CN108342489A - 一种对男性个体进行y-snp分型的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种对男性个体进行Y‑SNP分型的方法和系统，该方法包括获得所述男性个体的DNA，获得所述DNA 10个Y‑SNP位点的基因型，所述10个Y‑SNP位点为M130，M174，M89，M201，M304，M9，M231，M175，M242及M207，根据所述男性个体10个位点的基因型获得该个体的Y‑SNP分型结果。本发明还提供了一种对男性个体进行Y‑SNP分型的系统。本发明的方法和系统可以准确获得上述男性个体10个Y‑SNP位点的基因型，进而获得该男性个体的Y‑SNP分型结果，可以为进行男性个体的家系排查、父权亲权鉴定或种族来源推断提供数据支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种分型方法和系统，尤其涉及一种对男性个体进行Y-SNP分型的方法和系统。
背景技术
中国是一个多民族国家，通过识别并经政府确认的民族共有56个。少数民族的分布呈现“大杂居、小聚居”的特点。随着经济的快速发展和人口流动性增加，各民族之间的交流日益增多，民族间的杂居现象将更为普遍。自二十世纪九十年代起，恐怖主义在全球范围内迅速蔓延，针对民族与领土争端的恐怖袭击逐年增加。近些年我国也发生了多起恶性案件，严重地危害了社会稳定和人民生命、财产安全。人口流动大、涉恐涉爆案件的复杂程度猛增，这对公安系统的办案能力提出了巨大的挑战。如果通过生物检材的DNA信息推断预测生物检材来源人的种族、地域等特征，将提高对生物检材内在信息的利用度，进一步明确犯罪嫌疑人的身份特征和地域来源；同时结合现有DNA数据库进行比对查找，推动案件的主动侦查，加快案件侦破速度。在民族混居情况日益增加的现代社会中，犯罪嫌疑人的群体来源的判定，将能够帮助案件的定性，明确案件的侦查方向，推动案件的主动侦查，加快案件侦破速度。种族或家系来源推断作为一种非常有利的技术分析手段，对侦破危害国家安全的恐怖案件发生起到十分积极的作用。
在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP,人类基因组上的SNP总量大概是3×106个，多态性非常丰富。SNP少有重复突变或回复突变，使其在谱系构建方面具有独特的优势。目前国际上已经有比较详尽的SNP数据库，例如HapMap、dbSNP等，随着研究的深入，数据库中SNP位点数目也在不断增加，SNP的相关注释也将更加完善，将为SNP的研究提供更多地基础数据。自从2003年Frudakis等人建立了完善的双等位基因SNP遗传推断分类方法以来，该技术得到越来越多的应用，在个体识别、外形和地理推测等研究领域都发挥了巨大的作用。在法医遗传学领域，通过生物检材DNA中的SNPs位点信息来推断犯罪嫌疑人的身份特征和地域来源，将能够大大推动案件的侦破。
在犯罪群体中男性的比例居高不下，男性犯罪占犯罪群体的比例高达80％以上。Y染色体具有以下两个优点：(1)Y染色体是男性独特具有的，严格地父系遗传；(2)Y染色体上绝大部分为非重组区(the Non-recombining Region of the human Y chromosome,NRY)，重组区所占比例不到5％，相对于常染色体和X染色体缺少重组。在60Mbp的Y染色体上SNP位点可达上万个，突变信息比较丰富。挖掘Y-SNPs位点所包含的信息能够很好地构建、解析男性家族谱系。利用Y-SNPs来推断人类迁徙路径和种族、谱系，是分子人类学、法医遗传学等研究的重要手段。
如何开发出可对男性个体进行Y-SNP分型的方法和系统，为实现对男性个体的家系排查、父权亲权鉴定、种族来源推断等提供数据支持成为有待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种对男性个体进行Y-SNP分型的方法，通过采用特定10个Y-SNP位点组合以及针对这些位点设计的特定引物，能准确地获得男性个体Y-SNP位点的基因型，从而为实现对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、或种族来源推断等提供数据支持。
本发明还提供一种对男性个体进行Y-SNP分型的系统，通过该系统可以实现对男性个体针对上述10个Y-SNP位点的准确分型。
本发明还提供了一种复合检测体系，所述检测体系能准确获得男性个体10个Y-SNP位点的基因型。
本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。
