CN110066792A - 一种同步检测23个基因位点的五色荧光str分型方法及其专用试剂盒 - Google Patents

一种同步检测23个基因位点的五色荧光str分型方法及其专用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同步检测23个基因位点的五色荧光STR分型方法及其专用试剂盒，该方法包括如下步骤：以待测个体的基因组DNA为模板，采用试剂盒进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；取PCR扩增产物，变性，然后毛细管电泳检测，得到待测个体的基因组DNA的23个基因位点的基因型，进而获得待测个体的STR分型结果。试剂盒包括引物对组合，组成引物对组合的46条引物的核苷酸序列依次如序列表中序列1至46所示，每个引物对中的一条引物的用荧光标记。试剂盒具有极高的个体识别力，稳定性，兼容白种人﹑黄种人、黑种人及棕种人的基础标准等位基因位点，且适合中华民族群体的个体识别和亲缘鉴定。本发明具有重大的应用价值。

Description

一种同步检测23个基因位点的五色荧光STR分型方法及其专 用试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同步检测23个基因位点的五色荧光STR分型方法及其专用试剂盒。
背景技术
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是一类广泛存在于真核生物基因组中的分子遗传标记，属于第二代遗传标记。在人类基因组中，大约每6-10kb就有一个STR位点，它们占人类基因组总量的10％。这些STR通常由2-6个碱基组成串联重复单元，由于重复单元及重复次数的不同，它们在不同种族、地域的人群中显示出较大的差异性，表现为遗传多态性。与其它遗传标记相较，STR遗传标记不仅信息量大，在不同个体间差异大、多态性高、片段较小，易于扩增，尤其适用于一些微量或降解检材。因此，基于STR的扩增检测技术被广泛应用于法医个体识别、亲权鉴定、群体遗传学分析及人类DNA数据库的构建等。
最早应用于法医学领域的是人类常染色体STR，至今国内外已有比较成型的扩增、检测试剂盒及相关技术路线，扩增位点数目不断增加。同时，常染色体STR数据库的建成，为案件侦破及罪犯特征刻画提供了条件。然而，对于案发现场提取的混合斑，常染色体STR往往显示出不足。Y-STR是对常染色体STR的重要补充，它们呈现稳定的父系遗传，在混合斑中男性成分的个体识别、父系男性亲属的亲权鉴定等方面具有特殊的应用价值。此外，利用Y-STR在一个家系中的保守特性，案件侦查中，可以方便地利用它快速锁定嫌疑人所在家系，所谓“以Y找群”，为侦查提供重要线索。如今，Y-STR在家系排查、男女混合样品中男性成分的检测等方面越来越展现出无可替代的独特价值，并在公安办案实践中屡立奇功。
正因STR所具备的应用前景，法医界以及一些公司均对其进行了大规模的开发性研究，尤其上世纪90年代美国FBI选择了13个常染色体STR基因位点(包括CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX和vWA)用于建立DNA数据索引系统(Combined DNA Index System，CODIS)，且被多个国家的DNA数据库或技术型公司在其基础上借鉴和发展。目前市场上的主流试剂盒有国外ABI的IdentifilerTM和SinofilerTM，Promega的PowerPlex 16和PowerPlex 21；相较国外，国内起步晚，发展相对滞后，国内在该技术领域仍然以5色荧光标记为主，难以容纳更多的位点数，且大多数试剂盒都是在早期13个CODIS位点的基础上增加适合国内人群的少数几个位点，如基点认知公司的Goldeneye 20A(20个位点)、阅微基因的MicroReaderTM 21D(21个位点)、中德美联公司的AGCU Expressmarker 22(22个位点)和宁波海尔施基因科技有限公司的STRtyper-21G(21个位点)等。这些试剂盒大多采用五色荧光标记，而容纳的位点数少，此外，人群适用范围不广泛，检测灵敏度不高。随着能容纳的位点数更多，且欧洲等国家也纷纷提出自己的标准核心位点，各技术型公司也不满足于试剂盒的兼容性，如在该领域处于国际领先地位的美国AB公司推出的试剂盒GlobalFiler(24个位点)不仅包含了近年来拓展后的新CODIS位点，还兼容欧洲标准核心位点使该试剂盒更适合欧美人，HuaxiaTM Platinum(25个位点)兼容了新CODIS位点及公安建库位点，适合美国和中华民族群体。
但是随着DNA作为鉴定手段的应用越来越广泛，用户对试剂盒的基因位点数目、信息量、扩增时间、检材的适用范围等等有了越来越高的要求，并随着我国DNA数据库建设规模的不断扩大，数据比对的作用也日益重要，由于数据比对是建立在相同的STR基因位点上的，因此也需要STR试剂盒在基因位点上具有兼容性，否则会导致DNA数据库里部分的数据资源浪费。因此，研发一种能容纳更多位点数的五色荧光试剂盒，同时增加该试剂盒中在众多种族间兼容性好的位点是该领域的迫切需求，不仅增加试剂盒的信息量，提高试剂盒的个体识别能力和累计非父排除率，提高其兼容性使其能覆盖全球大多数国家的DNA数据库，同时节约试剂和人力成本、提高工作效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供全球兼容性高的检测基因位点的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了引物对组合，可包括用于扩增插入缺失位点Yindel的引物对1、用于扩增性别鉴定位点AMEL的引物对2、用于扩增STR基因位点D3S1358的引物对3、用于扩增STR基因位点D13S317的引物对4、用于扩增STR基因位点D7S820的引物对5、用于扩增STR基因位点D16S539的引物对6、用于扩增STR基因位点D8S1179的引物对7、用于扩增STR基因位点Penta D的引物对8、用于扩增STR基因位点D19S433的引物对9、用于扩增STR基因位点D5S818的引物对10、用于扩增STR基因位点D21S11的引物对11、用于扩增STR基因位点TPOX的引物对12、用于扩增STR基因位点D1S1656的引物对13、用于扩增STR基因位点D6S1043的引物对14、用于扩增STR基因位点D2S441的引物对15、用于扩增STR基因位点D12S391的引物对16、用于扩增STR基因位点D2S1338的引物对17、用于扩增STR基因位点vWA的引物对18、用于扩增STR基因位点Penta E的引物对19、用于扩增STR基因位点TH01的引物对20、用于扩增STR基因位点D18S51的引物对21、用于扩增STR基因位点CSF1PO的引物对22和用于扩增STR基因位点FGA的引物对23；每个引物对可由位于相应基因位点两侧的一对引物组成。
