CN108060237B - 基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于55个Y染色体SNP遗传标记的中国南北方汉族男性群体划分至O‑M175单倍群亚群的法医学检测试剂盒。本发明要解决的技术问题是利用Y染色体SNP遗传标记对已划分至O‑M175单倍群的中国南北方汉族男性群体来源的检材在Y染色体进化树上的位置进行进一步的细分。本发明的技术方案是基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包含了分离包装的复合扩增引物混合物和多重单碱基延伸反应引物混合物。本发明试剂盒应用了复合扩增技术和多重单碱基延伸技术，可同时获得生物性检材的55个Y染色体SNP遗传标记的基因分型，并将划分至O‑M175单倍群的中国南北方汉族群体来源的男性样本正确归属至现已公认的O‑M175单倍群的亚群上。
Description
技术领域
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于55个Y染色体SNP遗传标记用于中国南北方汉族男性群体划分至O-M175单倍群亚群的法医学复合检测试剂盒。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是指基因组中特定部位单个碱基序列的变异而引起的DNA序列多态性，广泛存在于人类基因组中。SNP大都表现为二等位基因标记，具有扩增片段小，突变率低，遗传稳定，易于自动化分型等特点，适用于降解DNA检材，表型预测及种族来源推断等方面。
Y染色体是男性所特有的染色体。由于遗传方式的不同，Y染色体可分为两端的拟常染区和占大部分的Y特异区。在减数分裂中，拟常染区可与X染色体进行配对交换，而Y特异区不会发生重组，呈单倍型独立向下传递，故又称为Y染色体非重组区(non-recombination regions of Y chromosome，NRY，以下未做特殊说明的Y染色体均指非重组区)。由于其非重组区具有父系遗传、有效群体小和地理学上的特殊性等特点，已成为研究人类进化、群体结构的有效工具之一。其中，运用单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)位点和Alu序列构建Y染色体系统发育树进行单倍群划分则是长久以来进行人类进化和群体结构研究的主要手段。随着群体遗传学的研究进展，现已发现某些SNP位点或单倍群在地区和人群中的分布存在一定的特征性，因此，对未知来源的男性样本进行SNP位点检测或单倍群的划分，在推断其地理来源或所属群体等方面具有重要的法医学意义。
国际Y染色体协会(Y Chromosome Consortium,YCC)于2002年通过对一套来源于世界不同群体的74名男性样本(YCC样本)245个Y-SNP遗传标记进行分析，用最大简约法则构建了含153个单倍群的进化树，并以此为基础提出了统一的命名系统。2008年，Karafet等在原有YCC谱系树的基础上，将Y-SNP标记增加到599个，构建了20个分枝(A-T)、含311个单倍群的新的Y染色体进化树。随着测序技术的发展，更多的可用于构建进化树的SNP位点被发现，使得单倍群的分辨率也随之越来越高。但由于其中部分SNP位点的遗传地位相同、某些位点的稳定性尚有待考证，且过多的遗传标记不利于快速检测等问题，给其在法医学检案中的应用带来了挑战。因此，针对各群体或地区，构建一个具有较高分辨率的、稳定的系统发育树显得尤为必要。汉族是中国乃至世界人口数量最大的一个民族，目前约有13亿人口，占世界总人口的19％，其人口绝大部分分布于中国，占中国总人口的93％。他们或聚居于中国东部农业发达地区，或杂居于边疆少数民族中，或在世界各国散居。汉族的遗传结构对于研究大型民族的人口扩张具有代表性意义。1万～4万年前汉藏语系的祖先由东亚南部迁徙到黄河中上游盆地，形成了最早的汉藏祖先人群，并在五六千年前分化出中国北方有史记载的华夏族，及汉族的祖先。在此后的几千年里，汉族凭借其相对先进的生产力和领先的文化，不断发展壮大，人口迅速扩张。现在的汉族在地理分布上，以秦岭-淮河为界，分为中国南方汉族和中国北方汉族，他们无论是在生产和经济生活方面，还是在服饰、饮食、居住等风俗文化方面，甚至在身材体貌、语言、方言等方面，都有着十分明显的差异。为了进一步、多方面地探索中国南北汉族之间的差异，我们着力于从遗传进化的角度展开研究。已有相关文献报道中国南北汉族在线粒体SNP上具有一定的差异性，但在Y-SNP上的差异尚未有所报道，而中国汉族人群约80％分布于O-M175单倍群及其亚群。在上述背景下，我们有必要构建一个适用于中国汉族群体的、简约的、高分辨率的系统发育树，这将不仅为检案中未知样本的溯源提供便利，在进一步了解中国南北方汉族群体方面的差异也可提供一定的帮助。
在法医学领域，从实验效率，经费和所需时间等多方面考虑，SNP遗传标记的分型首选单碱基延伸反应技术。与sanger直接测序法相比，单碱基延伸反应技术拥有独特的优势。该技术能够一次性复合检测多个SNP，具有扩增片段小，所需模板DNA量少，不受SNP位点多态性的限制等优点，特别适用于微量检材，降解检材和骨骼，毛发样本的检测。与二代测序相比，单碱基延伸反应所需费用较低，性价比较高。而且，该技术能够与当今法医遗传学实验室广泛使用的遗传标记(STR)共同应用毛细管电泳平台进行检测。因此，目前法医学领域大多采用单碱基延伸反应技术进行Y染色体SNP的研究，建立可同时分型多个Y染色体SNP的法医学检测体系。
