CN110643712A

CN110643712A - 一种同步检测22个基因位点的五色荧光str分型方法及其专用试剂盒

Info

Publication number: CN110643712A
Application number: CN201810665834.2A
Authority: CN
Inventors: 李生斌; 杨日华; 伏东科; 沈瑞霖
Original assignee: Shenzhen Huada Forensic Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Huada Forensic Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2020-01-03

Abstract

本发明公开了一种同步检测22个基因位点的五色荧光STR分型方法及其专用试剂盒。该方法包括如下步骤：以待测个体的基因组DNA为模板，采用试剂盒进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；取PCR扩增产物，变性，然后毛细管电泳检测，得到待测个体的基因组DNA的22个基因位点的基因型，进而获得待测个体的STR分型结果。试剂盒包括引物对组合，组成引物对组合的44条引物的核苷酸序列依次如序列表中序列1至44所示，每个引物对中的一条引物的用荧光标记。本发明提供的试剂盒采用五色荧光标记复合扩增技术，可一次性扩增分析22个基因位点，包含更多的遗传信息量。该试剂盒与市面上主流CODIS位点联用，可以提高全同胞关系中的鉴定能力，提高试剂盒的兼容性和鉴定的准确性。本发明具有重大的应用价值。

Description

一种同步检测22个基因位点的五色荧光STR分型方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同步检测22个基因位点的五色荧光STR分型方法及其专用试剂盒。

背景技术

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是一类广泛存在于真核生物基因组中的分子遗传标记，属于第二代遗传标记。在人类基因组中，大约每15-20kb就有一个STR位点，它们占人类基因组总量的10％。这些STR通常由2-6个碱基组成串联重复单元，由于重复单元及重复次数的不同，它们在不同种族、地域的人群中显示出较大的差异性，表现为遗传多态性。与其它遗传标记相较，STR遗传标记不仅信息量大，在不同个体间差异大、多态性高、片段较小，易于扩增，尤其适用于一些微量或降解检材。因此，基于STR的扩增检测技术被广泛应用于法医个体识别、亲权鉴定、群体遗传学分析及人类DNA数据库的构建等。

基于STR分型技术的上述优点，自1980年代中期以来,STR分型技术已经成为司法鉴定中最常用、发展最成熟的技术，为各类民事及刑事案件提供了有利的证据支持。STR数据也成为各国法庭科学数据库的主要构成，为犯罪分子的最终伏法提供了数据支撑。目前司法鉴定所采用的试剂盒主要以美国FBI选择的13个CODIS位点(包括CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX和vWA)为基础的STR位点检测试剂盒，其位点数较少且不同试剂盒之间相互兼容、位点同质化非常严重，即便不同试剂盒相互联用，提供的位点信息也有限。然而在实际情况中往往会遇到双亲去世背景下的兄弟姐妹生物关系鉴定的案例，或者在案发现场获得高度降解等疑难检材的刑事案件，另外基因组上还存在大量的SNP或其它突变干扰STR分型结果，因此位点信息太少很可能会导致误判的发生。2014年，中华人民共和国司法部司法鉴定管理局发布了《生物学全同胞关系鉴定实施规范》，提供了必检的19个位点(包括vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、TH01、TPOX、Penta E、Penta D、D2S1338、D19S433、D12S391和D6S1043)和可供增加的常染色体位点(如D1S1656、D2S441、D3S1744、D3S3045、D4S2366、D5S2500、D6S477、D7S1517、D7S3048、D8S1132、D10S1248、D10S1435、D10S2325、D11S2368、D13S325、D14S608、D15S659、D17S1290、D18S535、D19S253、D21S2055、D22-GATA198B05)。因此，为了在个体识别或者兄弟姐妹生物关系鉴定中提高个体识别能力，开发出一种用于补充与市面上主流试剂盒所含位点外的常染色体STR试剂盒具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于补充与市面上主流试剂盒所含位点外的STR试剂盒，从而提高个体识别能力。