本发明提供的一种对男性个体进行Y-SNP分型的方法，该方法包括：
1)获得男性个体的DNA；
2)获得所述DNA 10个Y-SNP位点的基因型，所述10个Y-SNP位点为M130，M174，M89，M201，M304，M9，M231，M175，M242，M207，包括使用与所述10个Y-SNP位点一一对应的扩增引物获得扩增产物的步骤，以及使用与上述10个Y-SNP位点一一对应的单碱基延伸引物利用所述扩增产物获得单碱基延伸产物的步骤，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQID No.20的核苷酸序列，所述单碱基延伸引物为序列表中SEQ ID No.21至SEQ ID No.30的核苷酸序列；
3)根据所述男性个体10个Y-SNP位点的基因型获得所述男性个体的Y-SNP分型结果。
在本发明的方案中，所述10个Y-SNP位点是申请人通过对大量男性个体的生存环境、种族起源等进行综合分析获得的。针对上述位点的引物也是申请人通过大量实验获得的，利用这些特定Y染色体位点的组合能实现对男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、种族来源推断等。
进一步的，在本申请的方案中，“获得男性个体的DNA”指的是提取该个体的例如血液、组织等样本中的DNA，或者直接获得含有所述个体DNA的血卡。“所述男性个体的Y-SNP分型结果”指的是能用于对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、种族来源推断的Y-SNP分型结果。
在本发明的一个具体实施方式中，所述引物为荧光标记引物。
在本发明的另一个具体实施方式中，其中2)还包括在获得单碱基延伸产物后，使用遗传分析仪分析该单碱基延伸产物，以获得所述10个位点的基因型的步骤。在本发明的方案中，所述遗传分析仪可以是本领域技术人员常规使用的遗传分析仪，例如ABI3130或ABI3500型遗传分析仪，通过ID-X软件或其他GeneMapper软件等分析该PCR扩增产物中所述10个位点的基因型。
本发明提供的一种对男性个体进行Y-SNP分型的系统，所述系统包括DNA获取体系，复合检测体系、推断体系；
所述DNA获取体系用于获得所述男性个体的DNA；
所述复合检测体系用于获得所述DNA 10个Y-SNP位点的基因型，并根据该基因型获得该个体的Y-SNP分型结果，
所述10个Y-SNP位点为M130，M174，M89，M201，M304，M9，M231，M175，M242，M207，获得所述10个Y-SNP位点的基因型的过程包括使用与所述10个Y-SNP位点一一对应的扩增引物获得扩增产物的步骤，以及使用与上述10个Y-SNP位点一一对应的单碱基延伸引物利用所述扩增产物获得单碱基延伸产物的步骤，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQIDNo.20的核苷酸序列，所述单碱基延伸引物为序列表中SEQ ID No.21至SEQID No.30的核苷酸序列；
所述推断体系用于根据所述个体的Y-SNP分型结果对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、或种族来源推断。
在本发明的一个具体实施方式中，所述引物为荧光标记引物。
更进一步的，所述复合检测体系还用于在获得单碱基延伸产物后，使用遗传分析仪分析该单碱基延伸产物，以获得所述10个位点的基因型。
更进一步的，所述遗传分析仪利用针对各位点的等位基因的分型标准物来确定男性个体DNA中各位点的基因型。
本发明提供的一种复合检测体系，所述体系包括男性个体DNA，10个Y-SNP位点，扩增引物，单碱基延伸引物；
所述复合检测体系用于获得所述DNA 10个Y-SNP位点的基因型，并根据该基因型获得该男性个体的Y-SNP分型结果，
所述10个Y-SNP位点为M130，M174，M89，M201，M304，M9，M231，M175，M242，M207，获得所述10个Y-SNP位点的基因型的过程包括使用与所述10个Y-SNP位点一一对应的扩增引物获得扩增产物的步骤，以及使用与上述10个Y-SNP位点一一对应的单碱基延伸引物利用所述扩增产物获得单碱基延伸产物的步骤，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQID No.20的核苷酸序列，所述单碱基延伸引物为序列表中SEQ ID No.21至SEQ ID No.30的核苷酸序列。
