CN103614361A

CN103614361A - 一种人基因组dna24个基因座的复合扩增的试剂盒

Info

Publication number: CN103614361A
Application number: CN201310364183.0A
Authority: CN
Inventors: 郑卫国; 李发院; 葛斌文; 卢青; 刘超; 刘宏; 李越
Original assignee: GUANGZHOU CITY FORENSIC SCIENCE TECHNOLOGY INSTITUTE; Wuxi Agcu Scientech Inc
Current assignee: GUANGZHOU CITY FORENSIC SCIENCE TECHNOLOGY INSTITUTE; Wuxi Agcu Scientech Inc
Priority date: 2013-08-20
Filing date: 2013-08-20
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-08-20
Also published as: CN103614361B

Abstract

本发明涉及一种同时分析人基因组DNA24个基因座的五色荧光标记复合扩增系统，同时检测19个常染色体基因座，4个Y染色体基因座及一个性别鉴定基因座；本发明将24个基因座分为4组，共涉及5种颜色的荧光标记；本发明的荧光标记复合扩增系统的灵敏度高，在DNA模板量为0.12ng的条件下，可检出全部24个基因座；适用于血滤纸、FTA卡采集样本的直接扩增。

Description

一种人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统，具体是涉及一种同时分析人基因组常染色体及Y染色体基因座的五色荧光标记复合扩增系统，该系统可以应用于个体识别和亲子鉴定。

背景技术

短串联重复序列基因座（STR）是目前普遍应用的遗传标记。90年代初STR基因座多态性的发现，特别是STR基因座具有片段小容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。因此美国FBI选择了13个STR基因座用于建立DNA数据库—CODIS（Combined DNA Index System）：CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA。这些STR基因座通常被称为13个核心基因座。

长期的DNA检验实践表明，短串联重复序列基因座的遗传多态性在种族间存在一定的差异，各个基因座间差别也很大。随着DNA数据库的建设，13个基因座数量不够。我国的打拐DNA数据库要求要有18个常染色体基因座。2012年美国核心基因座工作组（The CODISCore Loci Working Group）也建议美国FBI把检测基因座增加到25个，并且增加了一个DYS391。在法医检测中，通常用Amelogenin基因指示性别。这个基因在X、Y染色体上，并且Amelogenin-X上比Amelogenin-Y大6bp，根据扩增出峰来判定性别，单峰为女性，双峰为男性。但是存在男性Amelogenin-Y缺失的情况，会造成男性误判成女性。所以增加了DYS391用于辅助判定性别。

常染色体遗传标记，例如13个核心STR基因座，在每一子代进行重新组合，这是因为一个个体的遗传信息一半来自他/她的父亲而另一半来自他/她的母亲。Y染色体遗传标记则是父系遗传，适用于快速排查嫌疑人。

目前，在法医检测中，常染色体分型与Y染色体检测一般都是分开的。最多在常染色体检测中加入了DYS391。因为DYS391多态性差，主要用于辅助性别判定。如果能同时检测常染色体基因座及多态性更高的Y染色体基因座，既能用Y染色体基因座信息于嫌疑人的快速排查，又能根据常染色体基因座信息确定嫌疑人。

发明内容

发明CN201110229325.3提供了一个同时扩增21个常染色体基因座及一个性别基因座的方案。本发明在201110229325.3方案基础上，删除了D2S441、D10S1248，增加了4个Y染色体基因座：3个多态性高的基因座DYS635，DYS458，DYS456及一个多态性较差DYS391、一个性别基因座，构成了一个24个基因座的复合扩增体系。同时满足常规法医检测及嫌疑人的快速排查。

本发明的目的之一在于：提供一种通过复合扩增24个基因座来进行个体识别和亲子鉴定的荧光标记STR复合扩增检验系统，同时检测19个常染色体基因座、4个Y染色体基因座及一个性别基因座。涉及检测人基因组中具有多态性的遗传标记。本发明特别涉及用聚合酶链式反应在一个体系中同时扩增多个短串联重复基因座。