上述引物对组合中，每对引物对中的一条引物可用荧光标记。
上述引物对组合中，所述引物对1可由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；所述引物对2可由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成；所述引物对3可由序列表中序列5所示的引物和序列表中序列6所示的引物组成；所述引物对4可由序列表中序列7所示的引物和序列表中序列8所示的引物组成；所述引物对5可由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成；所述引物对6可由序列表中序列11所示的引物和序列表中序列12所示的引物组成；所述引物对7可由序列表中序列13所示的引物和序列表中序列14所示的引物组成；所述引物对8可由序列表中序列15所示的引物和序列表中序列16所示的引物组成；所述引物对9可由序列表中序列17所示的引物和序列表中序列18所示的引物组成；所述引物对10可由序列表中序列19所示的引物和序列表中序列20所示的引物组成；所述引物对11可由序列表中序列21所示的引物和序列表中序列22所示的引物组成；所述引物对12可由序列表中序列23所示的引物和序列表中序列24所示的引物组成；所述引物对13可由序列表中序列25所示的引物和序列表中序列26所示的引物组成；所述引物对14可由序列表中序列27所示的引物和序列表中序列28所示的引物组成；所述引物对15可由序列表中序列29所示的引物和序列表中序列30所示的引物组成；所述引物对16可由序列表中序列31所示的引物和序列表中序列32所示的引物组成；所述引物对17可由序列表中序列33所示的引物和序列表中序列34所示的引物组成；所述引物对18可由序列表中序列35所示的引物和序列表中序列36所示的引物组成；所述引物对19可由序列表中序列37所示的引物和序列表中序列38所示的引物组成；所述引物对20可由序列表中序列39所示的引物和序列表中序列40所示的引物组成；所述引物对21可由序列表中序列41所示的引物和序列表中序列42所示的引物组成；所述引物对22可由序列表中序列43所示的引物和序列表中序列44所示的引物组成；所述引物对23可由序列表中序列45所示的引物和序列表中序列46所示的引物组成。
上述任一所述引物对组合中，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7和所述引物对8中每对引物对中的一条引物的5’末端可用6’-FAM标记；所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13和所述引物对14中每对引物对中的一条引物的5’末端可用HEX标记；所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18和所述引物对19中每对引物对中的一条引物的5’末端可用TAMRA标记；所述引物对20、所述引物对21、所述引物对22和所述引物对23中每对引物对中的一条引物的5’末端可用ROX标记。
上述任一所述引物对组合具体可由所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21、所述引物对22和所述引物对23组成。
本发明还保护一种检测23个基因位点的复合扩增体系，可包括上述任一所述引物对组合。所述23个基因位点可为D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、Penta D、D19S433、D5S818、D21S11、TPOX、D1S1656、D6S1043、D2S441、D12S391、D2S1338、vWA、PentaE、TH01、D18S51、CSF1PO、FGA、AMEL和Yindel。
所述复合扩增体系中，所述引物对1的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.5μM。所述引物对2的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.4μM。所述引物对3的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.55μM。所述引物对4的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.55μM。所述引物对5的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM。所述引物对6的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM。所述引物对7的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为1.00μM。所述引物对8的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为3.65μM。所述引物对9的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为1.45μM。所述引物对10的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM。所述引物对11的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.95μM。所述引物对12的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.45μM。所述引物对13的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.90μM。所述引物对14的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.70μM。所述引物对15的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM。所述引物对16的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.40μM。所述引物对17的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.70μM。所述引物对18的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM。所述引物对19的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为1.50μM。所述引物对20的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.25μM。所述引物对21的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.80μM。所述引物对22的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.40μM。所述引物对23的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.75μM。