本发明首先提供了引物对组合，可包括用于扩增性别鉴定位点AMEL的引物对1、用于扩增STR基因位点D1S1656的引物对2、用于扩增STR基因位点D20S482的引物对3、用于扩增STR基因位点D3S1744的引物对4、用于扩增STR基因位点D16S539的引物对5、用于扩增STR基因位点D17S1290的引物对6、用于扩增STR基因位点D10S1435的引物对7、用于扩增STR基因位点D12ATA63的引物对8、用于扩增STR基因位点D11S2368的引物对9、用于扩增STR基因位点D15S659的引物对10、用于扩增STR基因位点D9S925的引物对11、用于扩增STR基因位点D18S535的引物对12、用于扩增STR基因位点D6S477的引物对13、用于扩增STR基因位点D22-GATA198B05的引物对14、用于扩增STR基因位点D2S1776的引物对15、用于扩增STR基因位点D9S1122的引物对16、用于扩增STR基因位点D7S3048的引物对17、用于扩增STR基因位点D4S2366的引物对18、用于扩增STR基因位点D3S3045的引物对19、用于扩增STR基因位点D10S1248的引物对20、用于扩增STR基因位点D8S1132的引物对21和用于扩增STR基因位点D21S2055的引物对22；每个引物对可由位于相应基因位点两侧的一对引物组成。

上述引物对组合中，每对引物对中的一条引物可用荧光标记。

所述引物对1可由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成。

所述引物对2可由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成。

所述引物对3可由序列表中序列5所示的引物和序列表中序列6所示的引物组成。

所述引物对4可由序列表中序列7所示的引物和序列表中序列8所示的引物组成。

所述引物对5可由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成。

所述引物对6可由序列表中序列11所示的引物和序列表中序列12所示的引物组成。

所述引物对7可由序列表中序列13所示的引物和序列表中序列14所示的引物组成。

所述引物对8可由序列表中序列15所示的引物和序列表中序列16所示的引物组成。

所述引物对9可由序列表中序列17所示的引物和序列表中序列18所示的引物组成。

所述引物对10可由序列表中序列19所示的引物和序列表中序列20所示的引物组成。

所述引物对11可由序列表中序列21所示的引物和序列表中序列22所示的引物组成。

所述引物对12可由序列表中序列23所示的引物和序列表中序列24所示的引物组成。

所述引物对13可由序列表中序列25所示的引物和序列表中序列26所示的引物组成。

所述引物对14可由序列表中序列27所示的引物和序列表中序列28所示的引物组成。

所述引物对15可由序列表中序列29所示的引物和序列表中序列30所示的引物组成。

所述引物对16可由序列表中序列31所示的引物和序列表中序列32所示的引物组成。

所述引物对17可由序列表中序列33所示的引物和序列表中序列34所示的引物组成。

所述引物对18可由序列表中序列35所示的引物和序列表中序列36所示的引物组成。

所述引物对19可由序列表中序列37所示的引物和序列表中序列38所示的引物组成。

所述引物对20可由序列表中序列39所示的引物和序列表中序列40所示的引物组成。

所述引物对21可由序列表中序列41所示的引物和序列表中序列42所示的引物组成。

所述引物对22可由序列表中序列43所示的引物和序列表中序列44所示的引物组成。

上述任一所述引物对组合中，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5和所述引物对6中每对引物对中的一条引物的5’末端可用6’-FAM标记。所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11和所述引物对12中每对引物对中的一条引物的5’末端可用HEX标记。所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16和所述引物对17中每对引物对中的一条引物的5’末端可用TAMRA标记。所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21和所述引物对22中每对引物对中的一条引物的5’末端可用ROX标记。

上述任一所述引物对组合具体可由所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21和所述引物对22组成。

本发明还保护一种检测22个基因位点的复合扩增体系，可包括上述任一所述引物对组合。所述22个基因位点可为Amel、D1S1656、D20S482、D3S1744、D16S539、D17S1290、D10S1435、D12ATA63、D11S2368、D15S659、D9S925、D18S535、D6S477、D22-GATA198B05、D2S1776、D9S1122、D7S3048、D4S2366、D3S3045、D10S1248、D8S1132和D21S2055。

所述复合扩增体系中，所述引物对1的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.07μM。所述引物对2的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.10μM。所述引物对3的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.11μM。所述引物对4的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.17μM。所述引物对5的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.18μM。所述引物对6的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.39μM。所述引物对7的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.18μM。所述引物对8的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.20μM。所述引物对9的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.14μM。所述引物对10的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.14μM。所述引物对11的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.45μM。所述引物对12的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.12μM。所述引物对13的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.13μM。所述引物对14的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.23μM。所述引物对15的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.19μM。所述引物对16的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.14μM。所述引物对17的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.24μM。所述引物对18的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.14μM。所述引物对19的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.15μM。所述引物对20的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.27μM。所述引物对21的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.10μM。所述引物对22的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.24μM。