为了实现本发明的目的，采用如下技术方案：

一种人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒，包括有如下24个基因座的引物：

D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、DYS635、DYS458、DYS456、DYS391及Amelogenin。

上述24个基因座的引物及引物浓度优选如下：

表1各个基因座的引物及浓度

进一步地，对于上述每个基因座对应的引物中，至少有一个引物的5’端最好是经过标记的，就可以用来对引物的扩增产物进行检测，标记的方式较多，可以采用化学，放射性，荧光，发光和荧光共振能量转移的标记等，最好是采用荧光标记。更优的是每个基因座对应的引物中，都有一个引物的5’端是经过标记的。

进一步地，上述的24个基因座可以进行分组标记，最好是这样分组：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、Penta E和DYS635为第一组；DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D和DYS458为第二组；DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043为第三组；D8S1179、D5S818、D12S391、FGA以及性别基因座Amelogenin为第四组。

以上各组的基因座的引物最好是通过6-FAM、HEX、TEMRA和ROX中的任意一种进行荧光染色，而且各组之间的标记色都不相同，这样四种荧光组合就可以实现这24个基因座的同时检测分析。

该试剂盒还最好设有内标，其选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。

该试剂盒中最好还设有男性对照标准品9948（Promega公司美国）。

上述的试剂盒还可以包括有如下组分：

表2试剂盒组成

组分	体积
		Reaction Mix	10.0μL
基因组DNA	0.1～10μl含量为0.125～5ng
		权利要求1所述的引物	5.0μL
热启动Taq酶（5U/μL）	0.5μL
		sdH₂O	补足至25.0μL

其中所述的Reaction Mix为MgCl₂7.5mM，Tris-HCl buffer125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2mg/ml。

上述试剂盒的PCR扩增热循环方法可以是：

（l）将PCR扩增管置于热循环仪上；

（2）选择表3推荐的程序进行扩增；

（3）扩增后的样品应避光保存；

表3热循环仪的扩增程序

上述的扩增产物在遗传分析仪上荧光检测的步骤可以是：

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500(制备方法见专利CN101307226)组成上样混合物〔（0.5μl AGCU Marker SIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司））×（进样数）＋（12μl去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准物Allelic Ladder（无锡中德美联生物技术有限公司）混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；

对上述的分型结果进行分析的步骤是：

用片段分析软件GeneMapper分析遗传分析仪检测收集的数据。

电泳采用多道或单道毛细管电泳。

其中基因组DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、血痕或血液。

具体解释

一、基因座的确定

在专利CN201110229325.3基础上，删除了扩增片段较大D2S441和D10S1045基因座，其余常色体基因座对5000多名个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率计算个体识别能力（DP）、杂合度（H）、非父排除率（PE）等数据，表明在20个STR基因座中，除TH01、TPOX基因座外，其余各基因座的DP值均接近0.9，H均大于0.7，PE值大都在0.5以上，这表明它们在法医学上有较好的应用价值。保持现有的常染色体STR，增加一定个数的Y-STR，对亲缘关系的鉴定，家系排查，估计可能的人群来源有巨大的作用。

从使用最广泛的17个Y基因座中（DYS19，DYS389I，DYS389II，DYS390，DYS391，DYS392，DYS393，DYS385a，DYS385b，DYS438，DYS439，DYS437，DYS448，DYS456，DYS458，DYS635及Y GATA H4)选择多态性较高，基因座等位基因范围较小的基因座。最终选择了DYS635，DYS456及DYS458等GD值在0.7以上的3个基因座，加上美国最新CODIS推荐的DYS391基因座。

二、荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计

在专利CN201110229325.3基础上，删除了FAM色的D2S441，在原有位置上添加DYS635，删除了HEX色的D10S1045，在该位置上添加DYS458，同时在HEX，TAMRA100bp左右位置添加DYS456，DYS391。反复设计DYS635，DYS456及DYS458基因座引物，根据大小加入了201110229325.3方案。

