATTGCACTCCAAT；(SEQ ID NO.52)
rs9362476-SE33-F-C:gGCTGGAGCAGTTGTCtACtA；(SEQ ID NO.53)
rs9362476-SE33-F-T:gGCTGGAGCAGTTGTCGgTtA；(SEQ ID NO.54)
上述序列中，小写字母表示该位置上原有碱基改变为引入的错配碱基，下划线标记的碱基表示该位点的SNP等位基因。
一种利用复合体系检测不平衡混合检材的方法，包括以下步骤：
(1)分别提取待检混合检材、受害者以及嫌疑人的DNA；
(2)采用权利要求1中所述复合体系分别对提取的受害者以及嫌疑人的DNA进行PCR扩增，扩增产物用毛细管电泳方法进行检测，获得受害者和嫌疑人各自的SNP-STR基因分型，在此基础上筛选出嫌疑人与受害者相比所特有的SNP等位基因，其连锁的SNP-STR等位基因，即有效位点；
(3)采用权利要求1中与筛选出的有效位点相对应的引物，分别对混合检材待检DNA进行PCR扩增，检测嫌疑人的特有SNP-STR等位基因是否能从混合检材中分离出来，具体过程为：
例如，如图1所示，当不平衡混合检材中次要成分DNA SNP基因型为BB或AB，主要成分DNA SNP基因型为AA时，找到主要成分中不包含的等位基因B，可通过使用特异性B-SNP引物靶向扩增等位基因B，最终获得混合样本中次要DNA特有的B等位基因产物，其单倍型为B3/B5或B5。
进一步地，步骤(2)中扩增体系为：2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 5μL、Primer Mix 0.5μL、1ng/μL DNA 1μL，最后用RNase-free water补足至10μL。
进一步地，步骤(2)中扩增条件为：95℃，预变性15min；94℃，变性30s；58℃，退火90s；72℃，延伸60s；最后60℃，延伸35min；共31个循环。
进一步地，步骤(3)中扩增体系为：2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 5μL、3μM引物工作液PA/PB 0.5μL、DNA 1μL，最后用RNase-free water补足至9μL。
进一步地，步骤(3)中扩增条件为：95℃，预变性15min；94℃，变性30s；58℃，退火90s；72℃，延伸60s；最后60℃，延伸35min；共31个循环。
上述方法在个体识别、无创产前诊断、无创产前亲子鉴定或不平衡混合检材鉴定中的应用。
一种混合斑检测用试剂盒，包括上述的复合体系。
更具体的，该试剂盒具体包括的组分可为：
a)复合扩增反应混合液：含有PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶等常用成分；b)复合引物：具体序列如SEQ ID NO.1～54所示；
复合扩增反应混合液、扩增产物纯化试剂可按本领域常用的配方或按分子生物学手册进行配制，也可直接使用商业化的产品；至于提取待检测样本中的DNA的模板，可使用本领域目前的各种常规试剂，提取DNA模板可以参照现有的常规方法即可进行。
本发明的有益效果为：
1、本发明筛选了18个SNP-STR复合遗传标记，利用ARMS技术原理，结合荧光检测技术，实现SNP和STR位点的同步扩增，可同时获得两种遗传标记的分型。在STRs高多态性的基础上，增加了SNPs双等位基因分型优势，结合了二者的信息含量，法医学分析性能高于该遗传标记中包含的STR。
2、18个SNP-STR位点的SNP等位基因特异性引物在检测对应比例不平衡混合检材中的次要成分时，均不受主要成分的影响，在不平衡混合物的分析中具有明显的优势。
3、本发明方法检测到的SNP-STR分型结果，能够与目前STR数据库中现有数据直接进行查询比对，为案件调查提供更多有效的线索与证据。
4、本研究中的SNP-STR位点是基于常染色体STR筛选而来，在对两人混合斑的分析时，不会受混合斑贡献者性别的影响。
5、本发明建立了SNP-STR复合扩增体系，简化了操作过程，能在现有法医物证常规检验设备的基础上广泛使用，对法医现场二人混和样本进行检测，同一STR分型样本区分，提供了新的技术手段，为破案提供线索与证据。
6、该方法还能应用于无创产前诊断、无创产前亲子鉴定等领域，无需进行羊水或者绒毛膜穿刺等有创技术，只需采取孕妇外周血，检验外周血胎儿游离DNA即可进行鉴定，保护胎儿和孕妇安全，也将鉴定的时限大大提前。
7、该方法还有可能用于骨髓移植手术或其他器官移植手术后外周血的移植物成分的监测。
附图说明
图1为SNP-STR分析不平衡混合检材的原理图；
图2为I值计算示意图；
图3为引物设计原理图；
图4为复合体系引物组合图；其中，图4a为Panel-A；图4b为Panel-B；图4c为Panel-C；
图5为有效位点检测结果图；其中，图5a为rs58390469-D2S441-A12位点；图5b为rs2325399-D6S1043-G19位点；图5c为rs17077990-D3S1358-G16位点；图5d为rs13413321-TPOX-T11位点。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1基因座筛选
1、DNA提取：使用百泰克全血基因组DNA快速提取试剂盒提取收集样本的外周血基因组DNA，具体方法参见说明书；然后用NanoDrop-1000微量紫外可见分光光度计检测上述DNA样本的浓度，根据具体浓度将所得的DNA溶液使用TE稀释成浓度为1ng/μL，体积为100μL的工作液，4℃保存。
2、SNP-STR基因座筛选
(1)筛选原则：SNP-STR遗传标记可用于分析不平衡混合检材的前提是检材中主要和次要成分在SNP-STR基因座上的基因型组合为有效信息基因型。有效信息基因型为次要成分DNA的基因型具有主要成分中不存在的等位基因，其出现概率与SNP等位基因的频率相关。根据图2可以得到四种有效信息基因型组合：(1)次要DNA为AA，主要DNA为BB；(2)次要DNA为AB，主要DNA为AA；(3)次要DNA为AB，主要DNA为BB；(4)次要DNA为BB，主要DNA为AA。其余组合均不构成有效信息基因型。
各基因型频率根据等位基因频率计算，即AA频率为A2，BB频率为B2，AB频率为2AB，因此各组合的概率分别为A2B2，2A3B，2AB3，B2A2。综上，有效信息基因型总概率(有效信息基因型概率，probability of informative genotypes，简称I值)的计算公式为：I＝A2B2+2A3B+2AB3+B2A2。
由于现有常用STR位点数量的有限性，因此，筛选SNP-STR位点时对I值的最低值不作过高限制。同时，筛选时需要考虑STR位点核心重复序列长度范围以及毛细管电泳分析中目标片段的长度检测限制，以确定SNP与STR核心重复区域的最大物理距离。综上所述，SNP-STR筛选原则为，在常用STR位点的基础上选择：(1)SNP MAF≥0.02，即I≥0.04；(2)SNP距离STR核心重复区域的碱基数小于400bp；(3)SNP-STR目标片段长度低于550bp。
