CN105018597A - 一种人基因组dna34个基因座的复合扩增的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增试剂盒，所述复合扩增试剂盒复合扩增下列34个STR基因座：DYS456、DYS458、DYS437、DYS439、DYS392、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS390、DYS635、DYS438、DYS389I、DYS19、GATA-H4、DYS389II、DYS448、TPOX、D3S1358、D5S818、FGA、CSF1PO、D8S1179、D7S820、TH01、VWA、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、Y-indel、D2S1338、D19S433及Amelogenin。本发明将34个基因座分为5组，共涉及6种颜色的荧光标记；本发明的荧光标记符合扩增系统的灵敏度高，在DNA模板量为0.125ng的条件下，可检出全部34个基因座；适用于血滤纸、FTA卡采集样本以及提取DNA样本的直接扩增。

Description

一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术常染色体和Y染色体分型和鉴定领域，涉及一种PCR扩增试剂盒，尤其涉及一种单管同时检测人基因组常染色体及Y染色体基因座的六色荧光标记复合扩增试剂盒以及该试剂盒在司法鉴定领域中的应用。
背景技术
短串联重复序列(short tandom repeat，STR)是人类基因组中由2-6个碱基作为核心单位串联重复形成的一类具有长度多态性的DNA序列，其核心单位的数目变化和重复次数不同构成了STR的遗传多态性。STR分布广，数目多，约占人类基因组的10％，所包含的信息量巨大，不同的序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，具有极高的个体鉴定能力，所以常作为遗传标记而被用于DNA分析技术中法医个体识别、亲缘关系鉴定，同时也是DNA数据库建立的主流技术。同时，STR基因座的片段小，容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够符合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。由于这些优点STR基因座的分型研究与筛选早已在国内外人类学、医学遗传学和法医学及各相关领域中得到了广泛的应用。
人类Y染色体是小的近端着丝粒染色体，它由长臂和微小的短臂两部分组成。Y染色体，除拟常染色体区外，在减数分裂中不发生交换重组，呈单倍型独立向下传递，表现出父系遗传特征，同时序列的变异完全由累 积的突变所致，并非重组引起。由于Y染色体的这些特点，Y染色体STR基因座(Y-STR)遗传标记作为一种工具已经被广泛应用于法医鉴定、亲权鉴定、失踪人员鉴定、人类迁移进化研究、历史和家系进化研究等多个领域。已发现的Y-STR基因座已有400多个，常用来检测的Y-STR基因座有9个欧洲最小单倍型基因座，包括DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS392、DYS393和2个美国DNA分析方法技术工作组(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,简称SWGDAM)推荐的基因座，包括DYS438、DYS439。
在法医鉴定与亲子鉴定领域，DNA分析主要依赖商业化的试剂盒进行。首先是国外的试剂盒发展历程，第一个Y-STR试剂盒是由ReliaGene Technologies在2001年研发的Y-PLEXTM6，可复合扩增DYS19、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS393、DYS385a/b；2002年ReliaGene Technologies又研发了可符合扩增DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS392的Y-PLEXTM5，到2003年9月ReliaGene Technologies推出了整合了Y-PLEXTM6和Y-PLEXTM5所有基因座在内的Y-PLEXTM12。同年10月，Promega公司推出了PowerPlex Y试剂盒，可复合扩增12个基因座，其中包括DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439。2004年秋，Applied Biosystems公司(简称AB公司)发布了包含17个Y-STR基因座的yfilerTM试剂盒，其在PowerPlex Y的基础上增加了另外5个具有高度多态性的Y-STR基因座，包括DYS456、DYS458、DYS635、GATA-H4、DYS448。2012年秋，Promega公司推出了PowerPlex Y23试剂盒，在兼容了yfilerTM试剂盒的17个位点外又额外增加了6个新位点包括DYS549、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS643，进一步的提高了试剂盒的分辨率。目前PowePlex Y23试剂盒是目前市面上可复合扩增Y-STR最多的国外试剂盒。国内Y-STR试剂盒的发展相对较晚，目前主要有北京基点认知公司的Goldeneye 20Y试剂盒，可复合扩增20个Y-STR基因座，除包含yfilerTM试剂盒的17个位点外新增加了DYS460、DYS447、DYS388。此外还有江苏中德美联公司推出的AGCU Y24STR荧光检测试剂盒，包含了24个Y-STR基因座包括DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS449、 DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、DYS527a/b、GATA H4、DYS447、DYS19、DYS392、DYS522、DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b以及DYS444。
