CN111647668A - 一种检测人类50个y-snp基因座的快速荧光复合扩增试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人类50个Y‑SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒及应用，包括用于单管扩增50个人类Y‑SNP基因座的50组引物组，50组引物组分为5个群组。本发明提供的检测人类50个Y‑SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒及应用，可实现1小时内快速批量检测90个样本，且每个样本检测50个Y‑SNP基因座，检测效率大大提高；而且整个操作和结果分析方法完全兼容目前法医DNA实验室普及的PCR‑毛细管电泳平台，操作方法简单、易于掌握，能够实现样本Y‑SNP检测免提取直接扩增，即血液样本直接扩增，而且扩增片段短，适合高度降解DNA模板的检测，应用于男性个体识别、家系搜索、推断未知样本的族源。
Description
技术领域
本发明属于法医遗传学领域，具体涉及一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒及应用。
背景技术
随着Y-STR数据库的建立和现场案件的应用推广，Y-STR作为案件检测标记的使用越来越广泛。但由于Y-STR突变率很高，同一父系的个体可能会发生突变，进而影响犯罪现场检材的地理、民族甚至家系的判断。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入而形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。与STR相比，SNP具有突变率低、遗传稳定、适用于高度降解检材分析等优点，近年来已被广泛用于人类起源、进化分析、人群迁移研究和法医学应用等领域。
在法医学应用领域，通过构建具有族源区分能力的Y-SNP复合扩增体系，即可用于案件检材的民族和来源区域分析，也可作为Y-STR复合扩增体系的性能补充，以提高其对检材个体识别能力。此外，对于降解检材，Y-SNP复合扩增体系具有检材片段小、检测时间短、检测灵敏度高等优点，能够弥补现场检材因降解、微量导致的难以检测的难题。
目前，市场上检测Y-SNP的方法主要基于微测序技术(SNaPshot技术)、焦磷酸测序和二代测序技术，这些检测技术大都操作繁琐、耗时较长。
中国发明专利，授权公告号：CN103131787B，专利名称：基于Y染色体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成，实现利用Y染色体SNP遗传标记对人类生物学检材进行法医学亲缘关系鉴定和个人识别，可用于法医学常见的降解检材的检测，但存在检测位点覆盖少、所选位点的族源区分能力低以及采用双标记引物设计成本高等缺陷。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒及应用。
为实现上述目的，达到上述技术效果，本发明采用的技术方案为：
一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，包括用于单管扩增50个人类Y-SNP基因座的50组引物组。
优选的，50组引物组分为5个群组，第一群组包含的基因座及其对应引物序列为：M175：SEQ ID NO:1～2、F265：SEQ ID NO:3～5、F446：SEQ ID NO:6～8、F140：SEQ ID NO:9～11、F78：SEQ ID NO:12～14、F81：SEQ ID NO:15～17、F533：SEQ ID NO:18～20、CTS2458：SEQ ID NO:21～23、F492：SEQ ID NO:24～26、F656：SEQ ID NO:27～29、A12440：SEQ IDNO:30～32、F65：SEQ ID NO:33～35；第二群组包含的基因座及其对应引物序列为：Z23505：SEQ ID NO:36～38、CTS11553：SEQ ID NO:39～41、CTS4585：SEQ ID NO:42～44、YP4610：SEQ ID NO:45～47、B386：SEQ ID NO:48～50、SK1555：SEQ ID NO:51～53、SK1568：SEQ IDNO:54～56、M101：SEQ ID NO:57～59、Z23392：SEQ ID NO:60～62、Z23442：SEQ ID NO:63～65、Z2935：SEQ ID NO:66～68、F701：SEQ ID