(2)查找基础STR基因座：本发明筛选SNP-STR的基础STR为目前国内外法医DNA分析中常用的常染色体STR位点，主要包括：(1)法医DNA分型中分布最为广泛的13个CODISSTR位点，(2)欧洲标准组(European Standard Set，ESS)STR位点，(3)国内外常用商品化试剂盒中除前两项中包含的STR位点外的其他常染色体STR。
(3)单个SNP-STR基因座的筛选：根据步骤(1)中确定的筛选原则，对步骤(2)中确定的STR位点序列进行分析，以进一步选择SNP。最终确定了18个SNP-STR基因座，具体为:rs11642858-D16S539、rs58390469-D2S441、rs2325399-D6S1043、rs2070018-FGA、rs25768-D5S818、rs9531308-D13S317、rs17651965-CSF1PO、rs4847015-D1S1656、rs7962284-D12S391、rs7275705-Penta D、rs7786079-D7S820、rs57346531-D8S1179、rs8031604-PentaE、rs2246512-D10S1248、rs17077990-D3S1358、rs6736691-D2S1338、rs13413321-TPOX，以及rs9362476-SE33，具体信息如表1所示。
表1 SNP-STR基因座信息
Figure GDA0001968204630000091
Figure GDA0001968204630000101
其中，distance为SNP-STR基因座中，SNP与STR核心重复序列间的物理距离；SNPAllele为对应SNP的等位基因；SNP MAF表示该SNP的最小等位基因频率；HCB为Hapmap计划中使用的北京汉族人；CHB+JPT，为1000Genomes中使用的北京汉族人和东京日本人；EAS为1000Genomes中使用的东亚人；I值为有效信息等位基因概率(probability ofinformative genotypes)。
实施例2引物设计与合成
常规STR引物设计时，只考虑扩增核心重复区域，扩增子的长度即为DNA的STR分型结果；SNP-STR的ARMS引物设计则考虑一次扩增即可获得SNP、STR两种遗传标记的信息。利用ARMS(扩增阻滞突变技术)原理(见图3)，SNP-STR基因座引物的设计主要分为两个部分：(1)首先使用Primer3引物在线设计工具(http://primer3.ut.ee)设计普通引物，要求前引物3’末端碱基位于目标SNP上，后引物位于STR核心重复区域下游，目标片段长度低于550bp；(2)在普通引物的基础上进行SNP等位基因特异性引物的设计，在(1)中得到的前引物基础上修改3’末端碱基，使其与SNP两种等位基因一致，得到两条引物后再在每条引物3’末端倒数第二或第三位碱基上引入错配，对两条特异性前引物使用不同荧光素标记，后引物不作标记。
经过反复筛选、优化，实施例1得到的18个SNP-STR位点的54条引物序列及荧光标记如表2所示，每个位点包含一条共用后引物(R)和两条增加突变的特异性前引物，引物序列中小写字母表示该位置上原有碱基改变为引入的错配碱基，下划线标记的碱基表示该位点的SNP等位基因。
表2 SNP-STR引物序列及荧光标记
Figure GDA0001968204630000111
Figure GDA0001968204630000121
经过反复实验、优化调整，这18个SNP-STR位点的PCR反应体系包括：2×QIAGENMultiplex PCR Master Mix 5μL、3μM引物工作液PA/PB 0.5μL、DNA 2μL，补水至10μL。扩增程序为：95℃，预变性15min；94℃，变性30s；58℃，退火90s；72℃，延伸60s；最后60℃，延伸35min；共31个循环。
实施例3复合体系的建立与优化
在18个SNP-STR基因座的引物设计完成后，根据各位点目标扩增片段长度以及各引物的不同荧光标记，建立复合扩增体系的三个Panel：Panel-A、Panel-B、Panel-C，具体分组见图4；图4中方块为一个基因座的其中一组引物，方块宽度对应目标位点的扩增子长度范围，最下方的竖状条带为分子量内标GeneScanTM600LIZ的片段分布情况(最短片段为20bp，最长片段为600bp)。
SNP-STR复合扩增体系三个panel的引物混合物中各引物浓度如表3所示，PCR反应体系包括：2×QIAGEN Multiplex PCR Master 5μL、DNA(1ng/μL)1μL，补水至10μL；
扩增程序为：95℃，预变性15min；94℃，变性30s；58℃，退火90s；72℃，延伸60s；最后60℃，延伸35min；共31个循环。
表3复合体系优化后各SNP-STR位点引物浓度
Figure GDA0001968204630000131
实施例4不平衡混合检材检测
利用该发明对法医物证现场不平衡混合斑进行扩增检测(其原理如图1所示)。从案件现场获得的混合斑DNA，以及受害者和嫌疑人的参照样本DNA。根据案件前期调查，混合斑DNA中主要成分为受害者DNA，次要成分为除受害者以外的DNA。
1、采用实施例3制备得到SNP-STR复合体系对受害者和嫌疑人的参照样本进行PCR扩增，其PCR反应体系和反应条件见实施例3。
2、扩增产物进行毛细管电泳分析。由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔(0.5μL分子量内标GeneScanTM600LIZ)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物混合，避免产生气泡。95℃变性3min，冰浴3min，上机电泳。电泳结果使用GeneMapperTMID-X软件进行分型。获得两者的SNP-STR基因型如表4所示：
表4受害者和嫌疑人的SNP-STR分型
Figure GDA0001968204630000141
Figure GDA0001968204630000151
2、筛选出嫌疑人所特有的有效位点，如表5粗体字所示。
表5有效位点
Figure GDA0001968204630000152
3、使用筛选出的有效位点相对应的SNP-STR特异性引物，分别对混合检材DNA中的次要成分进行扩增电泳分析，其PCR反应体系和反应条件见实施例2，结果如图5所示，其中，图5a为rs58390469-D2S441-A12位点；图5b为rs2325399-D6S1043-G19位点；图5c为rs17077990-D3S1358-G16位点；图5d为rs13413321-TPOX-T11位点。混合斑中该四个位点的检测结果与嫌疑人参照样本一致，该嫌疑人的特有SNP-STR单倍型在混合斑中被成功检测到。由此说明，本发明方法能够为案件调查提供更多有效的证据，将有利于案件的调查分析。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种复合体系及其检测不平衡混合检材的方法和应用