综上所述，筛选一组适宜的Y染色体SNP遗传标记，应用单碱基延伸技术，构建一个适用于中国汉族人群的、简约的、高分辨率的、可将划分至O-M175单倍群的中国汉族男性个体样本正确归属至现已公认的O-M175单倍群的亚群上，将为法医的样本归属问题提供一种新的技术手段。在此基础上，如开发出基于现有法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台的Y染色体SNP复合检测试剂盒，将极大推动这种新技术在法医样本族群溯源问题中的推广和应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是利用Y染色体SNP遗传标记对已划分至O-M175单倍群的中国南北方汉族男性群体来源的检材在Y染色体进化树上的位置进行进一步的细分。
本发明的技术方案是基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，包括复合扩增引物混合物和多重单碱基延伸反应引物混合物。所述的基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒中的复合扩增引物混合物包含了55个Y染色体SNP遗传标记的共计110条扩增引物，各扩增引物的核苷酸序列分别如表3中SEQ ID No.1至SEQ IDNo.110所示：
表3复合扩增引物
上表中，“-”符号前为加尾序列。
其中，所述的多重单碱基延伸反应引物混合物包含55个Y染色体遗传标记的共计55条单碱基延伸引物，这些单碱基延伸引物的核苷酸序列分别为表4中的SEQ ID NO.111至SEQ ID NO.165所示。
表4单碱基延伸引物
上表中，“-”符号前为加尾序列，括号里面的碱基为重复单位，下标的数字表示该重复单位的重复次数。
进一步的，所述的法医学复合检测试剂盒还包括标准DNA。所述标准DNA为2800M标准DNA。
本发明还提供了一种上述基于55个Y染色体SNP的汉族男性单倍群亚群划分法医学复合检测试剂盒在对中国南北方汉族男性群体划分至O-M175单倍群亚群中的用途。
本发明的有益效果为：本发明试剂盒包含55个Y染色体SNP遗传标记，兼顾了系统发育树的稳定性和高分辨率，以尽可能少的位点数达到了较高的体系分辨能力，可将已划分至O-M175单倍群的中国汉族男性个体样本正确地划分至现已公认的Y染色体系统发育树分枝上更细的分枝。本试剂盒采用了复合扩增和多重单碱基延伸技术，可以同时获得生物性检材的55个Y染色体SNP遗传标记的基因分型，快速实现对生物检材的来源地或所属人群溯源。本试剂盒包括了标准DNA的分型结果，可确保分型准确；该试剂盒复合扩增产物长度最短仅88bp，最长不超过220bp，对于法医学常见的降解检材的检测具有优势，具有良好的应用前景和推广价值。
附图说明
图1本发明所检测的55个Y染色体SNP遗传标记所构成的进化树，每一个横线分枝上都标示出了对应的SNP位点及该SNP位点所决定的单倍群。从图中可以看出本发明包含了O单倍群的大部分亚型，构建了一个高分辨率的O单倍群体系；
图2本发明对样本的毛细管电泳检测结果，A为体系一的检测结果，B是体系二的检测结果。图中的横坐标数值表示DNA片段长度，纵坐标数值表示荧光强度，各荧光峰为该样本在各SNP位点的检测结果，各峰上方均标示出了该峰代表的SNP遗传标记。从图中可以清晰地观察到样本在所有55个Y染色体SNP的分型结果，它们构成了该样本的单倍型，证明本发明Y染色体SNP复合检测试剂盒可以准确检测生物学样本。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒是基于筛选得到的55个Y染色体SNP遗传标记，利用目前法医遗传学实验室常用的毛细管电泳体系构建的。该试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成。
该试剂盒的工作原理是首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，分为两个体系在两管内扩增，分别获得含有27、28个Y染色体SNP的DNA片段(注：考虑到将50个以上的SNP放在一个反应体系中复合扩增，对引物设计、引物浓度、退火温度、反应体系的优化要求很高，难度较大。故本研究将筛选得到的55个Y染色体SNP位点分为两个体系进行复合扩增)。然后分别以此27个和28个DNA片段为模板，分别利用单碱基延伸反应混合液和单碱基延伸反应引物混合液进行多重单碱基延伸反应(注：单碱基延伸反应同样分为与复合扩增反应相对应的两个体系)以获得待测样本的55个Y染色体SNP的单碱基延伸反应产物。最后将该产物进行毛细管电泳，利用各SNP位点单碱基延伸反应产物的扩增片段长度和SNP位点的突变类型，确定待测样本55个Y染色体SNP遗传标记的分型结果。
此外，2800M标准DNA作为阳性对照与样本同时进行扩增反应。首先分析分型标准DNA的分型结果准确与否，若该分型标准DNA分型结果正确，表明该次检测结果可靠，则可进一步分析确定待测样本55个Y染色体SNP遗传标记的分型结果。
在本发明中，Y染色体SNP的选择对于构建法医复合检测试剂盒尤其关键。如前所述，Y染色体SNP的父系遗传特征使其能够有效评估不同人群之间的主要差异，是用于研究人类迁徙的重要遗传标记，通常用于确定不同人群的单倍群及生物地理祖先的预测研究。在运用Y染色体SNP构建的系统发育树中，用单倍群(haplogroup，Hg)表示一组类似的单倍型(haplotype)的集合，其分布具有明显的种族地理特异性。选择单倍型类群特定的SNP位点，可避免信息的重复，检测较少的位点即可进行单倍型类群的划分，进而确定样本的种族、地理来源。在线网站ISOGG(https://isogg.org/)提供的Y染色体系统发育树给定了目前认为可用于划分单倍群的所有位点，这无疑将是目前已知最完整、分辨率最高的系统发育树。但由于其所包含的位点数量庞大、部分位点的稳定性还需考证，使得其不适用于日常检案。所以针对特定的群体或区域，选择稳定的、单倍群特定的SNP位点，可保证结果可靠，同时避免信息的重复，检测较少的位点即可进行单倍群的划分，进而追溯生物检材的人群或地理来源。
本发明试剂盒中SNP位点的选择旨在使用较少SNP位点的同时尽可能地提高系统发育树的分辨率。因此，本发明通过大量研究，得出了纳入本发明试剂盒中的Y染色体SNP位点的采纳标准：1)单倍群划分至O群的SNP位点，且O群下级分枝中所包含位点数目依照该单倍群在人群中所占百分比而有所差异，在人群中所占比重越大，则下级分枝所包含的SNP位点越多；2)在中国汉族群体中多态性良好的SNP位点；3)可以设计出合适的多重单碱基延伸引物和复合扩增引物；4)可用单碱基延伸技术获得稳定的分型结果。根据上述标准，为了均衡多SNP位点复合扩增的可行性和体系的高分辨率性，本发明首次设计了55个Y染色体SNP遗传标记位点的组合测序，首次将单倍群O进行全面系统的细分，此前从未有研究使用这种位点组合对任何人群进行研究。
根据建立的上述标准，本发明研究确认了55个Y染色体SNP遗传标记位点。经过群体调查实验(即实施例的检测实验)证明，本发明的Y染色体SNP复合检测体系可将1028名划分至O-M175单倍群的中国汉族男性样本全部正确归属至现已公认的Y染色体O单倍群亚群上。
试剂盒中所涉及的55个Y染色体SNP位点信息如表5。
表5 55个Y染色体SNP位点
本发明试剂盒在Y染色体SNP的检测中运用了复合扩增技术。复合扩增技术可以在一个反应体系中一次性地扩增多个目的DNA片段，具有方便、快捷、节约样本和成本的优点，适用于法医学鉴定的实际需要。其中，复合扩增引物的设计是该技术的关键和难点。在设计引物时，考虑了以下因素：1)GC含量适宜，约在40％～50％范围之内；2)扩增引物的退火温度应该适宜，且所有引物的退火温度尽量一致；3)分别包含27和28个Y染色体SNP遗传标记的扩增体系中各扩增片段长度应有差异，这样即可对复合扩增反应是否成功进行检测；4)扩增产物长度短，以用于降解检材的检测；5)引物自身、引物之间、引物与模板之间是否有明显的发卡结构、错配和二聚体结构的形成。
本发明根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的相关SNP位点的序列，结合实际经验，经过反复筛选，优化，得到了表3中所列的55对复合扩增引物。这些引物中，根据SNP位点设计的、能与相应SNP位点序列互补结合的特异性引物长度在18～30bp之间，部分上游引物5’端连接了长度不等的重复序列[GCCTCC(TCCCC)n]，使得分别包含27、28个Y染色体SNP遗传标记的复合扩增体系中各扩增片段长度各不相同，且均在88～220bp之间。所有引物、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构。
本发明试剂盒利用上述复合扩增引物，获得了包含55个Y染色体SNP遗传标记的扩增产物，继而以此为模板，进行单碱基延伸反应。单碱基延伸反应技术是一种基于四种荧光素标记的双脱氧核糖核苷酸进行的等位基因特异性引物延伸反应。多重单碱基延伸反应可以在一个反应体系中同时获得多个SNP位点的单碱基延伸产物，实现对多个SNP位点的一次性同时检测。其特点在于，通过设计不同长度的单碱基延伸引物，可以同时分析多个SNP位点，即根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点，根据不同的双脱氧核糖核苷酸标记的荧光素不同区分SNP的不同等位基因。为了实现多个SNP位点同时进行单碱基延伸反应，多重单碱基延伸引物的设计应注意以下因素：1)退火温度大致相同；2)引物自身、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构；3)多重单碱基延伸引物之间长度必须有适当的差异，才能根据不同长度DNA片段电泳迁移率的不同将不同SNP位点的单碱基延伸产物区别开来。
在本发明的法医学复合检测试剂盒中，设计的单碱基延伸引物包括两个部分，第一部分为3’端的特异性序列，可与SNP上游序列互补结合，第二部分为5’端的加尾序列，为长度有差异的重复序列[GCCTCC(TCCCC)n]或非人源DNA序列。加尾序列的应用使不同位点的单碱基延伸引物长度不同，最终使不同位点的单碱基延伸产物之间有长度差异。考虑到不同长度范围的DNA片段在毛细管电泳中电泳行为的差异，在我们设计的拥有相同等位基因的SNP基因座的单碱基延伸引物中，30bp以下的引物之间相差5bp，31至50bp的引物之间相差4bp，51bp至60bp的引物之间至少相差3bp，61bp以上的引物之间至少相差2bp。
最后设计出的所有55个Y染色体SNP位点复合扩增引物和多重单碱基延伸引物的序列参见表6(各序列的序列号分别在表3和表4中)。
表6 55个Y染色体SNP位点复合扩增引物和多重单碱基延伸引物参照表
本发明试剂盒中引入阳性对照是作为质量控制，用以评估单次测序结果是否可靠。本发明中提供的阳性对照包括了2800M标准DNA样本的所有55个染色体SNP遗传标记的标准分型结果。对未知样本进行检测时，并列地进行标准DNA的扩增和测序，通过对2800M标准DNA分型结果的分析，评估当次检测结果的可靠性，决定是否进行后续分析。若结果可靠，则可对未知样本进行分型，并对其所属单倍群进行划分。