三、荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立

1、基因座之间平衡度的调配

为与CN201110229325.3原有体系兼容，反复修改新加引物，调整引物的浓度，做到不影响之前体系的均衡性，新增基因座也不出现非特异，尤其是新增的基因座对女性样本无扩增，对10ng，50ng，100ng女性样本DNA为模板反复试验，做到Y基因座的引物对女性样本无扩增。由于DYS456与X染色体同源性较高，难以找到对女性样本无扩增的合适的引物位点，采用对基因组数据库的比对，找到特异的位点设计引物，使其对女性样本无扩增；DYS635的扩增片段较大，容易受到扩增抑制剂的影响，使其在提取模板和血滤纸模板扩增条件下，难以实现均衡性，需要通过大量反复实验，找到合适的位点。

另外，在设计引物时，还需要通过反复试验，保证引物的长度适中，具有相似的物理特性和反应动力学特点、Tm值相近、GC含量、引物之间不能形成二聚体；另外，由于扩增体系中基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，需要进行大量反复试验，调节引物浓度和配比，最终达到平衡。同时也要保证引物扩增的特异性，有些基因座之间的同源性比较高，所以在引物设计上，我们要考虑到其特异性，Y引物要保证女性样本无扩增；同时我们也要考虑到复合扩增中，引物对不同扩增检材的适用性，保证不同检材扩增时，都要满足试剂盒均衡性要求。

2、复合扩增条件的建立

在专利201110229325.3基础上，逐个加入Y基因座，每加入一个检测对女性样本的扩增特异性及男性样本的扩增均衡性。当加入DYS456引物的时候，发现其扩增女性样本DNA时也会出现扩增峰，导致分型错误，引物序列，模板序列比对发现，该基因座与X染色体基因同源相似性比较高，容易造成女性样本的非特异扩增，经过反复尝试，最终找到了该基因座的特异性位点，最终确定了基因座排布，组成了复合扩增体系。

有益效果

1、本发明所采用实现了一管同时做常染色体分析及Y染色体分析，可同时用于案件的快速排查，提高了检测效率；

2.由于Y染色体特殊的父系遗传，使得Y染色体STR具更高的排除率，用于父-子亲子鉴定检测可以不用单独再做Y STR分析；

3、本发明还涉及一种采用该荧光标记复合扩增检验系统对DNA样品进行分析的方法；其中，本发明适用的DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、血痕或血液等；

4、本发明可以检测出大量女性DNA样本中混有的微量男性DNA，对于混合斑的检测，成效显著。

附图说明

图1：对标准品9948样品的STR分型结果；

图2：等位基因分型标准物；

图3，图4：一个亲子鉴定排除的案例；其中图3是代表被检父，图4是代表男孩；

图5：大量混合女性样本中微量男性DNA的检测；

图6：DYS456基因座女性样本非特异扩增；

图7：DYS635因座女性样本非特异扩增。

具体实施方式

实施例1

一种同时分析人基因组DNA24个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，由如下组成：

表4试剂盒组成

组分	体积
		Reaction Mix	100μL
基因组DNA（9948Promega USA）	0.1～10μl含量为0.125～5ng
		如上的24个基因座对应的引物	5.0μL
热启动Taq酶（5U/μL）	0.5μL
		sdH₂O	补足至25.0μL

其中24个基因座对应的引物及其引物浓度如表1所示。

将所述24个基因座分组，具体为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、Penta E和DYS635为第一组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为6-FAM、HEX、TEMRA和ROX的任意一种；DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D和DYS458为第二组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组不同的荧光染料标记物；DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043为第三组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组和第二组都不同的荧光染料标记物；D8S1179、D5S818、D12S391、FGA，以及性别基因座Amelogenin为第四组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为与第一组、第二组和第三组都不同的荧光染料标记物；该试剂盒还设有内标，其选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。

