CN111534604B - 一种检测人常染色体dip-str遗传标记的荧光复合扩增试剂盒 - Google Patents
一种检测人常染色体dip-str遗传标记的荧光复合扩增试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测人常染色体DIP‑STR遗传标记的荧光复合扩增试剂盒，通过引物组同时复合扩增8个DIP‑STR遗传标记位点，为不均衡混合样本DNA检测提供有效的辅助方法。所述8个DIP‑STR遗传标记的DIP位点在UCSC数据库中的编号为rs35032587、rs146332920、rs145423446、rs60194384、rs72406828、rs137967237、rs2308142、rs111478323，每个DIP‑STR遗传标记位点对应的引物组由两条标记有不同荧光染料的特异上游引物和一条公共下游引物组成。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测人常染色体DIP-STR遗传标记的荧光复合扩增试剂盒。
背景技术
在法医物证学领域，微量DNA及混合DNA的检测一直是现场案件检测的重点与难点。随着DNA检测技术的发展，许多微量接触类生物检材通过STR、SNP等遗传标记可以获得稳定可靠的DNA分型。但是对于主次成分差异比较大的混合样本，常规法医DNA检测方法只能提供非常有限的分型结果。
为了克服这一难题，一种由插入-缺失多态性(Deletion/InsertionPolymorphisms，DIP)和短串联重复序列多态性(Short Tandem Repeat,STR)两种遗传标记串联组合在一起形成的新型复合遗传标记DIP-STR应运而生。该遗传标记是STR序列上/下游500bp范围内存在DIP位点，根据DIP位点的插入或缺失状态分别设计特异性引物，利用DIP双等位基因特异分型的优势，结合STR的多态性优势，能够在极不平衡的双源DNA混合物中检测出次要成分，同时保留了由连锁的多等位基因提供的强大识别能力。
目前，法医学领域，尚无适合东亚群体可快速检测DIP-STR的复合检测体系。国外此前有关于7个DIP-STR位点的复合扩增体系的研究，但所含位点不适用于东亚群体，且检测样本需要提取纯化，无法实现直接扩增。所以，需要筛选到一组适合的DIP-STR遗传标记，构建一种既操作简单、检测耗时少，又能实现样本快速检测的高效能DIP-STR复合检测体系，应用于中国人群法医物证检测。
发明内容
本发明提供一种检测人常染色体DIP-STR遗传标记的荧光复合扩增试剂盒，该试剂盒特异性好，灵敏度高，抗干扰能力强，能适应当前案件现场的复杂性，为案件现场微量物证检验中不均衡混合样本的DNA检测提供有效的辅助方法。
一种检测人常染色体DIP-STR遗传标记的荧光复合扩增试剂盒，其基于一代测序平台，使用8组引物组同管扩增8个DIP-STR遗传标记位点。筛选自UCSC数据库的DIP-STR遗传标记位点具体信息如下：
*Y为简并碱基，代表T或C
每个DIP-STR遗传标记位点对应的引物组由两条标记有不同荧光染料的特异上游引物和一条公共下游引物组成。为实现良好的扩增效果，对引物设计及引物浓度进行了优化。
优选地，如SEQ ID No.01～03,10～15,19～21所示的引物组为第一群组，如SEQID No.04～09,16～18,22～24所示的引物组为第二群组；同一群组使用两种荧光染料分别对每个引物组的特异上游引物进行标记。
具体遗传标记位点对应的引物名称、序列、荧光标记的选择、浓度如表1所示：
表1
本发明所述试剂盒中扩增体系包含的具体组分如表2：
表2
复合扩增反应对应的扩增程序如表3：
表3
该试剂盒可以应用于法医物证不均衡混合样本检验，而且所有DIP-STR遗传标记扩增大小均小于400bp，适用于法医学常见的检材的检测。
基于上述技术方案，本发明所述的试剂盒具有以下优点：
1、本发明所述试剂盒可实现3小时内快速批量检测90个样本，每个样本检测8个DIP-STR遗传标记，检测效率大大提高；而且整个操作和结果分析方法完全兼容目前法医DNA实验室普及的PCR-毛细管电泳平台，操作方法简单、易于掌握。
2、本发明优选特异性好、抗干扰强的复合扩增引物，可实现样本DIP-STR遗传标记检测免提取直接扩增，而且扩增片段在400bp以内，适合降解/混合DNA模板的检测。
附图说明
图1是遗传标记位点排布示意图；
图2是实施例4的扩增分型图；
图3是实施例5所述混合样本1血斑直接扩增分型图；
图4是实施例5所述混合样本2血斑直接扩增分型图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：8个DIP-STR遗传标记的筛选