本发明试剂盒的结果分析在毛细管电泳平台上进行。毛细管电泳法已在法医遗传学实验室广泛应用。本发明选择复合扩增和单碱基延伸技术进行Y染色体遗传的检测，根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点，根据荧光素的不同区分SNP的不同等位基因，利用目前法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台即可进行分析。因此本发明建立的基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒可以直接应用于任何一个有毛细管电泳平台的法医遗传实验室，具有普适性，易于推广应用。
更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分可为：
a)复合扩增反应混合液：含PCR缓冲溶液、DNA聚合酶等常用成分。
b)复合扩增引物混合物：如表1所示的55个Y染色体SNP遗传标记的扩增引物对组成的复合扩增引物混合物；复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物用于获得含有55个Y染色体SNP遗传标记的DNA片段。
c)扩增产物纯化试剂：核酸外切酶1(Exo I)和虾碱性磷酸酶(SAP)；用于将复合扩增的产物进行纯化，以便于进行下一步操作。
d)多重单碱基延伸反应引物混合物：表2所述的55条多重单碱基延伸反应引物组成的混合物。
e)单碱基延伸反应混合液：含DNA聚合酶和四种荧光标记的双脱氧核糖核酸等成分的单碱基延伸反应缓冲液。
复合扩增反应混合液、扩增产物纯化试剂可按本领域常用的配方或按分子生物学手册进行配制，也可直接使用商业化的产品。单碱基延伸反应混合液一般使用商业化的产品。
至于提取待检测样本中的DNA的模板，可使用本领域目前的各种常规试剂，提取DNA模板可以参照现有的常规方法即可进行。
利用本发明所述试剂盒，可以对法医DNA样本进行分析。分析方法包括以下步骤；
1)提取待检测样本的DNA，作为扩增模板；
2)利用上述复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液对步骤1提取的DNA进行分为两个体系进行复合扩增；所述复合扩增PCR的反应的循环参数为：95℃，15分钟；94℃，30秒，66℃(降落PCR，每隔一个循环，温度下降0.5℃)，90秒，72℃，30秒，12个循环；94℃，30秒，60℃，90秒，72℃，30秒，12个循环，然后72℃，10分钟；
3)纯化步骤2的复合扩增产物，并以它为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行多重单碱基延伸反应；
所述单碱基延伸反应的循环参数为：96℃，10秒，50℃，5秒，60℃，30秒，25个循环后4℃保存；
4)纯化步骤3的产物后进行毛细管电泳分析，根据电泳结果获得样本的基因型。
进一步的，上述方法步骤4中所述的测序结果分析包括以下步骤：在对2800M标准DNA分型结果进行分析，认为该次测序结果可信后，方可进行对该次测序其它样本进行分析，获得待测样本基因型。
以下用具体实例进一步具体说明本发明，其中所用试剂无特殊说明均使用以下试剂和仪器；
1)自动激光荧光毛细管电泳DNA测序仪3130型，ABI公司
2)ProFlexTM PCR扩增仪，赛默飞公司
3)台式高速离心机，赛默飞公司
4)纯水装置Millipore公司
5)移液器EPPENDORF公司
6)Hi-Di甲酰胺ABI公司
7)核酸外切酶1TaKaRa Biotechnology公司
8)虾碱性磷酸酶TaKaRa Biotechnology公司
9)内标(GenescanTM Size Standard GS-120LIZ)ABI公司
10)漩涡振荡器，赛默飞公司
实施例1本发明试剂盒的制备
基于Y染色体SNP的汉族男性单倍群亚群划分复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：
a)复合扩增引物混合物。由表3所示的扩增引物混合得到，由Invitrogen公司合成，将合成好的55对扩增引物用超纯水配置为100pM/μL，然后按照表7中的比例混合，制成复合扩增引物混合物。
b)复合扩增反应混合液。本实施例中使用Qiagen公司的PCR反应混合液MultiplexPCR Mix。
c)多重单碱基延伸反应引物混合物。由表4所示的单碱基延伸反应引物混合得到，由Invitrogen公司合成。将合成好的55个单碱基延伸反应引物用超纯水配置为50pM/μL，以表8中给出参数配成多重单碱基延伸引物混合物。
d)单碱基延伸反应混合液。本实施例中使用ABI公司的产品SNaPshot MultiplexReady Reaction Mix。
将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于55个Y染色体SNP的汉族男性单倍群亚群划分复合检测试剂盒，用于后续的实验。
表7复合扩增引物的浓度和各扩增片段大小
表8多重单碱基延伸引物的浓度及大小
实施例2使用本发明试剂盒检测1028个无关汉族男性个体检材
使用上述基于55个Y染色体SNP的汉族男性单倍群亚群划分复合检测试剂盒，对1028个划分至O-M175单倍群的中国汉族男性无关个体的进行检测。具体的检测过程按如下进行：