随着法医DNA分型技术的发展，目前已经能对类似血痕、精斑、唾液斑、毛发、骨骼等进行DNA分型；同时，随着PCR技术的发展，多重扩增体系可检测的基因座数量也越来越多。专利CN101144774公开了一种同时分析人基因组DNA的多个基因座的荧光标记复合扩增系统，用于检测如下21个常染色体基因座：TPOX、D3S1358、D5S818、FGA、CSF1PO、D8S1179、D7S820、TH01、VWA、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D12S391、D19S433、D1S1656、D2S1338、D6S1043、PentaE、PentaD、AMEL。该专利提供了对20个常染色体基因座和一个性别基因座的分型结果，为五色荧光检测系统。目前在法医检测中，常染色体分型与Y染色体检测一般都是分开的。最多在常染色体检测中加入了DYS391。因为DYS391多态性差，主要用于辅助性别判定。如果能同时检测常染色体基因座及多态性更高的Y染色体基因座，既能用Y染色体基因座信息用于嫌疑人的快速排查，又能根据常染色基因座信息确定嫌疑人。
发明内容
本发明针对以上技术问题，在发明CN101144774方案的基础上，选择了16个基因座AMEL、TPOX、D3S1358、D5S818、FGA、CSF1PO、D8S1179、D7S820、TH01、VWA、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D2S1338、D19S433，这样使得基因座和ABI(Applied Biosystems,USA)公司的Identifiler试剂盒基因座一样，同时加入了18个Y染色体基因座其中包含了ABI(Applied Biosystems,USA)公司的Yfiler试剂盒的17个基因座以及一个辅助性别判定的Y-indel基因座。
本发明的目的之一在于：提供一种通过复合扩增34个基因座来进行个体识别和亲子鉴定的荧光标记STR复合扩增检验系统，同时检测16个常染色体基因座、18个Y染色体基因座及一个性别基因座。涉及检测人基因座中具有多态性的遗传标记。
为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
(1)基因座的确定。在专利CN101144774的基础上，选择与ABI公司Identifiler试剂盒相同的16个基因座，通过对这些基因座进行频率调查分别计算个体识别能力(DP)、杂合度(H)、非父排除率(PE)等数据，表明在16个STR基因座中，除TH01、TPOX基因座外，其余各基因座的DP值均接近0.9，H均大于0.7，PE值大都在0.5以上，这表明它们在法医学上有较好的应用价值。保持现有的常染色STR，增加一定个数的Y-STR，对亲缘关系的鉴定，家系排查，估计可能的人群来源有巨大的作用。此外本发明同时添加了使用最广泛的Yfiler试剂盒里的17个Y基因座DYS456、DYS458、DYS437、DYS439、DYS392、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS390、DYS635、DYS438、DYS389I、DYS19、GATA-H4、DYS389II、DYS448。除DYS391之外其余基因座的基因多样性(gene diversity,GD)值均在0.6以上，DYS391为美国最新CODIS推荐的基因座。添加Y基因座的排查能力大大优于专利CN101144774。
(2)确定一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增的试剂盒。
基于以上基因座的确定，本发明还提供一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增的试剂盒，本发明所提供的试剂盒同时包含下列34个STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物：Y-indel、DYS456、DYS458、DYS437、DYS439、DYS392、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS390、DYS635、DYS438、DYS389I、DYS19、GATA-H4、DYS389II、DYS448、TPOX、
D3S1358、D5S818、FGA、CSF1PO、D8S1179、D7S820、TH01、VWA、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D2S1338、D19S433及Amelogenin。34个基因座的具体信息见表1.