在本发明的方案中，所述DNA聚合酶可以是Fast Start DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Hotstart DNA聚合酶中的一种或多种。
本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。
在本发明的方案中，本发明利用所述复合检测体系进行10个Y-SNP位点的分型的方法，包括：1)将获取的男性个体DNA作为模板；2)使用所述上述10个Y-SNP位点一一对应的扩增引物作为模板的男性个体DNA进行多重PCR扩增反应以得到扩增产物；3)将所述扩增产物使用与上述10个Y-SNP位点一一对应的单碱基延伸引物获得单碱基延伸产物；4)将所述单碱基延伸产物利用遗传分析仪进行分析，以获得10个Y-SNP位点的基因型。
在本发明的方案中，所述10个Y-SNP位点信息如表1所示：
表1
本发明提供的扩增引物序列如下。所述扩增引物及其相对应的Y-SNP位点如下表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；
表2
本发明提供的单碱基延伸引物序列如下。
表3
本发明方案具有以下的优点：
1、本发明的检测方法和检测系统采用特定的Y-SNP位点组合以及引物序列，使得最终获得的分型图谱上各位点之间排布均匀，且引物特异性高，可以得到完整的Y-SNP分型，峰型尖锐清晰，平衡性好，无Pull-up峰、stutter带，无非特异性人工产物出现，完全能够满足法医Y-SNP检验的要求。
2、使用本发明的检测方法和检测系统同时检测特定10个Y-SNP位点的基因型，为亲权鉴定、种族来源推断提供数据支持。
3、本发明的方案可以通过使用荧光标记，利用常规的遗传分析仪，根据所要扩增的基因的分子量和荧光颜色的不同，获得直观的检测结果，并且该结果与现有检测系统相比，准确性为100％。
附图说明
图1显示了使用本发明系统获得的一个样本的分型结果图。
图2显示了使用本发明系统获得的标准DNA9948的分型结果图。
具体实施方式
以下实施例中使用的206份人抗凝血(男性206份)，由公安部物证鉴定中心提供。
实施例1、对本发明的对男性个体进行Y-SNP分型的方法和系统准确性的验证
在本实施例中，所述男性个体为206份男性人抗凝血，已知其个体来源，但在本申请实施例1的实施过程中设定其个体来源未知，采用本申请方法和系统对其进行Y-SNP分型，包括：
1)利用本发明的系统中的DNA获取体系获得男性个体的DNA，2)利用本发明的系统中的复合检测体系获得所述DNA 10个Y-SNP位点的基因型，并根据该基因型获得该个体的Y-SNP分型结果，3)利用本发明的系统中所述推断体系，根据所述个体的Y-SNP分型结果对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、种族来源推断。
本实施例中，所述复合检测体系用于获得男性个体的DNA的10个位点的基因型，并进一步由该基因型获得所述个体的Y-SNP分型结果；
所述10个Y-SNP位点为M130，M174，M89，M201，M304，M9，M231，M175，M242，M207，获得所述10个Y-SNP位点的基因型的过程包括使用与所述10个Y-SNP位点一一对应的扩增引物获得扩增产物的步骤，以及使用与上述10个Y-SNP位点一一对应的单碱基延伸引物利用所述扩增产物获得单碱基延伸产物的步骤，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQID No.20的核苷酸序列，所述单碱基延伸引物为序列表中SEQ ID No.21至SEQ ID No.30的核苷酸序列。
1、获得含上述206个男性个体DNA的206份静脉血作为实验样本，并使用标准DNA9948作为阳性对照样本，使用DNA Blood Midi试剂盒提取所述男性个体DNA。
2、利用所述复合检测体系对上述样本进行10个Y-SNP位点的分型，包括：使用所述扩增引物对DNA模板进行多重PCR扩增，以获得扩增产物，使用与上述10个Y-SNP位点一一对应的单碱基延伸引物利用所述扩增产物获得单碱基延伸产物；将单碱基延伸产物扩增产物利用遗传分析仪确定10个位点的基因型。具体过程如下：
2.1、扩增引物池配置
扩增引物池的配置，其中所述10个Y-SNP位点对应的扩增引物如上所述；本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
将合成好的引物用1×TE缓冲液稀释到100μM，将10个Y-SNP位点的上下游引物等比混合，得到浓度为50μM的引物。从10管PCR引物中分别取不同体积加入到一个新的离心管中，作为10重PCR引物池，在该引物池中，各Y-SNP位点的引物的终浓度为0.2μM。