a、用Chelex-100法从1028个无关中国汉族男性个体血样中提取DNA，作为复合扩增模板；
b、以步骤a中的DNA模板，利用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液将样本在下述扩增体系中进行复合PCR扩增。体系：复合扩增引物混合物0.28μL，复合扩增反应混合液2.5μL，模板DNA 1μL，加ddH2O至5μL；95℃，15分钟；94℃，30秒，66℃(降落PCR，每隔一个循环，温度下降0.5℃)，90秒，72℃，30秒，12个循环；94℃，30秒，60℃，90秒，72℃，30秒，12个循环，然后72℃，10分钟。；
c、多重PCR产物的纯化；每一个样品扩增产物的纯化体系：Exo I(5U/μL)1.2μL，SAP(1U/μL)2.5μL，多重PCR产物5μL；扩增产物纯化反应条件：37℃60分钟，80℃10分钟，4℃保存；
d、以上一步纯化得到的产物为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物进行单碱基延伸反应。体系：单碱基延伸反应混合液1.5μL，多重单碱基延伸引物混合物0.3μL，纯化后扩增产物1.5μL，去离子水1.7μL；单碱基延伸反应的热循环参数：96℃10秒，50℃5秒，60℃30秒，25个循环，4℃保存。
e、纯化上一步单碱基延伸反应产物；纯化体系：SAP(1U/μL)1μL，单碱基延伸反应产物5μL；纯化反应条件：37℃60分钟，80℃10分钟，4℃保存；
f、毛细管电泳：取1μL步骤e中得到的纯化后的延伸产物，加入10μL的Hi-Di甲醇胺和0.1μL内标混匀；然后95℃下变性3分钟，4℃下迅速冷却后，用美国ABI公司的DNA自动分析仪(自动激光荧光毛细管电泳DNA测序仪，3130型)进行电泳检测。电泳条件：1500V电压，36cm毛细管，POP7凝胶，电泳18分钟；应用Genemapper ID V3.2软件进行结果分析，结果如图2所示。
经过分析检测1028个划分至O-M175单倍群的中国汉族无关男性样本，可以得到49种单倍型，结果见表9(注：表9中单倍群编号所对应的单倍群见表10)。具体划分方法如下：如图1所示，因为进化树是呈树状分布的，不同单倍群即为树的分枝，而各SNP在树上则分布于各自的节点。进行单倍群划分时，从树根部往上看，若该节点SNP为突变型，即，阳性，则可沿分枝往上，若某节点为阴性，则该节点上一个SNP所在节点为终点，其所提示单倍群为该样本所在单倍群。因而，一个单倍群往往系由多个SNP分型决定的。
表9在检测样本中观察到的49种单倍型
续表9
表10表9中单倍群编号所对应的单倍群
序列表
<110> 四川大学
<120> 基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒
<130> A180011K
<160> 165
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttagtgctct gtgacatacc aatc 24
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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accagcctag ccaacatagc 20
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctccgcca aaaaagagcc cacattgcca ag 32
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagcctatct tagatcagac ctatc 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
ttcctaatct ggcagcaatg tt 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgttaaacgg aaccctctac ttg 23
<210> 100
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gcatcctgct gtggctaag 19
<210> 101
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gctaagatat gtcacaagtc cccattag 28
<210> 102
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
atctcttggg cctatcaact agtca 25
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gcctccgcta ccagcctacc accag 25
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
tgtttccctt taagaagcca aga 23
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
atttcatctt tcccgcatcc aaa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gattcctcac acagccaata gc 22