通过NCBI和UCSC查找筛选及参考文献，最终选定8个DIP-STR遗传标记位点。筛选参数包括：DIP位点插入/缺失片段大小为3-10bp、STR基因座核心序列为3-5碱基、DIP与STR间距小于250bp、DIP-STR片段大小在500bp以内。
所筛选的8个DIP-STR遗传标记位点信息如表4：
表4
*Y为简并碱基，代表T或C
实施例2：DIP-STR遗传标记位点引物设计
引物设计的基本思路是设计2条标记不同荧光素的上游分型引物和1条非标记的下游通用引物。将DIP位点特异性缺失(S)/插入(L)部分序列置于上游分型引物3'末端，如果缺失(S)分型的引物3'末端序列与受检样本DNA基因型正确互补配对，则扩增出代表S分型荧光的片段；如果插入(L)分型引物3'末端的序列与受检样本DNA基因型正确互补配对，则扩增出代表L分型荧光的片段；对于与样本不匹配的分型引物，由于C-Taq DNA聚合酶缺乏3'-5'外切校正活性，DNA链延伸反应就会因为3'-5'-磷酸二酯键形成障碍而受阻，导致无法扩增。
所设计的8个DIP-STR遗传标记位点引物序列和荧光标记信息如表5：
表5
实施例3：PCR反应体系和扩增程序调节
(1)PCR反应体系包含扩增反应所必须的各种离子和dNTP混合物，根据PCR需要还可以添加一些特异性PCR增强剂。但是为了能够提高PCR反应的扩增特异性、扩增效率以及抗干扰能力，需要对以上各种组分进行浓度的优化。
本发明试剂盒中组分包括：12.5μL Reaction Mix(包含的各组分终浓度为50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl、2.5mmol/L MgCl2、0.25mmol/L dNTP Mix)，5μL混合引物，1μL热启动C-Taq酶(5U/μL)和超纯水，具体反应体系如表6：
表6
(2)PCR扩增程序和普通PCR一样，需要进行变性、退火、延伸三个步骤的循环，才能富集目的片段。每一步的时间和温度则需要优化，以适应不同检材的扩增。扩增程序优化范围如表7：
表7
试剂盒扩增的目标遗传标记位点排布如图1所示。
实施例4：复合扩增体系测试及数据分析
以法医DNA鉴定标准品(Female)9947A为模板的1μL PCR产物，9.5μL去离子甲酰胺和0.5μL SIZ-500，混匀，95℃3min并立即冰浴3min。使用3130XL型基因分析仪进行电泳，整个电泳时间50min。电泳数据通过GeneMapper IDX v 1.4分析软件进行等位基因分型。检测结果如图2。
实施例5：混合样本测试
本试剂盒通过对2个混合样本分别进行扩增-电泳检测-数据分析，根据分型图出峰情况推导混合样本的分型，与混合样本中单一成分的分型情况进行比对。样本1和2均为混合样本，每个样本里面实际上包含两个人的DNA，因此分型会出现两个人的分型。一般STR试剂盒由于标记的限制，难以区分两个人的分型。本试剂盒使用的DIP-STR标记，由于包含了DIP和STR两种标记，有更大的可能令两个人的分型区分开来。比如对于样本1，a与b两个人的DNA含量(占比)不一样，a占比大于b，如果用常规STR进行检测，某位点a和b的分型均为10，此时就不能对样本的混合成分进行有效区分；但如果用DIP-STR检测，a与b的DIP分型分别为S和L，即两者的DIP-STR分型分别为S10和L10，此时就能够对样本进行区分了。结果如图3、图4以及表8所示。
表8
通过比对样本的推测与实际分型，两者均一致，说明本研究试剂盒能够将混合样本的不同组分的分型进行分离。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东华美众源生物科技有限公司;佛山市公安局
<120> 一种检测人常染色体DIP-STR遗传标记的荧光复合扩增试剂盒
<130> 2020
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (8)
1.一种检测人常染色体DIP-STR遗传标记的荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，使用8组引物组同管扩增8个DIP-STR遗传标记位点，所述8个DIP-STR遗传标记中的DIP位点在UCSC数据库中的编号为rs35032587、rs146332920、rs145423446、rs60194384、rs72406828、rs137967237、rs2308142、rs111478323，每个DIP-STR遗传标记位点对应的引物组由两条标记有不同荧光染料的特异上游引物和一条公共下游引物组成，各引物序列如SEQ ID No.01～SEQ ID No.24所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组的浓度分别为：如SEQ IDNo.01所示引物的终浓度0.2μM，如SEQ ID No.02所示引物的终浓度0.2μM，如SEQ ID No.03所示引物的终浓度0.4μM，如SEQ ID No.04所示引物的终浓度0.12μM，如SEQ ID No.05所示引物的终浓度0.18μM，如SEQ ID No.06所示引物的终浓度0.3μM，如SEQ ID No.07所示引物的终浓度0.35μM，如SEQ ID No.08所示引物的终浓度0.25μM，如SEQ ID No.09所示引物的终浓度0.6μM，如SEQ ID No.10所示引物的终浓度0.2μM，如SEQ ID No.11所示引物的终浓度0.2μM，如SEQ ID No.12所示引物的终浓度0.4μM，如SEQ ID No.13所示引物的终浓度0.36μM，如SEQ ID No.14所示引物的终浓度0.24μM，如SEQ ID No.15所示引物的终浓度0.6μM，如SEQ ID No.16所示引物的终浓度0.47μM，如SEQ ID No.17所示引物的终浓度0.53μM，如SEQ ID No.18所示引物的终浓度1.0μM，如SEQ ID No.19所示引物的终浓度0.38μM，如SEQ ID No.20所示引物的终浓度0.52μM，如SEQ ID No.21所示引物的终浓度0.9μM，如SEQID No.22所示引物的终浓度0.38μM，如SEQ ID No.23所示引物的终浓度0.42μM，如SEQ IDNo.24所示引物的终浓度0.8μM。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，8组所述引物组分为2个群组，如SEQ IDNo.01～03,10～15,19～21所示的引物组为第一群组，如SEQ ID No.04～09,16～18,22～24所示的引物组为第二群组；同一群组使用两种荧光染料分别对每个引物组的特异上游引物进行标记。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，如SEQ ID No.01、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.19所示的引物由FAM标记，如SEQ ID No.02、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.20所示的引物由HEX标记。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，如SEQ ID No.04、SEQ ID No.07、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.22所示的引物由TAMRA标记，如SEQ ID No.05、SEQ ID No.08、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.23所示的引物由ROX标记。
6.根据权利要求1所述的检测人常染色体DIP-STR遗传标记的荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，还包括复合扩增体系，所述复合扩增体系包括组分：Reaction Mix、热启动C-Taq酶和超纯水。
7.根据权利要求6所述的检测人常染色体DIP-STR遗传标记的荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述Reaction Mix包含的各组分终浓度为50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl、2.5mmol/L MgCl2、0.25mmol/L dNTP Mix。
8.根据权利要求6所述的检测人常染色体DIP-STR遗传标记的荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，复合扩增反应的扩增程序为：95℃预变性2分钟；94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共10个循环；90℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸60秒，共20个循环；最后72℃终延伸10分钟。
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