扩增热循环的程序如下：

（l）将PCR扩增管置于热循环仪上；

（2）选择下面推荐的程序进行扩增；

（3）扩增后的样品应避光保存；

表5热循环仪的扩增程序

扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔（0.5μlAGCU Marker SIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司））×（进样数）＋（12μl去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准物EX22Allelic Ladder（无锡中德美联生物技术有限公司）混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；

分型分析

用片段分析软件GeneMapper分析步骤3中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和EX22Allelic Ladder（见附图2）比较，得到实际样品的分型数据，等位基因分型标准物结果见附图2。

对标准品9948（Promega公司美国）进行扩增，分型结果如图1所示。选用的标准品9948是公知标准DNA，其序列已知，可以用其去验证本试剂盒检测结果的正确性，通过分型比较获知，本试剂盒获得数据与已知信息一致。且标准品DNA含量也是已知的，也能检测试剂盒的灵敏度。

对照例

采用如下表所示的引物，对采集的女性的DNA样本进行扩增，扩增程序同实施例1。扩增后结果如图6所示。

表6对照例中使用的DYS456基因座的引物

从图6中可以看出，DYS456基因座对应的位置出现了非特异扩增峰，说明对照例中的引物会导致结果的误判。这主要是由于DYS456与X染色体同源性较高，对女性样本进行检测时，会出现误扩增的情况。

依同法，采用表7中DYS635的引物，扩增程序同实施例1，也会造成女性样本的非特异扩增峰。扩增结果如图7所示。图中可以看出，DYS635基因座在女性样本中，出来了扩增峰，是该基因座引物在基因组中的非特异扩增峰。用DYS635的序列在NCBI数据库中BLAST发现，其与很多常染色体以及X染色体的同源性较高，导致该基因座引物设计时，较难找到合适的扩增位点，多次设计，重复实验验证，才找到该位点的特异引物。

表7对照例中使用的DYS635基因座的引物

实施例2

应用24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统进行单亲亲子鉴定

1、收集亲子鉴定案件中的血样：本实验中样品由XX亲子鉴定机构提供。DNA提取采用Chelex-100法分别提取2个全血样本的基因组DNA：取0.5～5μl全血置于灭菌的1.5ml离心管中，加入sdH₂O1ml于管中，振荡数秒；置于室温10分钟后，振荡数秒，12000rpm离心3分钟，弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀；加入200μl5%的Chelex-100，振荡数秒；于56℃保温30分钟，振荡数秒；沸水浴10分钟，振荡数秒；12，000rpm离心5分钟，上清为提取得到的基因组DNA。基因组DNA的提取参考《GA/T383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。也可以直接以血样检测，通过1.2mm孔径血滤纸片或FTA卡血样片实行。

2、扩增检测

按照实施例1进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果。

3、结论

检测图谱见图3～4，结果显示（见表8），被检父与某男孩在检测的18个常染色体基因座中，17个均符合遗传规律，1个常染色体基因座不符合，计算得累计亲权指数CPI为1222.917。男孩与被检父在DYS456、DYS458、DYS391三个Y基因座上不符合遗传规律，再加上1个常染色体结果不符合，共有4个基因座不符合遗传规律。根据司法鉴定技术规范（SF/Z JD0105001-2010）有3个以上的基因座不符合遗传规律，可以排除亲权关系的存在。单亲父子关系鉴定，要求检测常染色体基因座及Y染色体基因座，目前的做法是检测一个常染色体基因座检测试剂盒和一个Y染色体基因座检测试剂盒。本实施例中，根据18个常染色体基因座检测结果，无法认定或排除父子关系；而增加的Y基因座最终排除了两者的父子关系。通过本发明方案，将从前需要两个试剂盒，常染色体基因座检测试剂盒和Y染色体基因座检测试剂盒，整合成一个试剂盒，只需一次PCR扩增、电泳检测就能得到更多的信息。