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
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<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
actggtcctg aactcctgag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
attggattga tttcagcctt cttc 24
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
ttctgtgttc cttgctccat ta 22
<210> 111
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctcgg cacatgcctt ctcacttctc 60
<210> 112
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctggt 60
tattccaatt cagcatacag gc 82
<210> 113
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
gcctcctccc ctcccctccc ctccccacaa aaggtacttt aagtatggta ggcaga 56
<210> 114
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
gcctcctccc ctcaaaacaa acagtgaatc ctgaacacaa 40
<210> 115
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccccttgt tttttttttt 60
atgtgttttt gtaagcc 77
<210> 116
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
gcctcctccc ctcccctccc tttttcaagt gatgttttag gcactaattt 50
<210> 117
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gcctcctccc ctccctgatt tccaagtttt gaagtcatta tgaa 44
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<211> 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
gcctcctccc ctcccctccc ctcctgcaaa gttaggagat ttactgaatc agtg 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
gcctcctccc ctcccctccc acattttctg aatgtgaact gaagttct 48
<210> 120
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
gcctcctccc ctcccctaaa tttgttttct tgcttaagtt ccatca 46
<210> 121
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcgaaatct 60
cccatcctgt ggctt 75
<210> 122
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctggttacat aaataaggtt 60
tttttttggt tg 72
<210> 123
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc gtgtccatag taacctgttg 60
atgaaacc 68
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
gcctctggaa aggctaagcc atcca 25
<210> 125
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ccacatgcat ctttcagttg 60
tcac 64
<210> 126
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
gcctcctccc cgcctgtctt ctctctggga tcct 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccccaga ttcaagtgat tcctatgcct 60
ca 62
<210> 128
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc 60
ctcaaactcc tgacctcagg taatcc 86
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
