CN102676676A - 一种y染色体str基因座荧光检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒及其应用，属于分子检测技术领域。本发明的试剂盒包含人Y染色体上24个基因座（DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570和DYS444）相对应的扩增引物。该检测试剂盒能够提高针对中国男性的累计个体识别力和累积非父排出率，提高个体鉴别力，对于法医个体识别、亲权鉴定、人口迁移进化研究、人口历史和家系变化研究等多个领域都有实践意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因座荧光标记复合扩增检验系统，具体涉及一种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒及其应用。
背景技术
短串联重复序列基因座（STR）是目前普遍应用的遗传标记，是2-6个bp长的串联重复序列，其长度在几十到几百bp之间。这种串联重复形成的DNA序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，也就是说，STR基因座具有极高的个体鉴定能力，所以常作为遗传标记而被用于DNA分析技术中法医个体识别、亲缘关系鉴定，同时也是DNA数据库建立的主流技术。90年代初STR基因座多态性的发现，特别是STR基因座具有片段小容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。
Y染色体是性染色体的一种，属于近端着丝粒染色体。根据遗传方式不同可以将其分为两个区，即位于Y染色体两端的拟常染区（pseudoautosomal region, PAR）和Y特异区。减数分裂时，拟常染区要与X染色体进行交换重组，而Y特异区则不发生交换，由父亲独立向下遗传给儿子，并且存有父系祖先的突变记录，是形成Y特异区多态性的基础。Y染色体突变率不超过常染色体，Y染色体的遗传标记位于非重组区，也就是说整个非重组区相当于一个遗传标记，因此Y 染色体遗传标记的个人识别能力和亲权鉴定能力不能像常染色体那样使用相乘原则，个人识别和亲权鉴定的评估十分有限。但是在国际惯例里面必须有三个以上基因座不同才能否认有血缘关系。为了达到足够的排除概率，法医DNA分析必须尽可能增加更多的Y染色体遗传标记。在法医鉴定领域，DNA分析主要依赖商业化的试剂盒进行。其中Applied Biosystems公司在2004年秋发布的包含17个Y-STR基因座的YfilerTM试剂盒，包括DYS19、DYS385a/b 、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS456、DYS458、DYS635、Y GATA H4、DYS448，是目前可复合扩增Y-STR最多的商品化试剂盒和无锡中德美联生物技术有线公司在2011年研发的Y18试剂盒在YfilerTM的基础上增加了DYS447。这些现有试剂盒主要是按照欧洲人群（主要为白人群体）统计选择的基因座位点，其中不少基因座的多态性在中国人群中比较低，如DYS391在中国人群中多态性小于0.4，因而造成了个体识别能力低，在法医鉴定的实际应用中会遇到瓶颈，比如嫌疑人与不同几个家系的成员分型匹配，造成无法排查的情况，浪费了大量的人力物力。且由于Y染色体容易存在缺失的情况，造成基因座的丢失本应是同一个家系的无法认定，误导了侦破方向。
因此，开发一种基因座多态性高和能同时检测更多基因座的试剂盒，成为亲子鉴定、法医检测家系排查等迫切需要。且这个试剂盒与现有Y染色体STR的检测试剂盒，比如ABI的Yfiler试剂盒联用进行Y染色体STR基因座的检测，能够明显地提高Y染色体DNA检验系统的累计个体识别能力和累积非父排除率，更加符合DNA检验的技术要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供上述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
根据过去十几年针对中国人群Y染色体的研究，筛选出针对中国男性GD(gene diversity)数值高的Y染色体STR基因座，分别设计了其相对应的扩增引物，可同时分析人Y染色体DNA 24个基因座多态性。所述24个基因座见下表1：
表1
根据上述24个基因座，发明了一种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，包含以下24个基因座的扩增引物核苷酸序列（见表2）：
表2
由于复合扩增体系中基因座数目较多，相互之间会有竞争影响，因此各基因座的相对平衡控制难度加大，通过多次反复实验，调节引物浓度与配比，终达到平衡。作为一种优选方案，上述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒中各基因座的扩增引物浓度优选表2中的浓度。
在上述试剂盒中，每个基因座对应的引物中至少有一条序列的5’端进行荧光染料标记，荧光染料标记物为6-FAM(6-carboxy-fluorescein)、HEX(5-hexachloro-fluorescein)、TAMRA (tetramethyl-6- carboxyrhodamine)或 ROX(6-carboxy-x-rhodamine)中的任意一种。
为了使检测结果更直观，可以将Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒中24个基因座的扩增引物核苷酸序列分为4组，分别进行5’端荧光染料标记：
第一组：DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510和DYS449，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中的任意一种；
第二组：DYS459a、DYS459b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a和DYS527b，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中第一组未使用的任意一种；
第三组：DYS460、Y–GATA-A10、DYS520、DYS557和DYS522，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中第一组和第二组均未使用的任意一种；
第四组：DYS481、DYS570、DYS385a、DYS385b和DYS444，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中前三组均未使用的任意一种。