上述任一所述复合扩增体系还可包括进行PCR扩增反应所需的试剂；所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”具体可为DMSO和/或KCl和/或MgCl₂和/或BSA和/或dNTP和/或Tris-HCl缓冲液和/或Taq DNA聚合酶。所述Tris-HCl缓冲液为10mM的Tris-HCl(pH8.3)缓冲液。所述Taq DNA聚合酶具体可为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的均可。

上述任一所述复合扩增体系具体可由上述任一所述引物对组合和进行PCR扩增反应所需的试剂组成。

本发明还保护含有上述任一所述引物对组合、或、上述任一所述复合扩增体系的试剂盒；所述试剂盒的用途可为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)亲权鉴定；a3)个体识别。

上述任一所述复合扩增体系、或、所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围；该制备方法可包括将上述任一所述引物对组合中的各条引物单独包装的步骤。

X1)或X2)也属于本发明的保护范围。

X1)上述任一所述引物对组合，或，上述任一所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)亲权鉴定；a3)个体识别。

X2)上述任一所述引物对组合，或，上述任一所述复合扩增体系的应用，可为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)亲权鉴定；a3)个体识别。

本发明还保护一种五色荧光STR分型方法，可包括如下步骤：

(1)以待测个体的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物对组合或上述任一所述复合扩增体系进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(2)完成步骤(1)后，取PCR扩增产物，变性，然后毛细管电泳检测，得到待测个体的基因组DNA的22个基因位点的基因型；

(3)完成步骤(2)后，根据22个基因位点的基因型获得所述待测个体的STR分型结果；

所述22个基因位点可为Amel、D1S1656、D20S482、D3S1744、D16S539、D17S1290、D10S1435、D12ATA63、D11S2368、D15S659、D9S925、D18S535、D6S477、D22-GATA198B05、D2S1776、D9S1122、D7S3048、D4S2366、D3S3045、D10S1248、D8S1132和D21S2055。

上述方法中，所述待测个体的基因组DNA可为从人类组织中提取的基因组DNA。所述组织可为血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液或含有胎儿细胞的羊水。

上述方法中，所述提取基因组DNA的方法可为常规法，如磁珠法、树脂纯化法、酚氯仿法等。DNA模板量优选在0.05－5ng之间(DNA模板量太低可能导致某些位点检测不出，DNA模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生)。

上述方法中，所述PCR扩增可在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI Veriti、Bio-Rad myCycler等)进行。所述PCR扩增的温度循环条件可为：95℃预变性5min；95℃变性10s，58℃退火1min，70℃延伸20s，28个循环；60℃继续延伸30min；4℃-12℃保存。

上述方法中，电泳后的数据可以在GeneMapperIDx、GeneMarker等数据分析软件上分析得到STR基因分型图谱和数据。

本发明中，内标可选用橙色荧光标记。荧光标记物可为Atto 633。

本发明采用荧光标记引物，在所述复合扩增体系按上述程序进行扩增后得到带有荧光标记的各位点扩增产物混合物，该荧光标记物在激光激发下可发出被测序仪或遗传分析仪(ABI3130、3100、3500等)识别的光信号，因此所述扩增产物可通过测序仪或遗传分析仪进行检测分析。

在利用测序仪或遗传分析仪进行检测时复合扩增产物需要与甲酰胺、分子量内标按一定的比例进行混合变性后再进行毛细管电泳分离，其中分子量内标为荧光标记的多条已知片段大小的DNA片段混合物，以其为参照可计算复合扩增产物的片段大小并与等位基因阶梯进行比对，从而分析判断被检样本各位点的基因型。

