CN110373475A - 同时检测39个y染色体str基因座的复合扩增试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测人类Y染色体39个STR基因座的复合扩增试剂盒，可在一个复合扩增反应体系中同时扩增39个Y染色体基因座，包括26个单拷贝基因座、3个双拷贝基因座、1个三拷贝基因座和1个四拷贝基因座，通过设计独特的基因座排布方式及特异性引物序列，将39个基因座分为5组，每组标记不同的荧光标记。该试剂盒具有高分辨率，男性样本间个体识别力高。
Description
技术领域
本发明属于DNA鉴定技术领域，具体涉及一种同时检测人类Y染色体39个STR基因座的复合扩增试剂盒。
背景技术
在分析犯罪现场发现的DNA中，使用STR标记已成为标准工具。在多数情况下，利用常染色体STR标记，这部分地因为其在大多数群体中的高水平多态性。例如，在美国，用于建立疑犯DNA数据库的标准的13个CODIS基因座为常染色体STR标记。在许多混有男性和女性贡献者血迹的案例中，特别在强奸案中，法医调查人员必须分析Y染色体上存在的遗传标记以鉴别通常属于犯罪者的男性组分。这是因为在这种案件中，常染色体STR标记由于例如女性受害者DNA与男性犯罪者DNA之间的谱重叠而不能提供信息。尽管存在优先获取男性DNA的技术可能(即差异裂解)，但此类技术往往不成功。因为女性DNA缺少Y染色体，Y染色体标记的分析可用于相对样品中的男性DNA含有高水平女性DNA的样品。因此，分析Y染色体DNA排除了由过量女性来源DNA导致的复杂假象。
Y染色体STR遗传标记是指存在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列。Y染色体STR遗传标记与常染色体STR遗传标记相比，具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征，将其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合，可进行法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等。
目前商品化Y-STR试剂盒虽种类繁多，主流试剂盒有YfilerPlus、PowerPLexY23、GoldeneyeY26、STRtyper27Y、AGCUDatabaseY24，但基因座最多的YfilerTM Platinum PCR扩增试剂盒也仅能复合扩增38个Y-STR基因座，满足不了实际工作中进一步缩小家系范围的要求。为此，本文选择了除DYS593外，与YfilerTM Platinum PCR及其他商品试剂盒YfilerPlus、PowerPLexY23、GoldeneyeY26、STRtyper27Y、AGCUDatabaseY24扩增试剂盒所选基因座均不相同的多态性好、单倍型识别能力高的39个Y-STR基因座，以增加家系鉴别能力。
因此，DNA鉴定领域需要具有一个反应扩增更多基因座、能提供更多信量和具有更好兼容性的Y-STR复合扩增体系。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，获得一种具有高分辨率且能够满足Y-STR数据库建设及男性个体家系排查的试剂盒，本发明提供了不同于YfilerPlus、PowerPLexY23、GoldeneyeY26、STRtyper27Y、AGCUDatabaseY24位点的人类Y染色体39个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
人类Y染色体39个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，所述的试剂盒包括用于扩增39个Y-STR基因座的特异性引物，39个Y-STR基因座为：DYS426、DYS593、DYS630、YPENTA1、DYS722、DYS617、YPENTA2、DYS443、Y-GATA-A10、DYS561、DYF404S1、DYS464、DYS713、DYS446、DYS607、DYS708、DYS622、DYS707、DYS520、DYS434、DYS505、DYS709、DYS552、DYS510、DYS508、DYS531、DYS459、DYS587、DYF411S1、DYS594和DYF399S1。其中，DYF404S1、DYF411S1、DYS459为双拷贝基因座，DYF399S1为三拷贝基因座，DYS464为四拷贝基因座，其余26个基因座为单拷贝基因座。
进一步地，39个Y-STR基因座对应的引物如下表所示：
根据扩增片段长度将基因座分为下述组合：第一组：DYS426、DYS593、DYS630、YPENTA1、DYS722、DYS617、YPENTA2、DYS443；第二组：Y-GATA-A10、DYS561、DYF404S1、DYS464、DYS713；第三组：DYS446、DYS607、DYS708、DYS622、DYS707、DYS520；第四组：DYS434、DYS505、DYS709、DYS552、DYS510、DYS508；第五组：DYS531、DYS459、DYS587、DYF411S1、DYS594、DYF399S1。
进一步地，39个STR基因座的引物对使用5种不同的荧光染料标记，根据上述分组，每组引物分别由不同颜色的荧光标记，每对引物中有一个引物的5’端进行荧光标记。