表1、34个基因座的相关信息
进一步地，每对引物具有一定的引物序列，其用于扩增相应的基因座，其对应关系如表2所示：
表2、各基因座对应引物序列
作为本发明的进一步改进，采用所述引物如表2中所示，这样测出的结果中无非特异性峰。进一步地，所述的各STR基因座采用位于该基因座核心重复区两侧一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。
本发明通过对各个基因座的合理排列并优选了一系列荧光强度高的荧光染料进行标记，标记方法为：Y-indel、D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、D19S433、DYS439采用FAM标记；DYS438、DYS389I、DYS448、DYS389II、DYS19、GATA-H4、DYS458采用VIC标记；AMEL、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、D2S1338采用NED标记；DYS437、VWA、D8S1179、TPOX、FGA、DYS456采用ROX标记；DYS393、
DYS391、DYS390、DYS635、DYS392、DYS385a/b采用AF594；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为Atto 633。
本发明检测扩增产物的方法为采用多道或单道毛细管电泳遗传分析仪进行测定；本发明所测定的模板包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官，并且可以进行直接扩增滤纸、FTA卡、棉絮、口腔拭子等检材。
一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增的试剂盒，包括无核酸水、PCR Master Mix、SureID Compass Primer Mix、SureID Compass Allelic ladder混合物、内标size-500。值得一提的是本发明所采用的PCR Master  Mix经过一系列的优化实验使得本产品可以兼容市面上所有常见的检材类型包括whatman FTA卡、whatman唾液卡、血滤纸、博坤FTA卡、博坤唾液卡、头发、口腔脱落细胞、提取DNA等各种检材，这在国内甚至国外的试剂盒也尚未做到，除此之外，该种改良后的缓冲液能极大的提高扩增效率，有效缩短产物末端腺苷酰化的时间，并能够提高长片段的扩增效率，改善了产品的均衡性。其主要成分有：DMSO、Tris-buffer、氯化钾、硫酸铵等。
综上所述，本发明所提供的试剂盒的检测位点数量多于市面上国内外单纯的常染色体检测试剂盒和Y染色体检测试剂盒，从而极大的提高了系统的累积个体识别力和累积非父排除率，总体上提高个体的鉴别力。
附图说明
图1为34个基因座的荧光标记复合扩增检验系统等位基因分型标准物；
图2为男性标准品9948的分型图；
图3为扩增建库样本的分型图；
图4a为STRtyper-21G检测待检男孩分型图；
图4b为STRtyper-21G检测待检男子分型图；
图5a为SureID compass检测待检男孩分型图；
图5b为SureID compass检测待检男子分型图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
具体实施例一 基因座的确定 
在专利CN101144774的基础上，选择与ABI公司Identifiler试剂盒相同的16个基因座，通过对这些基因最进行频率调查分别计算个体识别能 力(DP)、杂合度(H)、非父排除率(PE)等数据，表明在16个STR基因座中，除TH01、TPOX基因座外，其余各基因座的DP值均接近0.9，H均大于0.7，PE值大都在0.5以上，这表明它们在法医学上有较好的应用价值。保持现有的常染色STR，增加一定个数的Y-STR，对亲缘关系的鉴定，家系排查，估计可能的人群来源有巨大的作用。此外本发明同时添加了使用最广泛的Yfiler试剂盒里的17个Y基因座DYS456、DYS458、DYS437、DYS439、DYS392、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS390、DYS635、DYS438、DYS389I、DYS19、GATA-H4、DYS389II、DYS448。除DYS391之外其余基因座的GD值均在0.6以上，DYS391为美国最新CODIS推荐的基因座。添加Y基因座的排查能力大大优于专利CN101144774。
具体实施例二 荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计
本发明对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、紫、橙六种荧光标记物，构建了6色荧光组合方案。在确定6色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，设计出基因座组合方式以及荧光标记类型。从生产成本及各基因座引物扩增效率等方面考虑，将34个基因座分成5组，使用FAM、VIC、NED、ROX、AF594分组标记，分子量内标用第5中颜色橙色的荧光染料Atto 633进行标记。经过筛选最终确定一种优选的荧光染料标记的方法为：Y-indel、D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、D19S433、DYS439采用FAM标记；DYS438、DYS389I、DYS448、DYS389II、DYS19、GATA-H4、DYS458采用VIC标记；AMEL、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、D2S1338采用NED标记；DYS437、VWA、D8S1179、TPOX、FGA、DYS456采用ROX标记；DYS393、