上述任一所述亲权鉴定具体可为生物学全同胞关系鉴定。

所述Taq DNA聚合酶具体可为为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的均可。

目前，市面上现有主流CODIS位点试剂盒用于同胞关系鉴定中因为位点数的不足容易出现误判。本发明提供的试剂盒采用五色荧光标记复合扩增技术，可一次性扩增分析22个基因位点，包含更多的遗传信息量。该试剂盒与市面上主流CODIS位点联用，可以提高全同胞关系中的鉴定能力，提高试剂盒的兼容性和鉴定的准确性。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为复合扩增体系对22个基因位点的分型图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

博日G-1000热循环仪为杭州博日科技有限公司的产品。热启动Taq酶为ABI公司的产品。

10×Buffer：含100mM DMSO、500mM KCl、1mg/mL BSA的100mM的Tris-HCl(pH8.3)缓冲液。

实施例1、基于22个基因位点的复合扩增体系的制备

一、22个基因位点的筛选

本发明的发明人为了满足《生物学全同胞关系鉴定实施规范》中对全同胞的鉴定要求，结合市面上现有的常染色体STR复合扩增试剂盒，最终筛选选取了18个非CODIS位点、3个用于同一性认证的CODIS位点以及1个性别鉴定位点AMEL。18个非CODIS位点为D20S482、D3S1744、D17S1290、D10S1435、D12ATA63、D11S2368、D15S659、D9S925、D18S535、D6S477、D22-GATA198B05、D2S1776、D9S1122、D7S3048、D4S2366、D3S3045、D8S1132和D21S2055。3个CODIS位点为D1S1656、D16S539和D10S1248。

二、引物对组合的制备

1、引物的初筛

(1)根据步骤一中的22个基因位点的侧翼序列，采用primer primier5软件和Oligo7软件设计相应的上下游引物。引物设计原则为：每条引物退火温度在60℃左右；不能产生引物二聚体或者错配引起的其它非特异性产物，扩增产物长度在90-500bp之间。每个基因位点设计2-8对引物。

(2)完成步骤(1)后，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成所有引物。

(3)采用chelex-100方法提取健康人的血液的基因组DNA。

(4)完成步骤(2)和(3)后，分别配制表1所示的反应体系。

表1.反应体系

组分	体积(μL)
		10×Buffer	2
热启动Taq酶	0.1(约0.5U)
		MgCl<sub>2</sub>(25mM)	1.6
dNTP mix(2.5mM)	1.6
		上游引物(10μM)	1
下游引物(10μM)	1
		健康人的血液的基因组DNA	1(约10ng)
无核酸酶水	11.7μL

(5)将步骤(4)配制的反应体系置于博日G-1000热循环仪，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。G-1000热循环仪的温度循环条件见表2。

表2.温度循环条件

注：“-”表示不存在。

(6)将PCR扩增产物进行3％琼脂糖凝胶电泳检测。

能获得清晰单一扩增条带的引物即为初筛合格的引物。

2、引物的复筛

(1)将初筛合格的引物根据扩增片段大小分为四组：

第一组：AMEL、D1S1656、D20S482、D3S1744、D16S539和D17S1290；

第二组：D10S1435、D12ATA63、D11S2368、D15S659、D9S925和D18S535；

第三组：D6S477、D22-GATA198B05、D2S1776、D9S1122和D7S3048；

第四组：D4S2366、D3S3045、D10S1248、D8S1132和D21S2055。

采用四种不同荧光(6’-FAM、HEX、TAMRA和ROX)分别对四组引物进行标记，均标记在上游引物的5’端，同组引物采用同一荧光进行标记。其中6’-FAM(6’-羧基荧光素)为蓝色荧光素，HEX(六氯-6-甲基荧光素)为绿色荧光素，TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)为黄色荧光素，ROX(羧基-X-罗丹明)为红色荧光素。内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为Atto633。

(2)采用chelex-100方法提取健康人的血液的基因组DNA。

(3)完成步骤(1)和(2)后，分别配制表3所示的反应体系。

表3.反应体系

组分	体积(μL)
		10×Buffer	1
热启动Taq酶	0.05(约0.5U)
		MgCl<sub>2</sub>(25mM)	0.8
dNTP mix(2.5mM)	0.8
		上游引物(10μM)	0.5
下游引物(10μM)	0.5
		健康人的血液的基因组DNA	1(约1ng)
无核酸酶水	5.35μL

(4)将步骤(3)配制的反应体系置于博日G-1000热循环仪，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。博日G-1000热循环仪的温度循环条件见表4。