上述任一所述复合扩增体系还可包括进行PCR扩增反应所需的试剂；所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”具体可为DMSO和/或KCl和/或MgCl2和/或BSA和/或dNTP和/或Tris-HCl缓冲液和/或Taq DNA聚合酶。所述Tris-HCl缓冲液为10mM的Tris-HCl(pH8.3)缓冲液。所述Taq DNA聚合酶具体可为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的均可。
上述任一所述复合扩增体系具体可由上述任一所述引物对组合和进行PCR扩增反应所需的试剂组成。
本发明还保护含有上述任一所述引物对组合、或、上述任一所述复合扩增体系的试剂盒；所述试剂盒的用途可为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)个体识别；a3)亲权鉴定。
上述任一所述复合扩增体系、或、所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围；该制备方法可包括将上述任一所述引物对组合中的各条引物单独包装的步骤。
X1)或X2)也属于本发明的保护范围：
X1)上述任一所述引物对组合，或，上述任一所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)个体识别；a3)亲权鉴定；
X2)上述任一所述引物对组合，或，上述任一所述复合扩增体系的应用，为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)个体识别；a3)亲权鉴定。
本发明还保护一种五色荧光STR分型方法，可包括如下步骤：
(1)以待测个体的基因组DNA为模板，采用上述任一所述引物对组合或上述任一所述复合扩增体系进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(2)完成步骤(1)后，取PCR扩增产物，变性，然后毛细管电泳检测，得到待测个体的基因组DNA的23个基因位点的基因型；
(3)完成步骤(2)后，根据23个基因位点的基因型获得所述待测个体的STR分型结果；
所述23个基因位点可为D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、Penta D、D19S433、D5S818、D21S11、TPOX、D1S1656、D6S1043、D2S441、D12S391、D2S1338、vWA、PentaE、TH01、D18S51、CSF1PO、FGA、AMEL和Yindel。
上述方法中，所述待测个体的基因组DNA可为从人类组织中提取的基因组DNA。所述组织可为血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液或含有胎儿细胞的羊水。
上述方法中，所述提取基因组DNA的方法可为常规法，如磁珠法、树脂纯化法、酚氯仿法等。DNA模板量优选在0.05－5ng之间(DNA模板量太低可能导致某些位点检测不出，DNA模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生)。
上述方法中，所述PCR扩增可在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI Veriti、Bio-Rad myCycler等)进行。所述PCR扩增的温度循环条件可为：91℃预变性1min；95℃变性10s，58℃退火1min，70℃延伸20s，28个循环；60℃继续延伸30min；4℃-12℃保存。
上述方法中，电泳后的数据可以在GeneMapperIDx、GeneMarker等数据分析软件上分析得到STR基因分型图谱和数据。
本发明中，内标可选用橙色荧光标记。荧光标记物可为Atto 633。
本发明采用荧光标记引物，在所述复合扩增体系按上述程序进行扩增后得到带有荧光标记的各位点扩增产物混合物，该荧光标记物在激光激发下可发出被测序仪或遗传分析仪(ABI 3130、3100、3500等)识别的光信号，因此所述扩增产物可通过测序仪或遗传分析仪进行检测分析。
在利用测序仪或遗传分析仪进行检测时复合扩增产物需要与甲酰胺、分子量内标按一定的比例进行混合变性后再进行毛细管电泳分离，其中分子量内标为荧光标记的多条已知片段大小的DNA片段混合物，以其为参照可计算复合扩增产物的片段大小并与等位基因阶梯进行比对，从而分析判断被检样本各位点的基因型。
所述Taq DNA聚合酶具体可为为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的均可。
本发明提供的试剂盒采用五色荧光标记复合扩增技术，可一次性扩增分析23个基因位点，适用多种人类群体。该试剂盒具有极高的个体识别力，稳定性和兼容性，兼容白种人﹑黄种人、黑种人及棕种人的基础标准等位基因位点，尤其增加了中华民族多态性较高的2个新位点：D2S441和D1S1656，及插入缺失位点Yindel，使其更适合中华民族群体的个体识别和亲缘鉴定。本发明具有重大的应用价值。
附图说明
图1为DNA标准品9948的分型检测结果。
图2为三联体家系的分型检测结果。
图3为复合扩增体系的灵敏度分型检测结果。
图4为复合扩增体系混合样本的分型检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
博日G-1000热循环仪为杭州博日科技有限公司的产品。热启动Taq酶为ABI公司的产品。
10×Buffer：含100mM DMSO、500mM KCl、1mg/mL BSA的100mM的Tris-HCl(pH8.3)缓冲液。
实施例1、基于23个基因位点的复合扩增体系的制备
一、23个基因位点的筛选