gcctcctccc ctccccgctt ttcttattcc tgcttcttct gc 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc gagaggagct 60
cattacatga cagattaaga 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
gcctcctccc ctcccctccc ctcgaccttg agaagcacaa atcatctata aa 52
<210> 132
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
gcctccttct cacattgatg ggacccct 28
<210> 133
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctcga 60
attttgcaat ttaagtctta gcccttct 88
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
caggcacatg gaaggaacag aa 22
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
gcctcctcaa cctgttgtcc agttgcactt c 31
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
gcctcctccc cctttattca gattttcccc tgagagc 37
<210> 137
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccggatac atgggctgca 60
acaaga 66
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
cagaccggca tttgggaact ac 22
<210> 139
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
gcctcctccc ctcccctccc cagagccctg ctagtaggca cca 43
<210> 140
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc atctttcaaa aatcagatgt 60
aattgtaat 69
<210> 141
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcggggatt ctaaaatgtt tccag 55
<210> 142
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccg ctaatgcagc ctttgtaggc 60
tct 63
<210> 143
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc cccttcagtt 60
gacatatgga ctaccttctg 80
<210> 144
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctagtaatgc cacaagaatt agaaagatac 60
a 61
<210> 145
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc cctggaggat cgtggccgt 59
<210> 146
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctctg 60
tgatcttggt taagtcattt gatctcag 88
<210> 147
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
gcctcctccc ctcccctctc tttagcattt tggtcccatc tttt 44
<210> 148
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc 60
gagagatact tttgatcccc accaat 86
<210> 149
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
gcctcctccc ctcccctccc ctcaataact caccaaagga atgcacatct 50
<210> 150
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
gcctcctctc tgcagcaccc agggat 26
<210> 151
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
gcctcctccc ctcccctccc ctctcatact gtagaaaact ttaaatcctc cct 53
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
gcctcctcct aaaaatggtg gcacatgcct 30
<210> 153