进一步地，所述荧光染料包括：蓝色荧光、绿色荧光、黄色荧光、红色荧光或紫色荧光染料。
进一步地，本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括：30mM KCI、50mMTris-HCI(pH8.3、25℃)、3.0mM MgCl2、0.5mg/mLBSA(牛血清白蛋白)和各0.4mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。
进一步地，本发明Y染色体39个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒的扩增程序具体步骤如下：95℃保温11分钟；94℃保温20秒钟、59℃保温1分钟、该步骤运行28个循环；60℃保温30分钟；4℃保温。
本发明在上述反应缓冲体系中按照指定的反应程序扩增模板DNA、可以得到各基因座混合的扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物、扩增产物也带有荧光标记物、并且标记物可以在激光激发下发出可以通过测序仪(如ABI3730、3500)识别的光信号、所以扩增产物可以通过测序仪进行电泳和检测分析。
在测序仪上进行检测的时候、扩增产物与分子量内标、甲酰胺按照一定比例混合、进入仪器毛细管。分子量内标是由多条已知长度的荧光标记DNA片段组成、用来计算PCR扩增产物片段长度、从而可以判断基因分型以及与等位基因阶梯比对。电泳后的数据可以在GeneMapper、GeneMarker等数据分析软件上分析、得到STR基因分型图谱和数据。
本发明的有益效果在于：
1)本发明试剂盒位点不同于现有商品试剂盒YfilerPlus、PowerPLexY23、GoldeneyeY26、STRtyper27Y、AGCUDatabaseY24的位点，其荧光STR分型数据均采用3730测序验证。
2)本发明试剂盒不同于现有商品试剂盒YfilerPlus、PowerPLexY23、GoldeneyeY26、STRtyper27Y、AGCUDatabaseY24的位点，其STR等位基因分型均来自于样本数据统计(见附件表1)。
3)本发明所述的试剂盒是包含39个Y染色体基因座的复合扩增系统，所述的基因座包括26个单拷贝基因座、3个双拷贝基因座、1个三拷贝基因座和1个四拷贝基因座，利用本发明提供的试剂盒可在一个复合扩增反应体系中同时扩增39个Y染色体基因座，具有很高的个体识别率和很高的兼容性。
附图说明
图1.DNA样本采用本发明所述的引物PCR扩增后的分析图谱。
图2.39个Y基因座等位基因分型标准物Alleic Ladder分析图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明。下面的实施例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。
实施例复合扩增39个基因座位并分析其基因型
购买标准品DNA 007，模板DNA直接扩增。扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3130xl遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapper ID v3.2软件。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因阶梯(ladder)均为本领域技术人员常用的常规材料。
本发明所述的人类Y染色体39个STR基因座为：DYS426、DYS593、DYS630、YPENTA1、DYS722、DYS617、YPENTA2、DYS443、Y-GATA-A10、DYS561、DYF404S1、DYS464、DYS713、DYS446、DYS607、DYS708、DYS622、DYS707、DYS520、DYS434、DYS505、DYS709、DYS552、DYS510、DYS508、DYS531、DYS459、DYS587、DYF411S1、DYS594和DYF399S1。DYF404S1、DYF411S1、DYS459为双拷贝基因座；DYF399S1为三拷贝基因座；DYS464为四拷贝基因座；其余26个基因座为单拷贝基因座。所述基因座的等位基因频率及基因多样性如下表：
39个Y-STR基因座的等位基因频率及基因多样性(n＝1031)
针对上述39个基因座，在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物，引物序列及其浓度见下表：
本发明复合扩增系统，根据扩增片段长度将基因座分为下述组合：第一组：DYS426、DYS593、DYS630、YPENTA1、DYS722、DYS617、YPENTA2、DYS443，荧光染料标记物为FAM；第二组：Y-GATA-A10、DYS561、DYF404S1、DYS464、DYS713，荧光染料标记物为HEX；第三组：DYS446、DYS607、DYS708、DYS622、DYS707、DYS520，荧光染料标记物为TMR；第四组：DYS434、DYS505、DYS709、DYS552、DYS510、DYS508，荧光染料标记物为ROX；第五组：DYS531、DYS459、DYS587、DYF411S1、DYS594、DYF399S1，荧光染料标记物为PUR。每对引物中有一条引物的5′端标记荧光染料。