本发明的发明人为满足对STR基因位点检测的信息量、个体识别力和兼容性等需求，在采用五色荧光标记从而增加容纳的位点数的同时，增加试剂盒位点的兼容性，兼容白种人﹑黄种人、黑种人及棕种人的基础标准等位基因位点。本发明的发明人最终筛选了包括21个常染色体STR基因位点、1个性别鉴定位点AMEL和1个插入缺失位点Yindel在内共23个基因位点。21个常染色体STR基因位点为D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、Penta D、D19S433、D5S818、D21S11、TPOX、D1S1656、D6S1043、D2S441、D12S391、D2S1338、vWA、Penta E、TH01、D18S51、CSF1PO和FGA。
二、引物的筛选
1、引物的初筛
(1)根据步骤一中的23个基因位点的侧翼序列，采用Oligo7软件设计相应的引物。引物设计原则为：每条引物退火温度在60℃左右；不能产生引物二聚体或者错配引起的其它非特异性产物；扩增产物长度在90-500bp之间。每个基因位点设计2-8对引物。
(2)完成步骤(1)后，由上海invitrogen公司合成所有引物。
(3)采用chelex-100方法提取健康人的血液的基因组DNA。
(4)完成步骤(2)和(3)后，分别配制表1所示的反应体系。
表1.反应体系
(5)将步骤(4)配制的反应体系置于博日G-1000热循环仪，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。博日G-1000热循环仪的温度循环条件见表2。
表2.温度循环条件
注：“-”表示不存在。
(6)将PCR扩增产物进行3％琼脂糖凝胶电泳检测。
能获得清晰单一扩增条带的引物即为初筛合格的引物。
2、引物的复筛
(1)将初筛合格的引物根据扩增片段大小分为四组：
第一组：Yindel、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179和Penta D；
第二组：D19S433、D5S818、D21S11、TPOX、D1S1656和D6S1043；
第三组：D2S441、D12S391、D2S1338、vWA和Penta E；
第四组：TH01、D18S51、CSF1PO和FGA；
采用四种不同荧光(FAM、HEX、TAMRA和ROX)分别对四组引物进行标记，同组引物采用同一荧光进行标记。其中FAM(6’-羧基荧光素)为蓝色荧光素，HEX(六氯-6-甲基荧光素)为绿色荧光素，TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)为黄色荧光素，ROX(羧基-X-罗丹明)为红色荧光素。内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为Atto 633。
(2)采用chelex-100方法提取健康人的血液的基因组DNA。
(3)完成步骤(1)和(2)后，分别配制表1所示的反应体系。
(4)将步骤(3)配制的反应体系置于博日G-1000热循环仪，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。博日G-1000热循环仪的温度循环条件见表3。
表3.引物复筛扩增热循环条件
注：“-”表示不存在。
(5)完成步骤(4)后，将9.5μL上样混合物和0.5μL PCR扩增产物混合均匀，得到反应液。上样混合物由0.25μL分子量内标(LIZ-500)和9.25μL去离子甲酰胺混合而成。
(6)完成步骤(5)后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移冰上冷却4min，使DNA完全变性并且保持变性状态(步骤(6)可选，去离子甲酰胺本身可以使DNA变性)。
(7)完成步骤(6)后，取所述反应液，用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测(电压15kV，炉温60℃)。毛细管电泳电泳条件为：进样电压3kV，进样时间为10s。
(8)完成步骤(7)后，用IDx软件分析实验数据。扩增效率高、特异性高且扩增产物经毛细管电泳后形成的峰形尖细对称的引物即为复筛合格的引物。
三、引物混合物的制备
1、引物混合物的制备
向复筛合格的引物的干粉中加入TE缓冲液，配成100μM母液；
将扩增23个基因位点的上下游引物(共46条)按比例混合(同一基因位点的引物等量)，得到5×PrimerSets引物混合物。
2、采用chelex-100方法提取健康人的血液的基因组DNA。
3、配制表4所示的反应体系。2.5×PCRMasterMix缓冲液为含25mM DMSO、125mMKCl、5.0mM MgCl2、0.25mg/mL BSA和0.5mM dNTP(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为0.5mM)的25mM的Tris-HCl(pH8.3)缓冲液。
表4.复合扩增反应体系
组分 体积(μL)
5×PrimerSets引物混合物 5
2.5×PCRMasterMix缓冲液 10
热启动Taq酶 0.4(2U)
健康人的血液的基因组DNA 1(含0.2ng-5ng)
无核酸酶水 补充至25μL
4、将步骤3配制的反应体系置于博日G-1000热循环仪，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。博日G-1000热循环仪的温度循环条件见表3。
5、完成步骤4后，将9.5μL上样混合物和0.5μL PCR扩增产物混合均匀，得到反应液。上样混合物由0.25μL分子量内标(LIZ-500)和9.25μL去离子甲酰胺混合而成。
6、完成步骤5后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移冰上冷却4min，使DNA完全变性并且保持变性状态(步骤6可选，去离子甲酰胺本身可以使DNA变性)。
7、完成步骤6后，取所述反应液，用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测(电压15kV，炉温60℃)。毛细管电泳电泳条件为：进样电压3kV，进样时间为10s。
8、完成步骤7后，用IDx软件分析实验数据。
观察各个基因位点的扩增情况，对于效率低，出现偏峰或分叉峰，有杂峰，甚至其它引物相互干扰扩增出非特异峰的引物需重新设计引物。
每组中各个基因位点扩增产物根据长度差异分开，相邻两个基因位点不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验，确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。将4组23个基因位点复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因位点的引物浓度，使各基因位点峰值整体均衡性达到30％以上，调整后的5×PrimerSets引物混合物可以用于上述23个基因位点复合扩增。