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
gcctcctccc ctaacaaagc tgaaagcatc acgc 34
<210> 154
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccgaatt tgtcttgaaa 60
taatttgacc tcca 74
<210> 155
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc tcaactgaaa tatccaggtt 60
ctcaca 66
<210> 156
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctggt gtttatttgg tggatcggtc a 51
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
tgcactcgtg tgtgtgtgca 20
<210> 158
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
gcctcctccc ctctcttgaa cccgtaacac catca 35
<210> 159
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccg 60
caggtggatt gctggatcat at 82
<210> 160
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
gcctcctccc ctccccccca accccaaact ctcacttc 38
<210> 161
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctccgtgtat 60
gtttctcttt tatgtcacaa tgct 84
<210> 162
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
gcctcctccc ctcccctccc ctccgcaaag ccaataaaag cccctaa 47
<210> 163
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
gcctcctccc ctcccctccc aaaaccggca ttgatggtaa c 41
<210> 164
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc cttgagagca taaactgtaa 60
agatcagaag t 71
<210> 165
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
gcctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccc ctcccctccg aagttttatt 60
attgatgcaa gccctaa 77
Claims (5)
1.基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：包括分离包装的复合扩增引物混合物和多重单碱基延伸反应引物混合物；所述的复合扩增引物混合物包含了55个Y染色体SNP遗传标记的共计110条扩增引物，所述的多重单碱基延伸反应引物混合物包含55个Y染色体SNP遗传标记的共计55条单碱基延伸引物；
所述的复合扩增引物混合物各扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1 至SEQ IDNo.110所示；
所述的多重单碱基延伸反应引物混合物中各引物的核苷酸序列分别为的SEQ IDNO.111至SEQ ID NO.165所示。
2.根据权利要求1所述的基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：还包括标准DNA。
3.根据权利要求2所述的基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：所述标准DNA为 2800M标准DNA。
4.根据权利要求1所述的基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：还包括复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液；所述复合扩增反应混合液为Qiagen公司的PCR反应混合液Multiplex PCR Mix，所述单碱基延伸反应混合液为ABI公司的产品SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix。
5.权利要求1~4任一项所述的基于55个Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒在对中国南北方汉族男性群体划分至O-M175单倍群亚群中的用途。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Family Applications (1)
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