CN107841567A - 28个短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，涉及28个短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用，该复合扩增体系中包括28对引物，可同时扩增28个位点，公开了针对28个位点的引物序列。本发明通过对STR基因座的遗传多样性研究，选择的28个位点包含22个新的CODIS位点，4个个体识别力较高的位点（D4S2366、D6S1043、D11S2368、D14S608）和一个性别识别位点Amel，一个Y染色体插入缺失位点Y‑indel。这些位点具有较高的个体识别力、非父排除率和多态信息量高等特征，使得亲子鉴定及个体的识别的系统效能可以达到一个较高的级别。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及人类常染色体28个短串联重复序列复合扩增体系，该体系具体涉及利用常染色体上具有多态性的遗传标记、通过聚合酶链式反应进行复合扩增的荧光检测试剂盒，该体系可以对人类常染色体进行快速准确的STR分型判断，进而为法医个体识别和亲子鉴定提供判断依据。
背景技术
人类基因组STR(短串联重复序列)是以几个碱基为核心单位串联重复形成的DNA遗传中较稳定存在的序列。不同种族、不同人群甚至不同个体之间的区分是通过核心单位序列和重复数的差异，这也构成了STR的遗传多态性。在基因组中,平均每15～20kb就有一个STR位点,占基因组的10％，多存在于非编码区及内含子中，重复单位为2～6bp，重复次数10～60次,片段大小在70～500bp,并按孟德尔规律呈共显性遗传。因此STR复合扩增检测技术可以广泛应用于法医个体识别、亲子鉴定等领域。
自本世纪80年代中期以来,短串联重复序列(Short Tandem Repeats,STR)检验已经成为法庭科学鉴定中最常用、发展最成熟的技术,已被广泛地应用于各类案件检验。STR数据成为各国法庭科学数据库的主要构成，以便对犯罪嫌疑人进行对比和排查。目前所采用的试剂盒大多数是以美国FBI选择的13个CODIS(Combined DNA Index System)：CSF1PO,FGA,TH01,TPOX,vWA,D3S1358,D5S818,D7S820,D8S1179,D13S317,D16S539,D18S51,D21S11，但是在某些鉴定中，需要更多的基因座提供更多的信息量，以避免在一些案件中可能发生的误判。
另外现在市面上所售商品试剂盒的设计与所使用的遗传分析仪是相适应的，由于现在常用的遗传分析仪采用毛细管电泳、五色荧光激发采集信号达到检测的目的，所以选用的引物荧光标记主要是五色荧光标记检测系统。但是随着相应的工业及软件技术的革新，六色荧光激发采集系统与毛细管电泳的结合，催生相应的STR分型检测试剂盒的升级换代。同时由于同一检测系统荧光标记的增加使得可以同步检测的STR数目增加，这就弥补了五色荧光标记系统STR位点数目不能满足的缺陷。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供一种28个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒和应用，具有六色荧光标记，灵敏度极高，在低浓度DNA为模板时均可检测获得完整的基因分型图谱。本发明所采用的位点组合比常规的五色荧光标记扩增系统的位点数目多，且这些位点具有极高的个体识别率和非父排除率，可用于法医个体识别、亲子鉴定以及群体遗传学分析，位点多，准确性更高，灵敏性更好。
为了实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案：短串联重复序列的复合扩增体系，该复合扩增体系中包括28对引物，可同时扩增26个STR位点：D1S1656、D2S441、D2S1338、D3S1358、D4S2366、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D10S1248、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D22S1045、CSF1PO、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX、vWA、D11S2368、D14S608及Amelogenin，Y-indel。
所述引物以及对应的引物浓度分别为(表1)：
表1：复合扩增体系各基因座引物序列及浓度比例
所述扩增体系中的被扩增位点分别由五种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为同一组，五组组合分别为：
FAM：TH01、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043；
HEX：Y-Indel、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D；
TAMRA：D2S441、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E；
ROX：D19S433、D22S1045、D2S1338、FGA；
PURPLE：D4S2366、D12S391、D1S1656、D10S1248、D11S2368、D14S608；
六组组荧光标记分别为FAM、HEX、TAMRA、ROX、PURP和ORG。
所述第一组的标记为FAM标记，第二组的标记为HEX标记，第三组的标记为TAMRA标记，第四组的标记为ROX标记,第五组的标记为PURP标记。该复合扩增体系检测用的内标采用橙色荧光素标记物ORG标记，为第六组荧光标记。
所述扩增体系还包括PCR Master Mix、模板DNA。