表8亲子鉴定的检测结果

实施例3

应用24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统中四个Y基因座进行案件排查

1、收集案件排查中的不同检材：本实验中样品由广州市局提供。500份不同的生物检材包括180份血样，140份精斑、140份唾液斑、40份组织。基因组DNA的提取参考《GA/T383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。

2、扩增检测

3、结论

结果显示（见表9），不同来源的200份样本测试结果表明，新加入的四个Y可以把该200份检材分为114种单倍型；随机取300份样本可以分为146种单倍型；随机取400份样本可以分为174种单倍型；随机取500份样本可以分为188种单倍型。与AB公司的Y-filer试剂盒16Y(DYS389I，DYS389II，DYS390，DYS456，DYS19，DYS385，DYS458，DYS437，DYS438，DYS448，GATA_H4，DYS391，DYS392，DYS393，DYS439，DYS635)在样本数量小的情况下，作用效果差别不大，因此加入四个Y基因座对一定范围的案件排查具有巨大作用。同时该试剂盒可以一次性单管扩增19个常染色体基因座，具有较高的个体识别能力，结合四个Y的排查力，对于案件的侦破起到巨大的作用。

表9500人份模板4Y分型结果统计

	200	300	400	500
					4Y	114	146	174	188
16Y	200	300	400	500

实施例4

应用24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统对男女混合斑进行检测

1、采用9947A（女性样本），9948（男性样本）标准品，均购至美国Promega公司，模拟不同比例的男女混合斑作为扩增模板：本实验中扩增模板由中德美联研发实验室自主配置。混合斑样本9947A和9948的总量为0.5ng，PCR扩增体系为25ul体系，比例分别为1：1、1：2、1：4、1：8、1：10、1：15、1：20、2：1、4：1、8：1、10：1、15：1、20：1。

2、扩增检测

3、结论

结果显示（图5），不同比例的男女混合样本扩增结果表明，在9948:9947A=1:20的情况下，仍然可以检测出加入的4个Y的分型，由于女性样本含量较高，女性样本常染色体基因座等位基因扩增峰较高，掩盖了男性样本中常染色体的分型，系统不能读出，因此该系统对于检测大量女性样本中混有的微量男性DNA很灵敏，对于混合斑的检测有巨大作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 无锡中德美联生物技术有限公司

广州市刑事科学技术研究所

<120> 一种人基因组DNA 24个基因座的复合扩增的试剂盒

<130>

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaaatcaac agaggcttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccaatctgg gtgacagagc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttctttagtg ggcatccgtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acttgggttg agccataggc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacatttatc ctcattgaca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggctgacta tggagttatt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctgagtctgc caaggactag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccagcctcca ggttcccacc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agattgaagt gagccgagat 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aagtgttaaa ggggatcagg 20

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caagattgtg ccactgtatt tcag 24

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtgtgcgtgt ctgtatgtat atgaa 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttcaatcata cacccatatc tgtc 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggtaggcagg cagataggc 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cactagcacc cagaaccgtc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cttctgtcct tgtcagcgtt 20

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<212> DNA

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caggctctag cagcagctca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gggcttccga gtgcaggtca 20

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tattcagtaa gttaaaggat tgcagga 27

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tggagtggag gtgcctaaag ac 22

<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cacttcgtgg tggtcagg 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aacccacatg gtgccaga 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tggaaggtcg aagctgaagt 20

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ctcttagcct gtggcgtgtc 20

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgggaccttg tgataatgta agatag 26

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

agagggacag aactaatgga atatc 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gagaaattca agacaagcca gatta 25

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tagctggggc tagaggttcc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gaaggaaaga aggtaggaag 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cagtgatttc tgatattttg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tatgtgactt ggattgatct 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gatagataca aaggatagat 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ctgttatggg acttttctca 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tgtattagtc aatgttctcc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acccgactac cagcaacaac 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttcttgagcc cagaaggtta 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ttctcctgct cttgaacata 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tgtttccttt catacagaat 20