经过筛选，引物对组合由表5所示的46条引物组成，用于检测步骤一筛选的23个基因位点。各个基因位点和扩增各个基因位点对应的上下游引物序列详见表5中第2列和第3列。
表5
四、基于23个基因位点的复合扩增体系的制备
基于23个基因位点的复合扩增体系由DMSO、KCl、Tris-HCl缓冲液、MgCl2、BSA、dNTP和引物混合物组成；引物混合物由表5中的46条引物混合而成。
基于23个基因位点的复合扩增体系中，DMSO的浓度为10mM，KCl的浓度为50mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为pH8.3、10mM Tris-HCl缓冲液，MgCl2的浓度为2.0mM，BSA的浓度为0.1mg/mL，dNTP的浓度为0.2mM(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为0.2mM)，各个基因位点的引物浓度见表5中第4列。
实施例2、实施例1制备的基于23个基因位点的复合扩增体系对DNA标准品9948的分型检测
DNA标准品9948(浓度为10ng/μL)为新海生物科技股份有限公司的产品。
1、DNA标准品稀释液的获得
取1μL DNA标准品9948，加入9μL TE缓冲液，得到DNA标准品9948稀释液(浓度为1ng/μL)。
2、取15μL实施例1中步骤四制备的基于23个基因位点的复合扩增体系，加入0.4μL热启动Taq酶(含2U)、1μL DNA标准品9948稀释液和8.6μL无核酸酶水，得到反应体系。
3、将步骤2得到的反应体系置于博日G-1000热循环仪，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。博日G-1000热循环仪的温度循环条件见表6。
表6.温度循环条件
注：“-”表示不存在。
4、完成步骤3后，将9.5μL上样混合物和0.5μL PCR扩增产物混合均匀，得到反应液。上样混合物由0.25μL分子量内标(LIZ-500)和9.25μL去离子甲酰胺混合而成。
5、完成步骤4后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移冰上冷却4min，使DNA完全变性并且保持变性状态(步骤5可选，去离子甲酰胺本身可以使DNA变性)。
6、完成步骤5后，取所述反应液，用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测(电压15kV，炉温60℃)。毛细管电泳电泳条件为：进样电压3kV，进样时间为10s。
7、完成步骤6后，用IDx软件分析实验数据。
实验结果见图1和表7。结果表明，采用实施例1制备的基于23个基因位点的复合扩增体系对DNA标准品9948进行分型，分型结果与公开的标准品的分型结果完全一致。采用实施例1制备的基于23个基因位点的复合扩增体系进行分型检测，检测结果准确可靠。
表7.9948的分型结果
基因位点名称 9948分型结果
Yindel 2
AMEL X，Y
D3S1358 15，17
D13S317 11，11
D7S820 11，11
D16S539 11，11
D8S1179 12，13
Penta D 8，12
D19S433 13，14
D5S818 11，13
D21S11 29，30
TPOX 8，9
D1S1656 14，17
D6S1043 12，12
D2S441 11，12
D12S391 18，24
D2S1338 23，23
vWA 17，17
Penta E 11，11
TH01 6，9.3
D18S51 15，18
CSF1PO 10，11
FGA 24，26
注：“-”表示无分型结果
实施例3、实施例1制备的基于23个基因位点的复合扩增体系对一个三联体家系的分型检测
三联体家系的血液样本(鉴定结果为认定)由广东华大法医物证鉴定所提供。
1、家系血液样本的基因组DNA的获得
采用chelex-100方法分别提取三联体家系的血液样本的基因组DNA。
2、取15μL实施例1中步骤四制备的基于23个基因位点的复合扩增体系，加入0.4μL热启动Taq酶(含2U)、1μL家系血液样本的基因组DNA和8.6μL无核酸酶水，得到反应体系。
3、同实施例2步骤3。
4、同实施例2步骤4。
5、同实施例2步骤5。
6、同实施例2步骤6。
7、同实施例2步骤7。
对上述三联体家系的分型结果见表8和图2。结果表明，父母与孩子之间无矛盾位点，鉴定结果也为认定。
表8.三联体家系的分型结果
注：“-”表示无分型结果
实施例4、实施例1制备的基于23个基因位点的复合扩增体系的灵敏度检测
DNA标准品9947A(浓度为10ng/μL)为新海生物科技股份有限公司的产品。
1、取1μL DNA标准品9947A，加入TE缓冲液，得到浓度为250pg/μL的溶液1、浓度为125pg/μL的溶液2、浓度为62.5pg/μL的溶液3和浓度为31.3pg/μL的溶液4。
2、取15μL实施例1中步骤四制备的基于23个基因位点的复合扩增体系，加入0.4μL热启动Taq酶(含2U)、1μL溶液(溶液1、溶液2、溶液3或溶液4)和8.6μL无核酸酶水，得到反应体系。
3、同实施例2步骤3。
4、同实施例2步骤4。
5、同实施例2步骤5。
6、同实施例2步骤6。
7、同实施例2步骤7。
溶液3的实验结果见图3。结果表明，实施例1制备的基于23个基因位点的复合扩增体系检测出所有位点的最低模板量为62.5pg。
实施例5、实施例1制备的基于23个基因位点的复合扩增体系的检测混合样本
DNA标准品9948和DNA标准品9947A(浓度为10ng/μL)均为新海生物科技股份有限公司的产品。
1、将DNA标准品9948与DNA标准品9947A按照表9的混合比例进行混合，得到混合样本。
表9.样本混合比例
混合比例
混合样本1 M:F(9948:9947A)＝1:3
混合样本2 M:F(9948:9947A)＝1:4
混合样本3 M:F(9948:9947A)＝1:5
混合样本4 M:F(9948:9947A)＝3:1
混合样本5 M:F(9948:9947A)＝4:1
混合样本6 M:F(9948:9947A)＝5:1
2、取15μL实施例1中步骤四制备的基于23个基因位点的复合扩增体系，加入0.4μL热启动Taq酶(含2U)、1μL混合样本(混合样本1、混合样本2、混合样本3、混合样本4、混合样本5或混合样本6)和8.6μL无核酸酶水，得到反应体系。
3、同实施例2步骤3。
4、同实施例2步骤4。
5、同实施例2步骤5。
6、同实施例2步骤6。
7、同实施例2步骤7。