上述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒还设有内标，用本申请人专利《用于寡核苷酸和蛋白标记的荧光染料及其制备方法和用途》（专利号CN200810116622）中的染料SIZ标记内标作为橙色荧光标记物。
上述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒还包括反应混合液和热启动Taq酶，所述反应混合液(Reaction Mix）组成为：MgCl2 7.5mM, Tris-HCl 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM，BSA 2g/L。
更具体些，试剂盒与样品DNA组成的体系图表3：
表3
上述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒的使用方法，具体步骤为：将PCR扩增管置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃变性11min；（94℃ 1min，62℃ 1min，72℃ 1min）×10个循环；（90℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min）×20个循环；60℃延伸60min；4℃保温。扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析遗传分析仪检测收集的数据。
上述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒可以用于法医个体识别、亲权鉴定、人口迁移进化研究、人口历史和家系变化研究等多种领域。不但可以单独使用，也可以与现有的Y试剂盒联用，对部分现有的Y试剂盒无法排查的案例进行补充，提高检测准确率。
比如ABI的Yfiler试剂盒联用可以达到38个Y染色体STR基因座的检测，能够明显地提高Y染色体DNA检验系统的累计个体识别能力和累积非父排除率，更加符合DNA检验的技术要求。
表4
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的荧光标记复合扩增检验系统良好的应用效果主要表现在下述几个方面：
1、系统的灵敏度高、特异性强
本发明中24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统在DNA模板量为1.0ng的条件下，可检出全部24个基因座，各基因座峰值均衡，且无非特异性峰产生。
2、系统适应于不同来源的检材
本发明中24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统对同一个体的血痕、口腔拭子、毛发及组织的DNA进行复合扩增和荧光检测，结果一致，表明该系统适应于不同来源的检材。
3、种属特异性强
本发明中24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统检验犬、猪、马、牛、猫、鸡、鸭、鼠、鱼和大肠杆菌等，没有出现特异性扩增峰，表明该系统具有种属特异性。
附图说明
图1. 父母缺失的亲子鉴定应用实例中的Y-STR分型结果中叔叔的分型图。
图2. 父母缺失的亲子鉴定应用实例中的Y-STR分型结果中侄子的分型图。
图3. Y染色体24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统等位基因分型标准物。
图4. 案例中嫌疑人家系比对确认图中嫌疑人的分型图。
图5. 案例中嫌疑人家系比对确认图中家系1中男性个体的分型图。
图6. 案例中嫌疑人家系比对确认图中家系2中男性个体的分型图；
图7. 本发明试剂盒检测的案例中嫌疑人家系比对确认图中嫌疑人的分型图；
图8. 本发明试剂盒检测的案例中嫌疑人家系比对确认图中家系1中男性个体的分型图；
图9. 本发明试剂盒检测的案例中嫌疑人家系比对确认图中家系2中男性个体的分型图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步解释本发明，但实施例不对本发明作任何形式的限制，实施例中除特殊说明外，均为本领域常规实验手段。
实施例1 筛选基因座
通过对DYS19、DYS381、DYS385a/b、DYS388、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS425、DYS426、DYS437、DYS438、DYS439、DYS443、DYS444、DYS446、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS459、DYS450、DYS460 (A7.1) 、DYS462、DYS468、DYS481、DYS522、DYS527a/b、Y-GATA-H4、Y-GATA-A10、DYS504、DYS505、DYS510、DYS513、DYS520、DYS522、DYS531、DYS542、DYS552、DYS557、DYS570、DYS576、DYS587、DYS593、DYS607、DYS622、DYS630、DYS635（C4）、DYS643、DYS709、DYS710等53个基因座的在中国人群中的多态性调查，并对其中国男性GD值进行统计，从中选择GD>0.6的基因座24个：DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y –GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570、DYS444、DYS385a/b、DYS635，这24个基因座中，22个为全新的基因座，仅DYS635和DYS385a/b为已有的商品化试剂盒中出现，24个STR基因座的等位基因范围和Genbank登记号见表1。
实施例2 24个STR基因座对应引物的设计
1、引物设计
引物设计模版从NCBI Genbank上获取，将获取的模板序列在NCBI blast中比对，寻找到与X染色体的同源区，在设计引物时尽量避免。在组合方案的基础上，根据24个基因座核心重复单元的侧翼序列使用引物设计软件oligo6及primer5进行引物设计，设计时遵循引物设计原则，优先考虑特异性和引物扩增效率，再将设计完的引物进行primer blast，寻找与其他模板非特异结合最少的引物。通过实验摸索和优化获得24个STR基因座相对应的引物，如表2中所示，所得结果中没有发现非特异性峰，实现了24个基因座中在同一反应中的复合扩增，同时将全部基因座扩增产物控制在450bp以内。
2 、复合扩增条件的建立