所述PCR Master Mix成分包括：10mM的硫酸铵，10mM的氯化钾，55mM的pH 8.3的Tris-HCl，2mM的镁离子,0.8ug/ul的BSA，5％的DMSO,8％的乙二醇，1mM的Na4P2O7和0.2mM的Dntp，以及2U的Taq酶。可在-20℃温度下不冻，防止使用时反复冻融。
所述的复合扩增体系的扩增程序是：第一步变性：95℃，5分钟；热循环：94℃20秒；，60℃120秒，共进行27个循环；终延伸60℃，10分钟；保温：15℃。本发明的扩增产物需经过毛细管电泳，从而进行片段分析。
上述扩增体系或试剂盒可在个体识别、亲子鉴定以及公安局建库中应用。
本发明所涉及的复合扩增体系中使用的反应缓冲液(5*Master Mix S)具有特殊的配方(表2)
表2：反应缓冲液(5*Master Mix S)配方
| 成分 | 单位 | 缓冲液中的浓度 |
| KCl | M | 0.01 |
| MgCl2 | M | 0.002 |
| Tris-HCl | M | 0.055 |
| BSA | mg/ml | 0.8 |
| dNTP | mM | 0.2 |
| (NH4)2SO4 | mM | 0.01 |
| DMSO | ％ | 5 |
| 乙二醇 | ％ | 8 |
| Na4P2O7 | mM | 1 |
| Taq酶 | U | 2 |
本发明所涉及的复合扩增体系使用的PCR扩增程序(表3)。
表3：本发明复合扩增体系的扩增程序
本发明所涉及到的DNA样品可来源于人的血液、血痕、精液、精斑、唾液、体液、毛发、肌肉、组织、指甲等。所述DNA样品可用试剂盒法、酚氯仿抽提法、Chelex-100法、磁珠法进行DNA提取处理。
本发明的扩增产物可用ABI系列的遗传分析仪进行检测。检测结果可以在Genemapper等数据分析软件上分析，得到相应的STR分型图谱及数据。
总之，本发明具有如下优点：本发明通过对STR基因座的遗传多样性研究，选择的28个位点包含22个新的CODIS位点(CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、Penta D、Penta E、D1S1656、D2S441、D2S1338、D10S1248、D12S391、D19S433、D22S1045)，4个个体识别力较高的位点(D4S2366、D6S1043、D11S2368、D14S608)和一个性别识别位点Amel，一个Y染色体插入缺失位点Y-indel。这些位点具有较高的个体识别力、非父排除率和多态信息量高等特征，使得亲子鉴定及个体的识别的系统效能可以达到一个较高的级别；
本发明所涉及的复合扩增体系中使用的反应缓冲液(5*Master Mix S)具有特殊的配方，-20℃不冻，且PCR扩增程序用时较短，扩增效率较高。本发明所涉及到的DNA样品可来源于人的血液、血痕、精液、精斑、唾液、体液、毛发、肌肉、组织、指甲等，DNA取材广泛。
本发明所涉及的26个染色体STR位点(除去Amel以及Y-indel位点)比现在市场上五色荧光标记的STR试剂盒位点数量多。在亲子鉴定业务中，案例比例最多的为二联体亲子鉴定(父子)，该鉴定最常见的结果是亲生(符合遗传定律和有一个基因座不符合遗传定律)和非亲生(常规试剂盒一般都能满足需求)。司法部颁布的规范中，“父权指数大于10000即肯定亲生关系”存在一定的疏漏，给地方司法鉴定所以误导。早期中山大学伍新尧教授等人制订的规则较为全面，其中指出“在二联体鉴定中，如有1个STR基因座不符合遗传定律，须增加数量至26个”。
本发明能够更好的满足公安、司法机关对于检测系统效能的要求，并且随着遗传分析的革新换代，六色荧光标记试剂盒的应用及开发也是势在必行的。本发明对中国汉族人群2313个样本进行统计，计算得出相关的法医学数据，证明本发明所选择的位点具有较高的多态性信息、个体识别率比较高。本发明所采用的26个常染色体STR的遗传数据统计结果(表4)。
表4 本发明所采用的26个位点的遗传数据统计结果
其中HET：Heterozygotie的缩写，杂合度，用来衡量基因的多态性；DP：Power ofDiscrimination的缩写，个人识别能力；PE，probability exclusion的缩写，非父排除率，用来排除鉴定亲生关系的比例；PIC：Polymorphism information content的缩写，多态性信息含量。
附图说明
图1为利用本发明的扩增体系获得的扩增图谱。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
目前市面上所售的六色荧光标记的常染色体STR检测试剂盒只有两款，专利方面还是空白，而现有的检测试剂盒，无法同时检测更多的位点，鉴别能力有待提高。具体信息如下(表5)：
表5：市面上商品化的六色荧光标记试剂盒基因座位点信息与本发明基因座位点对比
具体实施例
实施例1利用28个短串联重复序列的复合扩增体系获得个体STR分型
1.血液样本的采集(血液样本由志愿者捐赠)
2.DNA提取
采用Chelex-100法提取基因组DNA(参考《Forensic DNA Protocol》.HumanaPress,1998)取0.5-5μl的抗凝全血或(1-3mm)*(2-5mm)的血斑至于500μl离心管中，振荡混匀Chelex溶液使Chelex充分悬浮，每管加入195μl Chelex-100(5％)溶液和5μl蛋白酶K(20mg/ml)振荡混匀，56摄氏度保温两小时或者过夜后，取出振荡2分钟，沸水中加热10分钟后13000rpm离心5分钟，小心移取150μl上清至新离心管中。
3.反应体系
将各反应试剂(缓冲液、引物混合物、基因组DNA等)振荡混合后按以下方式配成PCR反应混合液，扩增体系总体积为25μl，包括引物混合物(5*Primer mix)5μl，其中引物浓度见表1(取表1中引物浓度范围的中间值)，反应缓冲液(5*Master Mix S)5μl(成分见表2)，基因组DNA 2μl(提取模板DNA，直扩检材等)，ddH2O 13μl。
4.PCR反应程序