1.1.聚合酶链式反应(PCR)扩增
1)取缓冲液、引物混合物，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μL，加入模板DNA。
2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪(ABI9700PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。95℃保温1分钟；98℃保温30秒钟，60℃保温35秒钟，68℃保温15秒钟，运行30个循环；4℃持续保温，直至取出样品。
1.2.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3130xl遗传分析仪进行电泳和检测
a.取(0.5μL荧光分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液；
b.混匀后分装，每管10μL，再分别加入1μL扩增产物和等位基因阶梯(ladder)，简短离心将液体收集到离心管底部；
c.样品95℃变性3分钟，然后迅速冰上冷却3分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态；
d.将样品放入基因分析仪的样品托盘中，开始电泳检测；
e.大约40分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和分型结果(见图1)。
序列表
<110> 武汉瑞博科创生物技术有限公司
潍坊市公安局
<120> 39个Y染色体STR基因座复合扩增及试剂盒
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<400> 58
tggatccttt aattccgtat c 21
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cggtaataat cccgtagcat tt 22
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
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<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cgcatgtcaa tggtacctac t 21
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cgttagttca tggcatatga tc 22
Claims (5)
1.人类Y染色体39个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，特征在于，所述试剂盒包括用于扩增39个Y-STR基因座的特异性引物，39个Y-STR基因座为：DYS426、DYS593、DYS630、YPENTA1、DYS722、DYS617、YPENTA2、DYS443、Y-GATA-A10、DYS561、DYF404S1、DYS464、DYS713、DYS446、DYS607、DYS708、DYS622、DYS707、DYS520、DYS434、DYS505、DYS709、DYS552、DYS510、DYS508、DYS531、DYS459、DYS587、DYF411S1、DYS594和DYF399S1。
2.根据权利要求1所述的人类Y染色体39个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述39个Y-STR基因座对应的上下游引物序列如SEQ ID NO：1-62所示。
3.根据权利要求1所述的人类Y染色体39个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述的39个基因座分为下述组合：第一组：DYS426、DYS593、DYS630、YPENTA1、DYS722、DYS617、YPENTA2、DYS443；第二组：Y-GATA-A10、DYS561、DYF404S1、DYS464、DYS713；第三组：DYS446、DYS607、DYS708、DYS622、DYS707、DYS520；第四组：DYS434、DYS505、DYS709、DYS552、DYS510、DYS508；第五组：DYS531、DYS459、DYS587、DYF411S1、DYS594、DYF399S1。
4.根据权利要求3所述的人类Y染色体39个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，每对引物中有一个引物进行荧光的5’端标记，每组引物分别由不同颜色的荧光标记。
5.根据权利要求4所述的人类Y染色体39个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光染料包括：蓝色荧光、绿色荧光、黄色荧光、红色荧光或紫色荧光染料。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2019
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