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcagatccc aagctcttcc tc 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatgtatct atcatccatc tctat 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatgtatct atcatccatc tcttg 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctaagtggc tgtggtgtta 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaaaggagt gcaagagaag cta 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgaaaggagt gcaagagaag ctc 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagccacttc ccataataaa tcct 24
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagtacccta acaagtaact catcct 26
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagtacccta acaagtaact caggctc 27
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccaaaataaa attaggcata tttacaagct ag 32
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccttccttt tccctctact ccg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccttccttt tccctctact cca 23
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agccacagtt tacaacattt gtatct 26
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gggtgatttt cctctttggt atccttct 28
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggtgatttt cctctttggt atccttcc 28
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctctggactc tgacccatct aacg 24
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtggggaaat ttgtacattc attaatatac agg 33
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtggggaaat ttgtacattc attaatatac agt 33
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tttgggttat taattgagaa aactccttac 30
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gggtaccaat aacaagaaaa ttgtgta 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gggtaccaat aacaagaaaa ttgttgc 27
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gagaaataga atcactaggg aacc 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgtgttgctc aagggtcaac tctg 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgtgttgctc aagggtcaac tgca 24
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tccatatcac ttgagctaat tcctct 26
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caccactgca ctccagttt 19
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caccactgca ctcctgcg 18
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gagcaagaca ccatctcaag aaa 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gagcaagaca ccatctcaag aaa 23
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggttaaatat ctcttcaaat cttttgtcg 29
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aagggtatga tagaacactt gtcatag 27
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cctcattgac agaattgcac ctc 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cctcattgac agaattgcac cta 23
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tacctatcct gtagattatt ttcactgtg 29