表4.引物复筛扩增热循环条件

注：“-”表示不存在。

(5)完成步骤(4)后，将9.5μL上样混合物和0.5μL PCR扩增产物混合均匀，得到反应液。上样混合物由0.25μL分子量内标(LIZ-500)和9.25μL去离子甲酰胺混合而成。

(6)完成步骤(5)后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移冰上冷却4min，使DNA完全变性并且保持变性状态(步骤(6)可选，去离子甲酰胺本身可以使DNA变性)。

(7)完成步骤(6)后，取所述反应液，用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测(电压15kV，炉温60℃)。毛细管电泳电泳条件为：进样电压3kV，进样时间为10s。

(8)完成步骤(7)后，用

IDx软件分析实验数据。扩增效率高、特异性高且扩增产物经毛细管电泳后形成的峰形尖细对称的引物即为复筛合格的引物。

三、引物混合物的制备

1、引物混合物的制备

向复筛合格的引物的干粉中加入TE缓冲液，配成100μM母液；

将扩增22个基因位点的上下游引物(共44条)按比例混合(同一基因位点的引物等量)，得到5×PrimerSets引物混合物。

2、采用chelex-100方法提取健康人的血液的基因组DNA。

3、配制表5所示的反应体系。2.5×PCR Master Mix缓冲液为含25mM DMSO、125mMKCl、5.0mM MgCl₂、0.25mg/mL BSA和0.5mM dNTP(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为0.5mM)的25mM的Tris-HCl(pH8.3)缓冲液。

表5.复合扩增反应体系

4、将步骤3配制的反应体系置于博日G-1000热循环仪，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。博日G-1000热循环仪的温度循环条件见表6。

表6.复合扩增热循环条件

注：“-”表示不存在。

5、完成步骤4后，将9μL上样混合物和1μL PCR扩增产物或等位基因分型标准物混合均匀，得到反应液。上样混合物由0.3μL分子量内标(Salmonplus500)和9μL去离子甲酰胺混合而成。

6、完成步骤5后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移冰上冷却4min，使DNA完全变性并且保持变性状态(步骤6可选，去离子甲酰胺本身可以使DNA变性)。

7、完成步骤6后，取所述反应液，用3500遗传分析仪进行毛细管电泳检测(电压15kV，炉温60℃)。毛细管电泳电泳条件为：进样电压3kV，进样时间为10s。

8、完成步骤7后，用

Dx软件分析实验数据。

观察各个基因位点的扩增情况，对于效率低，出现偏峰或分叉峰，有杂峰，甚至其它引物相互干扰扩增出非特异峰的引物需重新设计引物。

每组中各个基因位点扩增产物根据长度差异分开，相邻两个基因位点不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验，确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，根据产物峰高情况调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。调整后的5×PrimerSets引物混合物可以用于上述22个基因位点复合扩增。

经过筛选，引物对组合由表7所示的44条引物组成，用于检测步骤一筛选的22个基因位点。扩增各个基因位点对应的上下游引物序列详见表7中第2列和第3列。

表7

四、基于22个基因位点的复合扩增体系的制备

基于22个基因位点的复合扩增体系由DMSO、KCl、Tris-HCl缓冲液、MgCl₂、BSA、dNTP和引物混合物组成；引物混合物由表7中的44条引物混合而成。

基于22个基因位点的复合扩增体系中，DMSO的浓度为10mM，KCl的浓度为50mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为pH8.3、10mM Tris-HCl缓冲液，MgCl₂的浓度为2.0mM，BSA的浓度为0.1mg/mL，dNTP的浓度为0.2mM(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为0.2mM)，各个基因位点的引物浓度见表7中第4列。

基于22个基因位点的复合扩增体系对22个基因位点的分型图谱见图1。

实施例2、实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系对DNA标准品9947A的分型检测

DNA标准品9947A(浓度为10ng/μL)为新海生物科技股份有限公司的产品。

1、DNA标准品稀释液的获得

取1μL DNA标准品9947A，加入9μL TE缓冲液，得到DNA标准品稀释液(浓度为1ng/μL)。

2、取15μL实施例1中步骤四制备的基于22个基因位点的复合扩增体系，加入0.4μL热启动Taq酶(含2U)、1μL DNA标准品稀释液和8.6μL无核酸酶水，得到反应体系。

3、将步骤2得到的反应体系置于博日G-1000热循环仪，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、完成步骤3后，将9μL上样混合物和1μL PCR扩增产物或等位基因分型标准物混合均匀，得到反应液。上样混合物由0.3μL分子量内标(Salmonplus500)和9μL去离子甲酰胺混合而成。

5、完成步骤4后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移冰上冷却4min，使DNA完全变性并且保持变性状态(步骤5可选，去离子甲酰胺本身可以使DNA变性)。

6、完成步骤5后，取所述反应液，用3500遗传分析仪进行毛细管电泳检测(电压15kV，炉温60℃)。毛细管电泳电泳条件为：进样电压3kV，进样时间为10s。

7、完成步骤6后，用

IDx软件分析实验数据。

实验结果见表8。结果表明，采用实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系对DNA标准品9947A进行分型，分型结果与公开的标准品的分型结果完全一致。采用实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系进行分型检测，检测结果准确可靠。

表8. 9947A分型结果

实施例3、实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系检测具体案例

根据生物学全同胞关系鉴定实施规范(SF/Z JD0105002—2014)的要求，利用实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系分别通过案例1(确定同胞关系的三联体)和案例2(确定非同胞关系的二联体)对生物学全同胞关系鉴定IBS阈值和检测系统效能测试，案例中涉及的样本来源于广东华大法医物证司法鉴定所。另外为保证结果的可靠性，还联合了人类DNA分型盒(白金)共同进行检测。人类DNA分型盒(白金)为深圳华大法医科技有限公司的产品，其包含了市面上主流试剂盒的所有位点。

一、分析标准的确定

根据生物学全同胞关系鉴定实施规范(SF/Z JD0105002—2014)的要求，单个常染色体STR基因座的状态一致性评分标准见表9，不同常染色体STR检测系统对应的生物学全同胞关系鉴定IBS阈值和检测系统效能见表10。

表9.单个常染色体STR基因座的状态一致性评分计算表

表10.不同常染色体STR检测系统对应的生物学全同胞关系鉴定IBS阈值和检测系统效能

二、案例1

分别利用人类DNA分型盒(白金)和实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系对案例1中的样本(1位女性，记为D1；2位男性，记为S1、S2)进行扩增分析(人类DNA分型盒(白金)的扩增分析步骤具体参考说明书，实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系的扩增分析参考实施例2)，分型结果见表11与表12，然后按照表9对各个STR基因座的状态一致性进行评分，具体结果见表13。各表中，Allele1和Allele2为单个位点的两个等位基因。

结合状态一致性评分表和表10的生物学全同胞关系鉴定IBS阈值和检测系统效能表，倾向于认为三位为全同胞，该结果与实际结果完全一致。

表11.人类DNA分型盒(白金)的分型结果

表12.实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系的分型结果

表13.状态一致性评分表

注：“-”表示不存在。

三、案例2

分别利用人类DNA分型盒(白金)和实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系对案例2中的样本(1位女性，记为D2；1位男性，记为S1)进行扩增分析(人类DNA分型盒(白金)的扩增分析步骤具体参考说明书，实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系的扩增分析参考实施例2)，分型结果见表14与表15，然后按照表9对各个STR基因座的状态一致性进行评分，具体结果见表16。各表中，Allele1和Allele2为单个位点的两个等位基因。

结合状态一致性评分表和表10的生物学全同胞关系鉴定IBS阈值和检测系统效能表，倾向于认为两位为无关个体，该结果与实际结果完全一致。

表14.人类DNA分型盒(白金)的分型结果

注：“-”表示不存在。

表15.实施例1制备的基于22个基因位点的复合扩增体系的分型结果

注：“-”表示不存在。

表16状态一致性评分表

注：“-”表示不存在。

<110> 深圳华大法医科技有限公司

<120> 一种同步检测22个基因位点的五色荧光STR分型方法及其专用试剂盒

<160> 44

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tccctgggct ctgtaaagaa ta 22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gatcagagct taaactggga ag 22

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

taaagaaata gaatcactag ggaacca 27

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ttgctcaagg gtcaactgtg t 21

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gtcctaaaac tctaaggaag cgtgt 25