NO:69～71；第三群组包含的基因座及其对应引物序列为：M2124：SEQ ID NO:72～74、L1417：SEQ ID NO:75～77、YP657：SEQ ID NO:78～80、S346：SEQ ID NO:81～83、M558：SEQ ID NO:84～86、V2897：SEQ ID NO:87～89、CTS2393：SEQ ID NO:90～92、L732：SEQ ID NO:93～95、CTS7324：SEQ ID NO:96～98、M2019：SEQ ID NO:99～101、F1228：SEQ ID NO:102～104；第四群组包含的基因座及其对应引物序列为：CTS3300：SEQ ID NO:105～107、CTS6897：SEQ ID NO:108～110、CTS1178：SEQID NO:111～113、CTS11058：SEQ ID NO:114～116、Z31829：SEQ ID NO:117～119、Z1356：SEQ ID NO:120～122、Z31803：SEQ ID NO:123～125、Z27346：SEQ ID NO:126～128；第五群组包含的基因座及其对应引物序列为：Z27338：SEQ ID NO:129～131、FGC41743.2：SEQ IDNO:132～134、Z40590：SEQ ID NO:135～137、F2465：SEQ ID NO:138～140、CTS6103：SEQ IDNO:141～143、M207：SEQ ID NO:144～146、M130：SEQ ID NO:147～149。
优选的，引物在扩增体系中的终浓度依次分别为：M175：0.1μM、F265：0.15μM、F446：0.15μM、F140：0.15μM、F78：0.1μM、F81：0.12μM、F533：0.15μM、CTS2458：0.12μM、F492：0.15μM、F656：0.15μM、A12440：0.1μM、F65：0.1μM、Z23505：0.2μM、CTS11553：0.12μM、CTS4585：0.08μM、YP4610：0.1μM、B386：0.1μM、SK1555：0.15μM、SK1568：0.12μM、M101：0.08μM、Z23392：0.12μM、Z23442：0.2μM、Z2935：0.2μM、F701：0.08μM、M2124：0.12μM、L1417：0.2μM、YP657：0.2μM、S346：0.2μM、M558：0.2μM、V2897：0.15μM、CTS2393：0.12μM、L732：0.1μM、CTS7324：0.15μM、M2019：0.2μM、F1228：0.12μM、CTS3300：0.12μM、CTS6897：0.15μM、CTS1178：0.2μM、CTS11058：0.15μM、Z31829：0.15μM、Z1356：0.1μM、Z31803：0.12μM、Z27346：0.12μM、Z27338：0.2μM、FGC41743.2：0.15μM、Z40590：0.1μM、F2465：0.12μM、CTS6103：0.08μM、M207：0.15μM、M130：0.12μM。
优选的，每个群组中至少一条引物的5’端标记有荧光染料，同一群组使用相同的荧光染料标记，各群组的荧光染料标记互不相同。
优选的，第一群组采用FAM荧光染料标记，第二组群组采用HEX荧光染料标记，第三群组采用SUM荧光染料标记，第四群组采用LYN荧光染料标记，第五群组采用PUR荧光染料标记。
优选的，还包括复合扩增体系，所述复合扩增体系包括Premix、Y-SNP引物复合物和sdH2O。
优选的，所述Premix包括以下组分：Tris-HCl，终浓度25～50mM、pH8.1；KCl，终浓度30～60mM；MgCl2，终浓度1.5～3.5mM；dNTPs，终浓度0.15-0.35mM；甘油，终浓度2～8％；BSA，终浓度0.5～3mg/mL；Prionex，终浓度0.05～2％；Taq酶，终浓度0.4U/μL。
优选的，所述试剂盒是扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性5s，60℃退火20s，65℃延伸30s，共10个循环；95℃变性5s，58℃退火延伸40s，共20个循环；60℃终延伸10min。
优选的，所述试剂盒的扩增产物长度小于200bp。
本发明还提供了一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒在男性个体识别、家系搜索、族源推断的法医学检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明通过前期基础实验及数据统计分析，优选人群中高频的50个Y-SNP基因座，这些基因座可以用于男性个体识别、家系搜索，又可以应用于推断未知样本的族源；