2.2、复合扩增反应
本实施例使用Mastercycler pro热循环仪(PCR扩增仪)进行多重PCR反应。
(1)配置PCR mix(25μL体系)，如下表5所示。
表5
(2)扩增程序
PCR扩增过程的热循环参数为：①95℃，5min；②40个循环，每个循环94℃30sec，55℃30sec，72℃1min；③72℃，10min；④4℃，保温。
2.3、复合扩增产物纯化
扩增产物纯化，避免多余试剂干扰延伸反应。扩增产物3000rcf离心1分钟后，每份加入3μl配好的纯化试剂(每份终体积为8μl)后，封膜，3000rcf离心1分钟，运行扩增产物纯化反应程序，得到纯化的PCR产物。若实验需要暂时中断，纯化好的PCR产物可以在-20℃条件下保存。
(1)扩增产物纯化反应体系：
(2)扩增产物纯化反应程序：
2.4、单碱基延伸引物池配置
单碱基延伸引物池的配置，其中所述10个Y-SNP位点对应的单碱基延伸引物如上所述；本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
将合成好的引物用1×TE缓冲液稀释到100μM，将10个Y-SNP位点的上下游引物等比混合，得到浓度为50μM的引物。从10管PCR单碱基延伸引物中分别取不同体积加入到一个新的离心管中，作为10重PCR单碱基延伸引物池，在该单碱基延伸引物池中，各Y-SNP位点的单碱基延伸引物的终浓度为0.2μM。
2.5、复合单碱基延伸反应
使用SNaPshot Multiplex试剂盒，配制延伸反应体系后封膜，3000rcf离心1分钟，运行延伸反应程序，得到单碱基延伸产物。
(1)延伸反应体系：
(2)延伸反应程序：
2.6、单碱基延伸产物纯化
延伸产物3000rcf离心1分钟，每份加入1μl纯化试剂SAP(1U/μl,终浓度1U)后，封膜，3000rcf离心1分钟。运行延伸产物纯化程序。
延伸产物纯化反应程序：
步骤温度时间
1 37℃ 60min
2 75℃ 15min
3 15℃ ∞
2.7、单碱基延伸纯化产物分型检测
待分型样品的准备：
1.电泳上样混合物的准备，按下面比率准备内标和去离子甲酰胺组成上样混合物：50μl LIZ120内标(GeneScanTM 120LIZTM size standard)+900μl去离子甲酰胺，混合均匀。
2.每管加入9.5μl上样混合物、0.5μl单碱基延伸产物，混匀。
3.95℃变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后电泳。
ABI3130XL型遗传分析仪上进行检测。应用ABI 3130XL Date CollectionSoftware 3.1收集数据，GeneMapper 3.3软件对电泳结果进行分析，获得所述10个Y-SNP位点的基因型。
2.4、结果分析
使用本发明系统对206份DNA样品进行分型的一个代表性分型结果如图1所示，使用本发明系统获得的标准DNA9948的分型结果图如图2所示，使用本发明系统对该标准DNA分型结果与测序结果一致。
同时为了验证分型结果的准确性，从206份DNA样品中随机抽取100份DNA样品，对10个Y-SNP位点进行测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)，采用本实施例的复合检测体系获得的所有的分型结果与测序结果均一致，一致性达到100％，此结果证本发明复合检测体系分型结果准确。
3、根据所述男性个体10个Y-SNP位点的基因型获得该个体的Y-SNP分型结果，并进行父系亲属鉴定。由本实施例方法获得的上述206份检材的父系亲属鉴定结果，与其已知的个体父系亲属鉴定结果一致，说明本发明方法可以进行男性个体的父权亲权鉴定。
进一步的，上述10个Y-SNP位点的基因型也可以用于对男性个体进行家系排查、种族来源推断等。
序列表
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 一种对男性个体进行Y-SNP分型的方法和系统
<130> 167078GF
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
ctctctctct ctctctaaca tttactgttt ctactgcttt c 41
<210> 28
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
ctctctctct ctctctctct ctctcttttg tttctgttca ttcttgagaa g 51