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gaacttgcag atgatgtatc aga 23

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ataccagaat aaaggtatgc ag 22

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gaccacttcc agtcctcact tat 23

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

tcagatgctc gttgtgcaca 20

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

ggcctacaga gtgattccat ttt 23

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

ctgagttcct ctgggtaata aagg 24

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

atcacttgag cccacgaggt t 21

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

ttgtgtggtg ctgtgtttgt tataa 25

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

gaaaataaag agatagacag ata 23

<210>15

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

gaggaaaaga cataggatag caattt 26

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

gatcacttca gcccagaagg tt 22

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>17

gtgcattgta tacgtcctat aaca 24

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>18

aggtgaggtg caagaatgtc tgt 23

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>19

tttcccttct attgtggtag tctg 24

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>20

agattccttt agaaactttg agtat 25

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>21

agtagaatta tatattagtc tggg 24

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>22

ccagctactt ggttaaacat c 21

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>23

tgacaatgtt gcctttctag agg 23

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>24

atcaggttgt ctttccatgg tagc 24

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>25

gatgaggtga aatatttgca aa 22

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>26

atctcaaaca acctcaacaa ca 22

<210>27

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>27

tcacgtggag ccaattcacc taat 24

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>28

acaggtggtg tgccttccaa ttt 23

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>29

tatgcattta cctgtgagta tgt 23

<210>30

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>30

ctgcccacct cttggttcag cta 23

<210>31

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>31

aatagtaatg ccatttgtga taggt 25

<210>32

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>32

acggcattta ttatttcttg tctg 24

<210>33

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>33

ttcattccat cttcctaagc acaatcc 27

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>34

aagctttttc caaaactgcc t 21

<210>35

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>35

actgatagat aaatggaata gataga 26

<210>36

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>36

gataacaaat atggctctat ctatc 25

<210>37

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>37

tacttcttaa ctacagaagc agagagaaa 29

<210>38

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>38

caccattaga aatatgatat cct 23

<210>39

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>39

gaaccaaagc atgaacaatc agtaaa 26

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>40

gttcccttgt cttgttatta aagga 25

<210>41

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>41

tcctcatttt atttcggtcc ctgtaa 26

<210>42

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>42

accttaaact tagaatttct acttg 25

<210>43

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>43

gaggtaactg ccattaccat atgag 25

<210>44

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>44

ttggactttg cctggaactt acact 25

Claims

1.引物对组合，包括用于扩增性别鉴定位点AMEL的引物对1、用于扩增STR基因位点D1S1656的引物对2、用于扩增STR基因位点D20S482的引物对3、用于扩增STR基因位点D3S1744的引物对4、用于扩增STR基因位点D16S539的引物对5、用于扩增STR基因位点D17S1290的引物对6、用于扩增STR基因位点D10S1435的引物对7、用于扩增STR基因位点D12ATA63的引物对8、用于扩增STR基因位点D11S2368的引物对9、用于扩增STR基因位点D15S659的引物对10、用于扩增STR基因位点D9S925的引物对11、用于扩增STR基因位点D18S535的引物对12、用于扩增STR基因位点D6S477的引物对13、用于扩增STR基因位点D22-GATA198B05的引物对14、用于扩增STR基因位点D2S1776的引物对15、用于扩增STR基因位点D9S1122的引物对16、用于扩增STR基因位点D7S3048的引物对17、用于扩增STR基因位点D4S2366的引物对18、用于扩增STR基因位点D3S3045的引物对19、用于扩增STR基因位点D10S1248的引物对20、用于扩增STR基因位点D8S1132的引物对21和用于扩增STR基因位点D21S2055的引物对22；