2、本发明提供的检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒可实现1小时内快速批量检测，样本数多达90个样本，且每个样本检测50个Y-SNP基因座，检测效率大大提高；而且整个操作和结果分析方法完全兼容目前法医DNA实验室普及的PCR-毛细管电泳平台，操作方法简单、易于掌握；
3、本发明提供的检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒使用“三引物法”及扩增体系，具有优选特异性好、抗干扰强的复合扩增引物，可实现样本Y-SNP检测免提取直接扩增，即血液样本直接扩增，而且扩增片段短，适合高度降解DNA模板的检测；
4、特异性强，灵敏度高，检测位点覆盖多，所选位点的族源区分能力强，采用单标记引物设计，成本低，实用性强，应用前景广阔。
附图说明
图1为实施例1的男性血卡样本直接扩增分型图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1
如图1所示，一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，基于一代测序平台使用50组引物组单管扩增50个Y-SNP基因座。
1)、50个Y-SNP基因座的筛选步骤为：
测试Y染色体进化树上大支单倍群位点，分析汉族及其他族群分型结果，统计每个族群单倍群分布情况，结合ISOGG数据库和文献报道信息，筛选东亚和世界其他族群高频基因座，最终筛选50个Y-SNP位点用于扩增体系构建。
所筛选的50个Y-SNP基因座信息如下表1所示：
表1
2)Y-SNP基因座三引物设计
“三引物”设计的基本思路是设计两条非标记引物和一条共用的荧光素标记引物。将等位基因特异性碱基置于非标记引物3'末端，如果非标记3'末端特异性碱基与受检样本DNA基因型正确互补配对，则扩增正常；反之，非标记引物3'末端的特异性碱基与受检样本DNA基因型错误配对。M175基因座是插入缺失位点，因此无需采用“三引物”扩增，只要一对引物即可实现检测的目的。
除扩增M175基因座的引物为引物对外，其余人类Y-SNP基因座均采用“三引物”扩增方法，三引物包括一条标记荧光素的公共引物、一条野生型非标记引物和一条突变型非标记引物。扩增产物无需处理，直接采用法医领域常用的毛细管电泳检测即可获得结果。
50个Y-SNP基因座、对应的引物以及引物的终浓度分别如表2所示。
表2
每个群组中至少一条引物的5’端标记有荧光染料，同一群组使用相同的荧光染料标记，各群组的荧光染料标记不相同。
荧光染料选自FAM、HEX、SUM、LYN或PUR。
优选地，第一群组采用FAM荧光染料标记；第二组群组采用HEX荧光染料标记；第三群组采用SUM荧光染料标记；第四群组采用LYN荧光染料标记；第五群组采用PUR荧光染料标记。
所设计的50个Y-SNP基因座引物序列和荧光标记信息如下表3所示：
表3
3)PCR反应buffer和扩增程序调节
(1)PCR反应的buffer(即Premix)包含扩增反应所必须的各种离子、dNTPs和酶，根据PCR需要还可以添加一些特异性PCR增强剂。但是为了能够提高PCR反应的扩增特异性、扩增效率以及抗干扰能力，需要对以上各种组分进行浓度的优化。
本发明提供的检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，还包括复合扩增体系，复合扩增体系包括Premix、复合引物组分和sdH2O，其中，Premix所含组分包括：终浓度25～50mM、pH 8.1的Tris-HCl，终浓度30～60mM的KCl，终浓度1.5～3.5mM的MgCl2，终浓度0.15～0.35mM的dNTPs，终浓度2～8％的甘油，终浓度0.5～3mg/mL的BSA，终浓度0.05～2％的Prionex，终浓度0.4U/μL的高效Taq酶。
本实施例的试剂盒中PCR反应buffer包含的组分优化的浓度范围如下表4。
表4
| 组分 | 终浓度 |
| PH 8.1的Tris-HCl | 50mM |
| KCl | 40mM |
| MgCl<sub>2</sub> | 3mM |
| dNTPs | 0.3mM |
| 甘油 | 20％ |
| BSA | 1mg/mL |
| Prionex | 0.1％ |
| Taq酶 | 0.4U/μL |
(2)PCR扩增程序和普通PCR一样，需要进行变性、退火、延伸三个步骤的循环，才能富集目的片段，扩增程序如表5所示：
表5