（1）先对24个基因座的单一扩增条件进行优化，反应体系的配置见下表：
表5 反应体系配置表
（2）扩增热循环实验方案
将PCR扩增管置于热循环仪上，选择下面推荐的程序进行扩增，扩增后的样品应避光保存。
表6 热循环仪的扩增程序
3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标（AGCU Marker SIZ-500）组成上样混合物〔（0.5μL AGCU Marker SIZ-500）×（进样数）＋（12μL去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物或系统中等位基因分析标准物（Y-GAZA Allelic Ladder）混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。
4、24个基因座对应引物的浓度优化
在实验中，以酶浓度1.0μL，镁离子浓度2.5mM，其他组分按表2中所示的反应体系配置加样，各对引物从浓度0.02μM至1.0μM做梯度以比较不同引物浓度的影响，浓度间隔为0.02μM，做单扩实验，按表6中所示扩增程序扩增。然后用基因分析仪检测结果，根据检测结果，选择峰高RFU在2000-3000之间的引物浓度，用来配置复合扩增引物。最后，根据复合扩增检测结果，对会引起非特异扩增的引物，重新设计引物（不要加浓度，重新设计引物序列），重新回到之前的单扩实验，再做复合扩增，直至复合扩增中不出现非特异扩增。根据复合扩增的结果，对引物浓度做微调。优化所得24个基因座对应的引物浓度如表2所述，此时各基因座峰值均衡，无特异峰。
随着复合扩增体系中基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，通过多次反复实验，调节引物浓度与配比，终达到平衡。
5、荧光标记STR 复合扩增体系的优化及建立
在分别成功地建立了24个单个基因座扩增条件的基础上，总体研究24个基因座复合扩增反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如循环参数、退火温度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，最终建立起24个基因座的复合扩增体系。
在实验中，按上述三个步骤的实验过程，其中引物浓度按上述复扩选择结果，见表2，对酶浓度与镁离子浓度这两个因素做正交实验进行优化，其中酶浓度取0.8μL，1.0μL，1.5μL，2μL四个水平；镁离子浓度取1.25mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM和3.0mM五个水平，其他组分按表5中所示反应体系配置表加样，扩增程序按表6中所示扩增程序扩增，用基因分析仪检测结果，最后选定酶浓度在1.0，酶离子浓度在2.7mM，此时，各基因座扩增扩增峰高RFU在2500左右，均衡性好。
为保证酶的活性和扩增产物的量，扩增的循环数一般在28~32，反应体系中引物按表2确定后的浓度，酶、镁离子浓度按优化后的浓度，分别测试了26-34个循环的扩增结果。通过基因分析仪检测结果，循环数在少于28个时，扩增峰值偏低，甚至会有基因座丢失；多于32个循环时，扩增峰太高，容易出现pull up峰，且片段短的基因座由于更加容易扩增，循环数过多，容易造成基因座之间扩增的不均衡。根据测试，本发明推荐用循环数30扩增。
反应体系中引物按表2确定后的浓度，酶、镁离子浓度按优化后的浓度，循环数设置30个，测试了退火温度在55℃，57℃，59℃，61℃，63℃，65℃时的扩增结果，通过基因分析仪检测结果，在57℃，59℃，61℃这三个温度扩增均衡性、峰高都较好，且在上述温度内均没有非特异扩增。考虑扩增效率且对于各种不同检材的扩增效率及扩增特异性考虑，本发明推荐退火温度设在59℃。
实施例3 荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计
对荧光染料进行鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、橙五种荧光标记物，构建了5色荧光组合方案。在确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，设计出基因座组合方式以及荧光标记类型。从生产成本及各基因座引物扩增效率等方面考虑，将24个基因座分成4组，使用FAM、HEX、TAMRA、ROX分组标记，分子量内标用第5种颜色橙色的荧光染料SIZ进行标记。
经过筛选，最终确定一种优选的荧光染料标记的方法具体为：DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、为第一组，采用FAM标记；DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a/b为一组，采用HEX标记；DYS460、Y–GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522为一组，采用TAMRA标记；DYS481、DYS570、DYS385a/b、DYS444为一组，采用ROX标记；该试剂盒还设有内标，内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。这种基因座组合方式使得仅需标记5种荧光就可实现这24个基因座同时检测分析。
实施例4 试剂盒在亲子鉴定中的应用
1、收集亲子鉴定案件中的血斑：对广州某公安局亲子鉴定用（131，132）的样本。
2、各种检材的基因组DNA提取：参考《GA/T 383-2002 法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、扩增检测：按照实施例2~4进行荧光标记、PCR扩增和遗传分析仪检测并最终获得分型结果，侄子的分型结果见图1，叔叔的分型结果见图2，其对比结果见下表：
表7
结果显示：叔-侄24个Y STR的检测结果完全一致，说明他们属于同一个男性家族。但是Y染色体检测的特殊性，并不能确定他们之间叔侄关系，需要进一步对常染色体，甚至更多家庭成员进行检测。所以，本发明提供的试剂盒在亲子鉴定中一般作为常染色体鉴定结果的补充与佐证。
实施例5 本发明所提供试剂盒在司法鉴定中的应用
1、材料：广州某地发了多起案子，作案人确定是同一个人，符合Y排查的条件，用AGCU Y18 STR荧光检测试剂盒排查，找出了2个家系中成员（s2，s9）基因座分型与嫌疑人完全一致，而这两个家系从家谱看，相隔较远，无法判断嫌疑人来自哪个家系。如果直接用常染色体检测这两个家系的成员，成本巨大并且耗时。取检测嫌疑人样本与2个家系成员中的s2，s9血液样本用本发明提供试剂盒检测基因分型。