DNA标准品9948和DNA标准品9947A的分型结果见表10。实验结果见图4。结果表明，当DNA标准品9948与DNA标准品9947A的混合比例为1:3时，所有等位基因都能被检出；当DNA标准品9948与DNA标准品9947A的混合比例低于1:3时，只能检出部分等位基因。
表10.DNA标准品9948和DNA标准品9947A的分型结果
注：“-”表示无分型结果。
<110> 深圳华大法医科技有限公司
<120> 一种同步检测23个基因位点的五色荧光STR分型方法及其专用试剂盒
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tagtacccaa atcaactcaa ctc 23
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gcggctgata cctttgtttc tgtt 24
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
caatgccctg ggctctgtaa a 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
agcttaaact gggaagctgg t 21
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
caaatgattc ccccactgca gt 22
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
gactaaatca acagaggctt gc 22
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
atcacagaag tctgggatgt g 21
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
agcccaaaaa gacagacag 19
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
gttggtcagg ctgactatgg a 21
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
gattccacat ttatcctcat tgac 24
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
agtgccagat gctcgttgt 19
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
atggtataaa aatggaatca ctct 24
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>13
atgagtatag tttcacgtag ctataat 27
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
tctgaagtaa gtaaaacatt gttaca 26
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
tctttaatct ggacacaagt cctt 24
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>16
gcctggaagg tcgaagctga 20
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>17
cagaataaga ttctgttgaa ggaaag 26
<210>18
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>18
gaataaaaat cttctctctt tcttcctc 28
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>19
agtgcttttt agccaagtga ttcc 24
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>20
ttttcctctt tggtatcctt atg 23
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>21
ccataaatat gtgagtcaat tcc 23
<210>22
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>22
ttagtcaatg ttctccagag acagac 26
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>23
ccaccttcct ctgcttcact tt 22
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>24
ttactcctgt tcccttcccg ct 22
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>25
gtctgccttt caggcatttc agaga 25
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>26
gttgctcaag ggtcaactgt g 21
<210>27
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>27
tccagagaga tagaagcaat agtgtgc 27
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>28
aattacctct ctttcttctg gagc 24
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>29
ttggagctaa gtggctgtgg tgt 23
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>30
caggaatcat gagccaggaa 20
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>31
gggactgtca tgagattttt cagc 24
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>32
taacaggatc aatggatgca t 21