经上述复合扩增反应所得的扩增产物长度均小于200bp。
本实施例的试剂盒中扩增体系组分及含量见下表6：
表6
1μL PCR产物、10μL去离子甲酰胺和0.5μL内标AGCU SIZ-500，混匀，95℃、2min并立即冰浴5min。使用3500XL型基因分析仪以1.25kv、30s的进样模式进行电泳，整个电泳时间30-40min。电泳数据通过GeneMapper IDX v 1.5分析软件进行等位基因分型。
图1为本实施例1对一男性血卡样本直接扩增的分型图，图1A、1B、1C、1D和1E分别为第一群组、第二群组、第三群组、第四群组和第五群组的图谱，横坐标为片段检测大小范围(50～210bp)，纵坐标为荧光信号强度或片段峰高，从图1结果可知，位点检出率为100％，整体均衡性较好，可适用于血卡检材。
本发明提供的检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒能够应用于男性个体识别、家系搜索、族源推断的法医学复合检测，适合法医学常见的降解检材的检测。
本发明的有益效果为：
本发明依托PCR-毛细管电泳平台，构建了一种高效、操作简单、快速且抗干扰能力强的Y-SNP快速荧光复合扩增试剂盒，该试剂盒特异性好，灵敏度高，抗干扰能力强，可以应用于男性个体识别、家系搜索、族源推断及降解检材的检测，既可应用于中国人群的法医遗传学研究，也可为现场案件检材检测提供一定的技术支持。通过分析汉族及其他族群分型测试结果，统计每个族群单倍群分布情况，结合ISOGG数据库和文献报道信息，筛选了东亚和世界其他族群高频基因座，本发明可致力于汉族与其他族群的差异性分析；
本发明提供的检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒可实现1小时内快速批量检测，样本数多达90个样本，需要说明的是，当前国内外现有的PCR-毛细管电泳平台，每次检测的最大样本量为96个样本，但在实际检测中，每次检测需有一个阳性对照、一个阴性对照、一个复检样本和三个阳性标准物质，因此PCR-毛细管电泳平台一次最大可检测样本数为90个。
本发明未具体描述的部分采用现有技术，未详细描述的部件采用现有产品即可，在此不做赘述。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，包括用于单管扩增50个人类Y-SNP基因座的50组引物组。
2.根据权利要求1所述的一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，50组引物组分为5个群组，第一群组包含的基因座及其对应引物序列为：M175：SEQ ID NO:1～2、F265：SEQ ID NO:3～5、F446：SEQ ID NO:6～8、F140：SEQ ID NO:9～11、F78：SEQ ID NO:12～14、F81：SEQ ID NO:15～17、F533：SEQ ID NO:18～20、CTS2458：SEQID NO:21～23、F492：SEQ ID NO:24～26、F656：SEQ ID NO:27～29、A12440：SEQ ID NO:30～32、F65：SEQ ID NO:33～35；第二群组包含的基因座及其对应引物序列为：Z23505：SEQID NO:36～38、CTS11553：SEQ ID NO:39～41、CTS4585：SEQ ID NO:42～44、YP4610：SEQ IDNO:45～47、B386：SEQ ID NO:48～50、SK1555：SEQ ID NO:51～53、SK1568：SEQ ID NO:54～56、M101：SEQ ID NO:57～59、Z23392：SEQ ID NO:60～62、Z23442：SEQ ID NO:63～65、Z2935：SEQ ID NO:66～68、F701：SEQ ID NO:69～71；第三群组包含的基因座及其对应引物序列为：M2124：SEQ ID NO:72～74、L1417：SEQ ID NO:75～77、YP657：SEQ ID NO:78～80、S346：SEQ ID NO:81～83、M558：SEQ ID NO:84～86、V2897：SEQ ID NO:87～89、CTS2393：SEQ ID NO:90～92、L732：SEQ ID NO:93～95、CTS7324：SEQ ID NO:96～98、M2019：SEQ IDNO:99～101、F1228：SEQ ID NO:102～104；第四群组包含的基因座及其对应引物序列为：CTS3300：SEQ ID NO:105～107、CTS6897：SEQ ID NO:108～110、CTS1178：SEQ ID NO:111～113、CTS11058：SEQ ID NO:114～116、Z31829：SEQ ID NO:117～119、Z1356：SEQ ID NO:120～122、Z31803：SEQ ID NO:123～125、Z27346：SEQ ID NO:126～128；第五群组包含的基因座及其对应引物序列为：Z27338：SEQ ID NO:129～131、FGC41743.2：SEQ ID NO:132～134、Z40590：SEQ ID NO:135～137、F2465：SEQ ID NO:138～140、CTS6103：SEQ ID NO:141～143、M207：SEQ ID NO:144～146、M130：SEQ ID NO:147～149。
3.根据权利要求2所述的一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，引物在扩增体系中的终浓度依次分别为：M175：0.1μM、F265：0.15μM、F446：0.15μM、F140：0.15μM、F78：0.1μM、F81：0.12μM、F533：0.15μM、CTS2458：0.12μM、F492：0.15μM、F656：0.15μM、A12440：0.1μM、F65：0.1μM、Z23505：0.2μM、CTS11553：0.12μM、CTS4585：0.08μM、YP4610：0.1μM、B386：0.1μM、SK1555：0.15μM、SK1568：0.12μM、M101：0.08μM、Z23392：0.12μM、Z23442：0.2μM、Z2935：0.2μM、F701：0.08μM、M2124：0.12μM、L1417：0.2μM、YP657：0.2μM、S346：0.2μM、M558：0.2μM、V2897：0.15μM、CTS2393：0.12μM、L732：0.1μM、CTS7324：0.15μM、M2019：0.2μM、F1228：0.12μM、CTS3300：0.12μM、CTS6897：0.15μM、CTS1178：0.2μM、CTS11058：0.15μM、Z31829：0.15μM、Z1356：0.1μM、Z31803：0.12μM、Z27346：0.12μM、Z27338：0.2μM、FGC41743.2：0.15μM、Z40590：0.1μM、F2465：0.12μM、CTS6103：0.08μM、M207：0.15μM、M130：0.12μM。
4.根据权利要求2所述的一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，每个群组中至少一条引物的5’端标记有荧光染料，同一群组使用相同的荧光染料标记，各群组的荧光染料标记互不相同。
5.根据权利要求2所述的一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，第一群组采用FAM荧光染料标记，第二组群组采用HEX荧光染料标记，第三群组采用SUM荧光染料标记，第四群组采用LYN荧光染料标记，第五群组采用PUR荧光染料标记。
6.根据权利要求1所述的一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，还包括复合扩增体系，所述复合扩增体系包括Premix、Y-SNP引物复合物和sdH2O。
7.根据权利要求6所述的一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述Premix包括以下组分：Tris-HCl，终浓度25～50mM、pH8.1；KCl，终浓度30～60mM；MgCl2，终浓度1.5～3.5mM；dNTPs，终浓度0.15-0.35mM；甘油，终浓度2～8％；BSA，终浓度0.5～3mg/mL；Prionex，终浓度0.05～2％；Taq酶，终浓度0.4U/μL。
8.根据权利要求1所述的一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性5s，60℃退火20s，65℃延伸30s，共10个循环；95℃变性5s，58℃退火延伸40s，共20个循环；60℃终延伸10min。
9.根据权利要求1所述的一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增产物长度小于200bp。
10.一种检测人类50个Y-SNP基因座的快速荧光复合扩增试剂盒在男性个体识别、家系搜索、族源推断的法医学检测中的应用。
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