2、各种检材的基因组DNA提取：参考《GA/T 383-2002 法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、扩增检测：AGCU Y18 STR荧光检测试剂盒扩增按说明书进行，嫌疑人、家系1成员s2及家系2成员s9扩增结果如图4-6，分型结果见表8。本发明试剂盒按照实施例2~4进行荧光标记、PCR扩增和遗传分析仪检测并最终获得分型结果，嫌疑人、家系1成员s2及家系2成员s9扩增结果如图7-9，分型结果如表9。
表8
表9
从表8，用AGCU Y18 STR荧光检测试剂盒（现有商品化试剂盒，购自无锡中德美联生物科技有限公司，开发单位之一）检测时，嫌疑人s1与两个家系成员的s2，s9分型结果完全一致。按照家系排查的原则，不能排除嫌疑人来自这两个家系的可能。而实际上这两个家系相距较远，嫌疑人不可能同时来自这两个家系，只能是其中之一。这给案件进一步侦破带来困难。
用本发明试剂盒检测之后，从表9中可见，嫌疑人与家系1成员s2差异的基因座有4个分别为：DYS630、DYS622、DYS527和DYS481，根据排查的原则，差异基因座有三个或三个以上可以排除，排除嫌疑人为家系1成员的嫌疑。嫌疑人与家系2成员s9所有24个基因座完全一致，不排除嫌疑人是家系2成员。进一步对家系2的成员用常染色体STR分析，最终锁定了嫌疑人来自家系2。
在Y染色体家系排查的应用中，增加位点可以提高个体识别率，为侦破案件指明方向，减少不必要的浪费；在另一方面由于Y染色体的突变概率与常染色体相似，排查中考虑到突变的影响，增加体系的基因座对于部分扩增基因座存在突变的个体排查不遗漏，在应用方面更加需要灵活与变通。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市刑事科学技术研究所，无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 一种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒及其应用
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<160> 42
<170> PatentIn version 3.3
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atcctctgcc tatcattt 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gacagtagca agcacaag 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acctacctat ccacctgc 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gtgggtggat tgatagat 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
aacagcctgc ccaacata 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tgctttcctc aacctccc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
attgtgacat acgcatct 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cagggttaag acagaagt 18
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<212> DNA
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aggcgggtaa tagatttt 18
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<212> DNA
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agtaatgctc cctgagtg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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taaaaggaat gtggctaa 18
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<213> 人工序列
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aggttgcaag actcaaaa 18
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tgtctacaat ggctcacg 18
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<400> 39
acatagtcct cctttctt 18
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<213> 人工序列
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gaactgaaat gatggcac 18
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<211> 18
<212> DNA
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tggcatgttt attttcat 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tcactccagt cattttca 18
Claims (8)