<210> 29
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
tctctctctc tctctctctc tctctctctc ttgtgcaaaa aggtgaccaa ggtgct 56
<210> 30
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctag tcaagcaaga aattta 56
Claims (8)
1.一种对男性个体进行Y-SNP分型的方法，其特征在于，该方法包括：
1)获得所述男性个体的DNA；
2)获得所述DNA 10个Y-SNP位点的基因型，所述10个Y-SNP位点为M130，M174，M89，M201，M304，M9，M231，M175，M242，M207，包括使用与所述10个Y-SNP位点一一对应的扩增引物获得扩增产物的步骤，以及使用与上述10个Y-SNP位点一一对应的单碱基延伸引物利用所述扩增产物获得单碱基延伸产物的步骤，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQID No.20的核苷酸序列，所述单碱基延伸引物为序列表中SEQ ID No.21至SEQ ID No.30的核苷酸序列；
3)根据所述男性个体10个Y-SNP位点的基因型获得所述男性个体的Y-SNP分型结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物为荧光标记引物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中2)还包括在获得单碱基延伸产物后，使用遗传分析仪分析该单碱基延伸产物，以获得所述10个位点的基因型的步骤。
4.一种对男性个体进行Y-SNP分型的系统，其特征在于，所述系统包括DNA获取体系，复合检测体系、推断体系；
所述DNA获取体系用于获得所述男性个体的DNA；
所述复合检测体系用于获得所述DNA 10个Y-SNP位点的基因型，并根据该基因型获得该个体的Y-SNP分型结果，
所述10个Y-SNP位点为M130，M174，M89，M201，M304，M9，M231，M175，M242，M207，获得所述10个Y-SNP位点的基因型的过程包括使用与所述10个Y-SNP位点一一对应的扩增引物获得扩增产物的步骤，以及使用与上述10个Y-SNP位点一一对应的单碱基延伸引物利用所述扩增产物获得单碱基延伸产物的步骤，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ IDNo.20的核苷酸序列，所述单碱基延伸引物为序列表中SEQ ID No.21至SEQ ID No.30的核苷酸序列；
所述推断体系用于根据所述个体的Y-SNP分型结果对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、或种族来源推断。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述引物为荧光标记引物。
6.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述复合检测体系还用于在获得单碱基延伸产物后，使用遗传分析仪分析该单碱基延伸产物，以获得所述10个位点的基因型。
7.一种复合检测体系，其特征在于，所述体系包括：男性个体DNA，10个Y-SNP位点，扩增引物，单碱基延伸引物；
所述复合检测体系用于获得所述DNA 10个Y-SNP位点的基因型，并根据该基因型获得该男性个体的Y-SNP分型结果，
所述10个Y-SNP位点为M130，M174，M89，M201，M304，M9，M231，M175，M242，M207，获得所述10个Y-SNP位点的基因型的过程包括使用与所述10个Y-SNP位点一一对应的扩增引物获得扩增产物的步骤，以及使用与上述10个Y-SNP位点一一对应的单碱基延伸引物利用所述扩增产物获得单碱基延伸产物的步骤，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ IDNo.20的核苷酸序列，所述单碱基延伸引物为序列表中SEQ ID No.21至SEQ ID No.30的核苷酸序列。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述的复合检测体系。
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