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>33
atttggaaac agaaatggct tgg 23
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>34
agcttttcct accagaatgc cagt 24
<210>35
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>35
acagatgata aatacatagg atggatgg 28
<210>36
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>36
gcccctcatt ttatagacgt tactagtc 28
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>37
tatttgggtt attaattgag aaaactcctt ac 32
<210>38
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>38
gtgagttgaa aattgtggac aggtgcgg 28
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>39
cccattggcc tgttcctccc t 21
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>40
gcttccgagt gcaggtcaca 20
<210>41
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>41
catgccactg cacttcact 19
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>42
gtcttacaat aacagttgct actat 25
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>43
gctaaccacc ctgtgtctca gt 22
<210>44
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>44
ctccaggttc ccacccaacc ca 22
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>45
gccccatagg ttttgaactc 20
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>46
tttgcgcttc aggacttcaa tt 22

Claims (10)

1.引物对组合，包括用于扩增插入缺失位点Yindel的引物对1、用于扩增性别鉴定位点AMEL的引物对2、用于扩增STR基因位点D3S1358的引物对3、用于扩增STR基因位点D13S317的引物对4、用于扩增STR基因位点D7S820的引物对5、用于扩增STR基因位点D16S539的引物对6、用于扩增STR基因位点D8S1179的引物对7、用于扩增STR基因位点Penta D的引物对8、用于扩增STR基因位点D19S433的引物对9、用于扩增STR基因位点D5S818的引物对10、用于扩增STR基因位点D21S11的引物对11、用于扩增STR基因位点TPOX的引物对12、用于扩增STR基因位点D1S1656的引物对13、用于扩增STR基因位点D6S1043的引物对14、用于扩增STR基因位点D2S441的引物对15、用于扩增STR基因位点D12S391的引物对16、用于扩增STR基因位点D2S1338的引物对17、用于扩增STR基因位点vWA的引物对18、用于扩增STR基因位点PentaE的引物对19、用于扩增STR基因位点TH01的引物对20、用于扩增STR基因位点D18S51的引物对21、用于扩增STR基因位点CSF1PO的引物对22和用于扩增STR基因位点FGA的引物对23；
每个引物对由位于相应基因位点两侧的一对引物组成。
2.如权利要求1所述的引物对组合，其特征在于：每对引物对中的一条引物用荧光标记。
3.如权利要求1或2所述的引物对组合，其特征在于：
所述引物对1由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成；
所述引物对2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物组成；
所述引物对3由序列表中序列5所示的引物和序列表中序列6所示的引物组成；
所述引物对4由序列表中序列7所示的引物和序列表中序列8所示的引物组成；
所述引物对5由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成；
所述引物对6由序列表中序列11所示的引物和序列表中序列12所示的引物组成；
所述引物对7由序列表中序列13所示的引物和序列表中序列14所示的引物组成；
所述引物对8由序列表中序列15所示的引物和序列表中序列16所示的引物组成；
所述引物对9由序列表中序列17所示的引物和序列表中序列18所示的引物组成；
所述引物对10由序列表中序列19所示的引物和序列表中序列20所示的引物组成；
所述引物对11由序列表中序列21所示的引物和序列表中序列22所示的引物组成；
所述引物对12由序列表中序列23所示的引物和序列表中序列24所示的引物组成；
所述引物对13由序列表中序列25所示的引物和序列表中序列26所示的引物组成；
所述引物对14由序列表中序列27所示的引物和序列表中序列28所示的引物组成；
所述引物对15由序列表中序列29所示的引物和序列表中序列30所示的引物组成；
所述引物对16由序列表中序列31所示的引物和序列表中序列32所示的引物组成；
所述引物对17由序列表中序列33所示的引物和序列表中序列34所示的引物组成；
所述引物对18由序列表中序列35所示的引物和序列表中序列36所示的引物组成；
所述引物对19由序列表中序列37所示的引物和序列表中序列38所示的引物组成；
所述引物对20由序列表中序列39所示的引物和序列表中序列40所示的引物组成；
所述引物对21由序列表中序列41所示的引物和序列表中序列42所示的引物组成；
所述引物对22由序列表中序列43所示的引物和序列表中序列44所示的引物组成；
所述引物对23由序列表中序列45所示的引物和序列表中序列46所示的引物组成。
4.如权利要求1至3任一所述的引物对组合，其特征在于：