1.一种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于包含以下24个基因座的扩增引物核苷酸序列：DYS531：SEQ ID NO:1~2；DYS630：SEQ ID NO:3~4；DYS622：SEQ ID NO:5~6；DYS552：SEQ ID NO:7~8；DYS510：SEQ ID NO:9~10；DYS449：SEQ ID NO:11~12；DYS459a和DYS459b：SEQ ID NO:13~14；DYS446：SEQ ID NO:15~16；DYS443：SEQ ID NO:17~18；DYS635：SEQ ID NO:19~20；DYS587：SEQ ID NO:21~22；DYS527a和DYS527b：SEQ ID NO:23~24；DYS460：SEQ ID NO:25~26；Y–GATA-A10：SEQ ID NO:27~28；DYS520：SEQ ID NO:29~30；DYS557：SEQ ID NO:31~32；DYS522：SEQ ID NO:33~34；DYS481：SEQ ID NO:35~36；DYS570：SEQ ID NO:37~38；DYS385a和DYS385b：SEQ ID NO:39~40；DYS444：SEQ ID NO:41~42。
2.根据权利要求1所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于24个基因座的扩增引物浓度分别如下：
DYS531和DYS552：0.20μM；DYS630：0.25μM；DYS622：0.40μM；DYS510、DYS443和DYS635：0.80μM；DYS449：0.35μM；DYS459a和DYS459b：0.55μM；DYS446：0.70μM；DYS587：1.50μM；DYS527a、DYS527b和DYS520：1.35μM；DYS460：0.55μM；Y-GATA-A10：1.60μM；DYS557：1.55μM；DYS522：1.20μM；DYS481：1.85μM；DYS570、DYS385a和DYS385b：2.00μM；DYS444：3.00μM；
所述引物浓度均为上、下游引物的浓度。
3.根据权利要求2所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于每个基因座对应的引物中至少有一条序列的5’端进行荧光染料标记，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中的任意一种。
4.根据权利要求2所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于24个基因座的扩增引物核苷酸序列分为4组，分别进行5’端荧光染料标记：
第一组：DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510和DYS449，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中的任意一种；
第二组：DYS459a、DYS459b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a和DYS527b，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中第一组未使用的任意一种；
第三组：DYS460、Y –GATA-A10、DYS520、DYS557和DYS522，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中第一组和第二组均未使用的任意一种；
第四组：DYS481、DYS570、DYS385a、DYS385b和DYS444，荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX中前三组均未使用的任意一种。
5.根据权利要求4所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于试剂盒内设有内标，内标用SIZ作为橙色荧光标记物。
6.根据权利要求4所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还包括反应混合液和热启动Taq酶，所述反应混合液组成为：MgCl2 7.5mM, Tris-HCl 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM，BSA 2g/L。
7.权利要求1~6任一所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤为：
将试剂盒内试剂与样品DNA装入PCR扩增管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃变性11min；94℃ 1min、62℃ 1min和72℃ 1min共10个循环；90℃ 1min、59℃ 1min和72℃ 1min共20个循环；60℃延伸60min；4℃保温得到扩增产物；扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析遗传分析仪检测收集的数据。
8.权利要求1~6任一所述Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒在法医个体识别、亲权鉴定、人口迁移进化研究、人口历史和家系变化研究中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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| CN106520976A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-03-22 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种扩增人y染色体str基因座的多色荧光复合扩增试剂盒及其应用 |
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Citations (1)
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Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104131072B (zh) * | 2014-05-23 | 2016-03-30 | 公安部物证鉴定中心 | 一种对未知检材进行个体识别和亲权鉴定的方法和系统 |
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| CN104164504A (zh) * | 2014-08-05 | 2014-11-26 | 广东华美众源生物科技有限公司 | 一种人类y染色体27个str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 |
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