本发明所涉及的复合扩增体系使用的PCR扩增程序(表6)。
表6本发明复合扩增体系的扩增程序
5.毛细管电泳检测
将Orange500内标和甲酰胺按比例2.5:100混合，取12.5μl混合物加入到96孔板，再加入扩增产物样品或者是等位基因标准物1μl，混合静置数分钟，95℃变性3min，立即冰浴3min，离心后放入ABI3500测序仪上，准备检测。
6.数据分析
导入原始数据，在主页面的File菜单选择Add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add,样品文件即显示在Project窗口；选择分析参数。定义analysis method、panel、size standard。浏览样本电泳的原始数据，选中某样本的文件名，在“sample”菜单下选择“Raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个橙色的内标峰前)，以此时窗口左下角X轴上显示的数值作为analysis method分析参数中的起始点；点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。采用GeneMapperRID-X软件分析得到的数据并生成图谱，如图1。
实施例2利用28个短串联重复序列的复合扩增体系进行亲权鉴定
本案中对一组三联体家系进行亲缘关系鉴定。利用本发明的体系进行鉴定获得三联体家系的每个个体分型如下(表7)：
表7：三联体家系个体STR分型
分别按照母子二联体亲权鉴定及三联体亲权鉴定进行计算发现，六色荧光复合扩增体系所含的位点更多，最终得到的CPI指数比现在市面上常用的五色荧光复合扩增体系的CPI指数高。在母子二联体亲权鉴定时六色荧光复合扩增体系的CPI(表8)是五色荧光复合扩增体系的CPI(表9)的1.956*107倍；在三联体亲权鉴定时六色荧光复合扩增体系的CPI(表8)是五色荧光复合扩增体系的CPI(表9)的2.706*1013倍。可见体系中位点数目的增加有利于在亲权鉴定案件的准确判断(表10)。
表8：六色荧光复合扩增体系亲权鉴定CPI统计表
表9：五色荧光复合扩增体系亲权鉴定CPI统计表
表10：六色荧光复合扩增体系亲权鉴定CPI和五色荧光复合扩增体系亲权鉴定CPI比较
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州阅微基因技术有限公司
<120> 28个短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用
<130> xhx2017121302
<141> 2017-12-13
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Claims (9)
1.短串联重复序列的复合扩增体系，其特征在于，该复合扩增体系中包括28对引物，可同时扩增28个位点：D1S1656、D2S441、D2S1338、D3S1358、D4S2366、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D10S1248、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D22S1045、CSF1PO、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX、vWA、D11S2368、D14S608及Amelogenin，Y-indel；
所述的28对引物分别为：
2.根据权利要求1所述的复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增体系中的被扩增位点分别由五种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为同一组，五组组合分别为：
第一组：TH01、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043；
第二组：Y-Indel、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D；
第三组：D2S441、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E；
第四组：D19S433、D22S1045、D2S1338、FGA；
第五组：D4S2366、D12S391、D1S1656、D10S1248、D11S2368、D14S608。
3.根据权利要求2所述的复合扩增体系，其特征在于，所述第一组的标记为FAM标记，第二组的标记为HEX标记，第三组的标记为TAMRA标记，第四组的标记为ROX标记，第五组为PURP标记。
4.根据权利要求1或2所述的复合扩增体系，其特征在于，所述扩增体系还包括PCRMaster Mix和DNA模板。
5.根据权利要求4所述的PCR Master Mix，其特征在于，所述成分包括：10mM的硫酸铵，10mM的氯化钾，55mM的pH 8.3的Tris-HCl，2mM的镁离子,0.8ug/ul的BSA，5％的DMSO,8％的乙二醇，1mM的Na4P2O7和0.2mM的Dntp，以及2U的Taq酶。
6.根据权利要求1所述的复合扩增体系，其特征在于，所述扩增体系扩增时的反应条件为：
第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性20秒，第3步60℃退火2分钟，重复2至3步27次，最后60℃延伸10分钟。
7.根据权利要求1所述的复合扩增体系，其特征在于，各引物浓度范围为
8.一种试剂盒，包括权利要求1-7任一复合扩增体系。
9.权利要求1-7任一扩增体系或权利要求8所述的试剂盒在个体识别、家系鉴定中的应用。
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