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ccctgggctc tgtaaagaat agtg 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tagtctcgaa tttgaccctt cgac 24

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

cattcgtatc tatctgtcta 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

catcactgta tcgtatccca 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

caagtatgtg acaagggtga 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ctcagaggaa tgctttagtg 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tcaacaggat caatggatgc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

accatcagtt tccctggttt 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

atcttaactg gcattcatgg 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gttgtaggta ttatcacggt 20

Claims

1.一种人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒，包括有如下24个基因座的引物：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、DYS635、DYS458、DYS456、DYS391及Amelogenin。

2.根据权利要求1所述的人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒，其特征在于：所述的各个基因座的引物是：

D3S1358，SEQ NO.1～2；D13S317，SEQ NO.3～4；D7S820，SEQ NO.5～6；D16S539，SEQNO.7～8；Penta E，SEQ NO.9～10；DYS635，SEQ NO.11～12；DYS391，SEQ NO.13～14；TPOX，SEQ NO.15～16；TH01，SEQ NO.17～18；D2S1338，SEQ NO.19～20；CSF1PO，SEQ NO.21～22；Penta D，SEQ NO.23～24；DYS456，SEQ NO.25～26；DYS458，SEQ NO.27～28；D19S433，SEQ NO.29～30；vWA，SEQ NO.31～32；D21S11，SEQ NO.33～34；D18S51，SEQ NO.35～36；D6S1043，SEQ NO.37～38；Amelogenin，SEQ NO.39～40；D8S1179，SEQNO.41～42；D5S818，SEQ NO.43～44；D12S391，SEQ NO.45～46；FGA，SEQ NO.47～48。

3.根据权利要求1所述的人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒，其特征在于：所述的各个基因座的引物浓度是：

SEQ NO. 浓度 SEQ NO. 浓度 SEQ NO. 浓度 SEQ NO. 浓度 1 0.49μM 13 0.45μM 25 1.10μM 37 5.05μM 2 0.49μM 14 0.45μM 26 1.10μM 38 5.05μM 3 0.51μM 15 1.00μM 27 0.35μM 39 0.45μM 4 0.51μM 16 1.00μM 28 0.35μM 40 0.45μM 5 0.61μM 17 1.25μM 29 1.15μM 41 2.65μM 6 0.61μM 18 1.25μM 30 1.15μM 42 2.65μM 7 0.53μM 19 2.30μM 31 3.05μM 43 3.25μM 8 0.53μM 20 2.30μM 32 3.05μM 44 3.25μM 9 0.52μM 21 1.45μM 33 2.75μM 45 7.05μM 10 0.52μM 22 1.45μM 34 2.75μM 46 7.05μM 11 0.70μM 23 0.85μM 35 3.25μM 47 5.50μM 12 0.70μM 24 0.85μM 36 3.25μM 48 5.50μM

4.根据权利要求1所述的人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒，其特征在于：所述的每个基因座对应的引物中，至少有一个引物的5’端是经过荧光标记的。

5.根据权利要求4所述的人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒，其特征在于：24个基因座进行分组标记，D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、Penta E和DYS635为第一组；DYS456、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D和DYS458为第二组；DYS391、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043为第三组；D8S1179、D5S818、D12S391、FGA以及性别基因座Amelogenin为第四组。

6.根据权利要求5所述的人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒，其特征在于：每组使用6-FAM、HEX、TEMRA或ROX中的任一种进行标记，而且各组之间的标记色都不相同。

7.一种根据权利要求1～6任一项所述的人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒，其特征在于：还包括有反应混合物、热启动Taq酶、sdH₂O；所述的反应混合物中包括有：MgCl₂7.5mM，Tris-HCl buffer125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2mg/ml。

8.根据权利要求1～6任一项所述的人基因组DNA24个基因座的复合扩增的试剂盒在个体识别或亲子鉴定中的应用。