所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7和所述引物对8中每对引物对中的一条引物的5’末端用6’-FAM标记；
所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13和所述引物对14中每对引物对中的一条引物的5’末端用HEX标记；
所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18和所述引物对19中每对引物对中的一条引物的5’末端用TAMRA标记；
所述引物对20、所述引物对21、所述引物对22和所述引物对23中每对引物对中的一条引物的5’末端用ROX标记。
5.一种检测23个基因位点的复合扩增体系，包括权利要求1至4任一所述引物对组合；所述23个基因位点为D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、Penta D、D19S433、D5S818、D21S11、TPOX、D1S1656、D6S1043、D2S441、D12S391、D2S1338、vWA、Penta E、TH01、D18S51、CSF1PO、FGA、AMEL和Yindel。
6.如权利要求5所述的复合扩增体系，其特征在于：
所述引物对1的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.5μM；
所述引物对2的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.4μM；
所述引物对3的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.55μM；
所述引物对4的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.55μM；
所述引物对5的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM；
所述引物对6的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM；
所述引物对7的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为1.00μM；
所述引物对8的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为3.65μM；
所述引物对9的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为1.45μM；
所述引物对10的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM；
所述引物对11的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.95μM；
所述引物对12的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.45μM；
所述引物对13的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.90μM；
所述引物对14的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.70μM；
所述引物对15的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM；
所述引物对16的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.40μM；
所述引物对17的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.70μM；
所述引物对18的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.35μM；
所述引物对19的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为1.50μM；
所述引物对20的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.25μM；
所述引物对21的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.80μM；
所述引物对22的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.40μM；
所述引物对23的各条引物在所述复合扩增体系中的浓度为0.75μM。
7.含有权利要求1至4任一所述引物对组合、或、权利要求5或6所述复合扩增体系的试剂盒；所述试剂盒的用途为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)个体识别；a3)亲权鉴定。
8.X1)或X2)：
X1)权利要求1至4任一所述引物对组合，或，权利要求5或6所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)个体识别；a3)亲权鉴定；
X2)权利要求1至4任一所述引物对组合，或，权利要求5或6所述复合扩增体系的应用，为a1)或a2)或a3)：a1)STR分型；a2)个体识别；a3)亲权鉴定。
9.一种五色荧光STR分型方法，包括如下步骤：
(1)以待测个体的基因组DNA为模板，采用权利要求1至4任一所述引物对组合、或、权利要求5或6任一所述复合扩增体系进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(2)完成步骤(1)后，取PCR扩增产物，变性，然后毛细管电泳检测，得到待测个体的基因组DNA的23个基因位点的基因型；
(3)完成步骤(2)后，根据23个基因位点的基因型获得所述待测个体的STR分型结果；
所述23个基因位点为D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、Penta D、D19S433、D5S818、D21S11、TPOX、D1S1656、D6S1043、D2S441、D12S391、D2S1338、vWA、Penta E、TH01、D18S51、CSF1PO、FGA、AMEL和Yindel。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述待测个体的基因组DNA为从人类组织中提取的基因组DNA。
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