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gagcataaca gaggcactga aa 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gagcataaca gaggcactga ag 22
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
catattaatg aattgaacaa atgagtgagt 30
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cccacccctg gatattataa ttaaaat 27
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cccacccctg gatattataa ttaacgc 27
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cagagcaaga ccctgtctca t 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ctcagcttca gcccatacac 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctcagcttca gcccatacac 20
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttgctaacca ccctgtgtct cag 23
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gctcmcactc cgatgaggtg 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gctcmcactc cgatgaggtc 20
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ggagggagcc agtggattt 19
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctgcaggtgg cccataaac 19
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctgcaggtgg cccatatta 19
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ggcacagaac aggcacttag g 21
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggggaggaac tgggaactc 19
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ggggaggaac tgggaactc 19
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtcatgccat tgcactccaa t 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggctggagca gttgtctact a 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ggctggagca gttgtcggtt a 21

Claims (8)

1.一种复合体系，其特征在于，所述复合体系包括扩增以下18个SNP-STR位点的引物，每个位点包括一条共用后引物和两条增加突变的特异性前引物；所述SNP-STR位点包括rs11642858-D16S539、rs58390469-D2S441、rs2325399-D6S1043、rs2070018-FGA、rs25768-D5S818、rs9531308-D13S317、rs17651965-CSF1PO、rs4847015-D1S1656、rs7962284-D12S391、rs7275705-PentaD、rs7786079-D7S820、rs57346531-D8S1179、rs8031604-PentaE、rs2246512-D10S1248、rs17077990-D3S1358、rs6736691-D2S1338、rs13413321-TPOX，以及rs9362476-SE33；
引物具体序列如SEQ ID NO.1～54所示。
2.一种利用权利要求1所述复合体系检测不平衡混合检材的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别提取待检混合检材、受害者以及嫌疑人的DNA；
(2)采用权利要求1中所述复合体系对提取的受害者以及嫌疑人的DNA进行PCR扩增，获得SNP-STR基因分型，在此基础上筛选出SNP-STR等位基因有效位点；
(3)采用权利要求1中与筛选出的有效位点相对应的引物，分别对混合检材待检DNA进行PCR扩增即可。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述扩增体系为：2×QIAGENMultiplex PCR Master Mix 5μL、Primer Mix 0.5μL、1ng/μL DNA 1μL，最后用RNase-freewater补足至10μL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述扩增条件为：95℃，预变性15min；94℃，变性30s；58℃，退火90s；72℃，延伸60s；最后60℃，延伸35min；共31个循环。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述扩增体系为：2×QIAGENMultiplex PCR Master Mix 5μL、3μM引物工作液PA/PB 0.5μL、DNA 2μL，最后用RNase-free water补足至10μL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述扩增条件为：95℃，预变性15min；94℃，变性30s；58℃，退火90s；72℃，延伸60s；最后60℃，延伸35min；共31个循环。
7.权利要求1所述的复合体系在制备个体识别或无创产前亲子鉴定试剂中的应用。
8.一种混合斑检测用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的复合体系。
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