每个引物对由位于相应基因位点两侧的一对引物组成。

2.如权利要求1所述的引物对组合，其特征在于：每对引物对中的一条引物用荧光标记。

3.如权利要求1或2所述的引物对组合，其特征在于：

所述引物对1由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；

所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成；

所述引物对3由序列表中序列5所示的引物和序列表中序列6所示的引物组成；

所述引物对4由序列表中序列7所示的引物和序列表中序列8所示的引物组成；

所述引物对5由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成；

所述引物对6由序列表中序列11所示的引物和序列表中序列12所示的引物组成；

所述引物对7由序列表中序列13所示的引物和序列表中序列14所示的引物组成；

所述引物对8由序列表中序列15所示的引物和序列表中序列16所示的引物组成；

所述引物对9由序列表中序列17所示的引物和序列表中序列18所示的引物组成；

所述引物对10由序列表中序列19所示的引物和序列表中序列20所示的引物组成；

所述引物对11由序列表中序列21所示的引物和序列表中序列22所示的引物组成；

所述引物对12由序列表中序列23所示的引物和序列表中序列24所示的引物组成；

所述引物对13由序列表中序列25所示的引物和序列表中序列26所示的引物组成；

所述引物对14由序列表中序列27所示的引物和序列表中序列28所示的引物组成；

所述引物对15由序列表中序列29所示的引物和序列表中序列30所示的引物组成；

所述引物对16由序列表中序列31所示的引物和序列表中序列32所示的引物组成；

所述引物对17由序列表中序列33所示的引物和序列表中序列34所示的引物组成；

所述引物对18由序列表中序列35所示的引物和序列表中序列36所示的引物组成；

所述引物对19由序列表中序列37所示的引物和序列表中序列38所示的引物组成；

所述引物对20由序列表中序列39所示的引物和序列表中序列40所示的引物组成；

所述引物对21由序列表中序列41所示的引物和序列表中序列42所示的引物组成；

所述引物对22由序列表中序列43所示的引物和序列表中序列44所示的引物组成。

4.如权利要求1至3任一所述的引物对组合，其特征在于：

所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5和所述引物对6中每对引物对中的一条引物的5’末端用6’-FAM标记；

所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11和所述引物对12中每对引物对中的一条引物的5’末端用HEX标记；

所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16和所述引物对17中每对引物对中的一条引物的5’末端用TAMRA标记；

所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21和所述引物对22中每对引物对中的一条引物的5’末端用ROX标记。

5.一种检测22个基因位点的复合扩增体系，包括权利要求1至4任一所述引物对组合；所述23个基因位点为Amel、D1S1656、D20S482、D3S1744、D16S539、D17S1290、D10S1435、D12ATA63、D11S2368、D15S659、D9S925、D18S535、D6S477、D22-GATA198B05、D2S1776、D9S1122、D7S3048、D4S2366、D3S3045、D10S1248、D8S1132和D21S2055。

6.如权利要求5所述的复合扩增体系，其特征在于：

所述引物对1的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.07μM；

所述引物对2的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.10μM；

所述引物对3的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.11μM；

所述引物对4的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.17μM；

所述引物对5的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.18μM；

所述引物对6的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.39μM；

所述引物对7的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.18μM；

所述引物对8的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.20μM；

所述引物对9的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.14μM；

所述引物对10的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.14μM；

所述引物对11的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.45μM；

所述引物对12的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.12μM；

所述引物对13的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.13μM；

所述引物对14的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.23μM；

所述引物对15的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.19μM；

所述引物对16的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.14μM；

所述引物对17的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.24μM；

所述引物对18的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.14μM；

所述引物对19的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.15μM；

所述引物对20的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.27μM；

所述引物对21的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.10μM；

所述引物对22的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.24μM。

7.含有权利要求1至4任一所述引物对组合、或、权利要求5或6所述复合扩增体系的试剂盒；所述试剂盒的用途为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)亲权鉴定；a3)个体识别。

8.X1)或X2)：

X1)权利要求1至4任一所述引物对组合，或，权利要求5或6所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)亲权鉴定；a3)个体识别；

X2)权利要求1至4任一所述引物对组合，或，权利要求5或6所述复合扩增体系的应用，为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)亲权鉴定；a3)个体识别。

9.一种五色荧光STR分型方法，包括如下步骤：

(1)以待测个体的基因组DNA为模板，采用权利要求1至4任一所述引物对组合、或、权利要求5或6任一所述复合扩增体系进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

所述22个基因位点为Amel、D1S1656、D20S482、D3S1744、D16S539、D17S1290、D10S1435、D12ATA63、D11S2368、D15S659、D9S925、D18S535、D6S477、D22-GATA198B05、D2S1776、D9S1122、D7S3048、D4S2366、D3S3045、D10S1248、D8S1132和D21S2055。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述待测个体的基因组DNA为从人类组织中提取的基因组DNA。