DYS391、DYS390、DYS635、DYS392、DYS385a/b采用AF594；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为Atto 633。这种基因座组合方式使得仅需标记六种荧光就可以实现34个基因座同时检测分析。
具体实施例三 
本发明一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增的试剂盒，该试剂盒中包括：
1)PCR Master Mix
2)SureID Compass Primer Mix
3)Control DNA 9948
4)SureID Compass Allelic Ladder等位基因分型标准品
5)Size-500橙色荧光分子量内标
6)光谱校正标准物
上述PCR Master Mix包括了：DMSO 10mM、Tris-buffer 125mM、氯化钾125mM、硫酸铵65mM等，可以实现兼容扩增市面常见各种检材。
上述SureID Compass Primer Mix包括扩增34个基因座的所有引物(浓度见表2)、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)7.5mM、Taq酶5U/μl、氯化镁7.5Mm、BSA2.5mg/ml等。
上述阳性对照品是购买的人类基因组DNA。
上述SureID Compass Allelic Ladder等位基因分型标准品是各个等位基因在一定数量人群中的分布情况。
上述Size-500橙色荧光分子量内标是一系列用于标定一定片段大小的质粒。
上述光谱校正标准物是5种不同大小片段的荧光PCR扩增产物。 
具体实施例四扩增基因座及其产物检测的实验过程
1、反应体系的配置
组分 体积
无核酸水(无RNA酶/DNA酶超纯水Dnase/Rnase Free) 补足至25.0μL
PCR Master Mix 12.5μL
SureID Compass Primer Mix 6.25μL
Control DNA 9948 1ng
Total 25μL
2、扩增热循环实验方案
1)将PCR扩增管置于热循环仪上
2)选择下面推荐的程序进行扩增
3)扩增后的样品应避光保存
步骤 温度 时间
1 95℃ 5分钟
2 94℃ 10秒钟
3 61℃ 1分钟
4 70℃ 30秒钟
5 N/A 重复2-4步骤27次(共28次)
6 60℃ 20分钟
7 4℃ 持续:直至收取PCR产物
3、扩增产物在ABI3500遗传分析仪上检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(SIZE-500)组成上样混合物(1μL SIZE-500+12μL去离子甲酰胺)X(进样数)。将9μL上样混合物与1μL扩增产物或系统中等位基因分型标准物(Allelic ladder)混合，避免产生气泡，尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。
具体实施例五检测试剂盒灵敏度、特异性分析
灵敏度分析：将阳性对照按一定拷贝数倍比稀释后，经PCR扩增和毛细管电泳检测直至检测不到信号，该拷贝数即为最低检测线，也就是试剂盒的灵敏度。最高灵敏度可检测到低至0.125ng的DNA样品。
特异性分析：本发明中34个基因座的荧光标记复合扩增检验系统检验猪、狗、羊、鸭、鸡、鼠、牛、大肠杆菌等，没有出现特异性扩增峰，表明该系统具有种属特异性。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
具体实施例六本发明所提供试剂盒在DNA数据库建设的应用
用本发明所提供试剂盒用于满足同时进行常染色体数据库和Y染色体数据库的建立，步骤如下：
1.收集公安部门建库样本：样本由某公安部门提供；
2.待检检材的处理：本案中的检材为滤纸血样，采用直接扩增，故只需使用1.2mm的打孔器进行打孔作为检测模板；
3.扩增检测：按照实施例2～5进行荧光标记、PCR扩增和遗传分析仪检测，选用同时包含34个STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对的试剂盒，分型结果见图3，结果见表3：
表3
常染色体STR基因座 基因型 Y-STR基因座 基因型
D3S1358 15/17 Y-indel 2
TH01 6/9.3 DYS439 12
D21S11 29/30 DYS438 11
D18S51 15/18 DYS389I 13
D19S433 13/14 DYS448 19
D5S818 11/13 DYS389II 31
D13S317 11 DYS19 14
D16S539 11 GATA-H4 12
CSF1PO 10/11 DYS458 18
D2S1338 23 DYS437 15
VWA 17 DYS456 17
D8S1179 12/13 DYS393 13
TPOX 8/9 DYS391 10
FGA 24/26 DYS390 24
D7S820 11 DYS635 23
    DYS392 13
    DYS385 11/14
结果显示：本发明提供的试剂盒在法医DNA数据库的建立方面可以同时满足常染色体库建立和Y染色体数据库的建立，极大的减少重复实验和数据分析，节约了时间和实验时间。
具体实施例七分别应用专利CN101144774中公开的基因座复合扩增试剂盒(STRtyper-21G试剂盒)及本发明所提供试剂盒(Sure ID compass试剂盒)进行单亲亲子鉴定
1.收集亲子鉴定案件中的血样：本实验中样品由宁波市局提供为一对 父子，进行单亲亲子鉴定；
2.待检检材的处理：本案中的检材为滤纸血样，采用直接扩增，故只需使用1.2mm的打孔器进行打孔作为检测模板；
3.结论：分别应用STRtyper-21G及Sure ID compass荧光标记复合扩增检测系统对本案中单亲父子进行亲子鉴定，其中使用STRtyper-21G复合扩增系统有2个常染色体基因座vWA、D12S391分型不符合遗传规律，使用Sure ID compass复合扩增系统除1个常染色体基因座vWA分型不符合遗传规律外还有3个Y基因座DYS456、DYS458、DYS635分型不符合遗传规律。检测图谱见图4a、图4b、图5a、图5b。根据司法鉴定技术规范(SF/Z JD0105001-2010)有3个以上的基因座不符合遗传规律，可以排除亲权关系的存在，故STRtyper-21G荧光检测试剂盒不能认定或排除父子关系。SureID Compass结果显示(见表4)被检父与某男孩在检测的16个常染色体基因座只有1个基因座不符合遗传规律。男孩与被检父在DYS456、DYS458、DYS635三个Y基因座上不符合遗传规律，根据司法鉴定技术规范(SF/Z JD0105001-2010)有3个以上的基因座不符合遗传规律，可以排除亲权关系的存在。本发明较CN101144774，常染色体基因座数目已经够用，较多的Y染色体基因座大大提高了分辨率和排除率，在单亲亲子鉴定中体现出巨大的优越性。单亲父子关系鉴定，要求检测常染色体基因座及Y染色体基因座，目前的做法是检测一个常染色体基因座检测试剂盒和一个Y染色体基因座检测试剂盒。本实施例中，根据21个常染色体基因座检测结果，无法认定或排除父子关系；而增加的Y基因座最终排除了两者的父子关系。通过本发明方案，将从前需要两个试剂盒，常染色体基因座检测试剂盒和Y染色体基因座检测试剂盒，整合成一个试剂盒，只需一次PCR扩增、电泳检测就能得到更多的信息。亲子检测试剂盒的检测结果如表4所示。
表4
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述复合扩增试剂盒复合扩增下列34个STR基因座：DYS456、DYS458、DYS437、DYS439、DYS392、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS390、DYS635、DYS438、DYS389I、DYS19、GATA-H4、DYS389II、DYS448、TPOX、D3S1358、D5S818、FGA、CSF1PO、D8S1179、D7S820、TH01、VWA、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、Y-indel、D2S1338、D19S433及Amelogenin。
2.如权利要求1所述的一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述34个STR基因座采用特异性寡核苷酸扩增引物对复合扩增；其中每对所述引物具有一定的引物序列，对应关系为：
3.根据权利要求2所述的一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的各STR基因座采用位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端用荧光染料标记，其中蓝色荧光染料FAM、绿色荧光染料VIC、黄色荧光染料NED、红色荧光染料ROX，紫色荧光染料AF594，内标选用橙色荧光Atto 633。
4.根据权利要求3所述的一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于：Y-indel、D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、D19S433、DYS439采用FAM标记；DYS438、DYS389I、DYS448、DYS389II、DYS19、GATA-H4、DYS458采用VIC标记；AMEL、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、D2S1338采用NED标记；DYS437、VWA、D8S1179、TPOX、FGA、DYS456采用ROX标记；DYS393、DYS391、DYS390、DYS635、DYS392、DYS385a/b采用AF594；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为Atto 633。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种人基因组DNA34个基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下组分：无核酸水、PCR缓冲液、SureID Compass Primer Mix和人基因组阳性对照；
其中所述无核酸酶水是指无RNA酶和DNA酶的超纯水；
所述的PCR缓冲液包括了DMSO 10mM、Tris-buffer 125mM、氯化钾125mM、硫酸铵65mM；
所述SureID Compass Primer Mix包括同时扩增34个基因座的所有引物、三磷酸脱氧核苷酸7.5mM、Taq酶5U/μl、氯化镁7.5Mm、BSA2.5mg/ml；所述SureID Compass Primer Mix中各引物浓度见下表所示：
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