CN111269991A - 一种针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒 - Google Patents

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CN111269991A CN202010148181.8A CN202010148181A CN111269991A CN 111269991 A CN111269991 A CN 111269991A CN 202010148181 A CN202010148181 A CN 202010148181A CN 111269991 A CN111269991 A CN 111269991A
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Abstract

本发明公开了一种针对微量、降解检材的mini‑STR试剂盒，包括20对核心基因座的特异性扩增引物,所述特异性扩增引物的核心PCR产物均小于250bp，其中STR基因座为:D16S539、D18S51、D21S11、D2S441、D13S317、FGA、D7S820、Amelogenin、D3S1358、D12S391、CSF1PO、D1S1656、THO1、D19S433、D8S1179、D10S1248、THOX、vWA、D5S818及D2S1338。本发明，建立的20个基因座的迷你型扩增体系,扩增子片段进一步缩短，均控制在250bp以内,提高了降解检材中基因座的检出数目；针对微量、降解等疑难检材的检测,具有快速、灵敏度高和适应性强的优点；适用于高度降解或抑制剂含量高的疑难样本,在实际应用中可成功获得白骨化尸骨、牙齿、趾甲、接触性脱落细胞、陈旧案件检材样本等特殊生物检材的STR分型。

Description

一种针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒
技术领域
本发明涉及法医DNA检测领域，具体涉及一种针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒。
背景技术
我国对STR DNA的数据库建设逐步标准化。根据中华人民共和国公共安全最新行业标准规定中国的常染色体核心基因座为20个，近年美国FBI也在原来13个CODIS基因座基础上增加到20个核心基因座，此外欧洲也颁布了欧洲标准(ESS)的核心基因座，这些核心基因座的并集为Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E、D12S391、D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248和SE33。因此，现在各大厂商应用于DNA数据库建设的试剂盒都基本上涵盖了上述基因座，比如ABI AmpFeSTRglobal filer、PromegaPowerPlexfusion、Qiagen Investigator 24plex、公安部物证鉴定中心DNATyper25、基点认知的25A、海尔施的STRtyper26G、阅微基因的28A等，这些试剂盒的出现使得身份鉴定识别能力大大加强。
而在公安刑事案件方面，这些年来新试剂盒的发展并没有给案件DNA检测带来质的飞跃。目前公安系统刑事案件检测应用的产品均为外企厂商生产，内企试剂盒产品的应用还比较空白，主要是内企厂商的试剂盒在性能上，比如灵敏度、抗抑制能力，稳定性等不如外企厂商的产品。而外企的案件检测试剂盒产品还是Promega PP21等为主力，位点数更多的试剂盒比如ABI AmpFeSTR global filer、PromegaPowerPlexfusion等在案件检测应用中并没有优势。这是因为刑事案件的生物学检材往往是微量、腐败、降解或陈旧的，面对这类困难检材DNA检测，外企的试剂盒产品也显得比较苍白无力，往往只能得到少数几个基因座的分型结果，难以成为有效的DNA证据。
另外公安系统还积压有不少陈年旧案，因当时的DNA检测技术还比较落后没有办法处理。对于陈年案子的检材，因当时保存条件有限，使得案件生物学检材的DNA物质发生了严重的降解，检测结果往往也是无效的，终其原因是陈年案子的案件检材DNA物质发生严重的降解，使得现有的试剂盒技术难以得到有效的DNA分型结果。由此中国发明专利CN106521013B公开了一种针对微量、降解检材的STR试剂盒及其应用，建立了17个基因座的迷你型扩增体系，能够快速检出。但基因座的数目已经不符合国家要求，仍有一些检材的检测无法覆盖全面。
有鉴于此，为了解决这个DNA降解检材的检测问题，亟需开发一种新的STR试剂盒分型技术，来满足检测陈旧降解的DNA检材物质，提高检公安检测的效率、灵敏度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的DNA检测试剂盒由于检材的降解产生的检出率低，无效率高的问题。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，包括20对核心基因座的特异性扩增引物,所述特异性扩增引物的核心PCR产物均小于250bp，其中STR基因座为:D16S539、D18S51、D21S11、D2S441、D13S317、FGA、D7S820、Amelogenin、D3S1358、D12S391、CSF1PO、D1S1656、THO1、D19S433、D8S1179、D10S1248、THOX、vWA、D5S818及D2S1338。
在上述试剂盒中，优选地，所述20对基因座的所述特异性扩增引物的序列如下:D16S539、SEQ ID NO.1～2；D18S51、SEQ ID NO.3～4；D21S11、SEQ ID ON.5～6；D2S441、SEQID NO.7～8；D13S317、SEQ ID NO.9～10；FGA、SEQ ID NO.11～12；D7S820、SEQ IDNO.13～14；Amelogenin、SEQ ID NO.15～16；D3S1358、SEQ ID NO.17～18；D12S391、SEQ ID NO.19～20；CSF1PO、SEQ ID NO.21～22；D1S1656、SEQ ID NO.23～24；THO1、SEQ ID NO.25～26；D19S433、SEQ ID NO.27～28；D8S1179、SEQ ID NO.29～30；D10S1248、SEQ ID NO.31～32；THOX、SEQ ID NO.33～34；vWA、SEQ ID NO.35～36；D5S818SEQ ID NO.37～38；D2S1338、SEQID NO.39～40。
在上述试剂盒中，优选地，所述特异性扩增引物的浓度如下:D16S539、1uM；D18S51、1uM；D21S11、1.5uM；D2S441、1uM；D13S317、1uM；FGA、1uM；D7S820、1.5uM；Amelogenin、1uM；D3S1358、1uM；D12S391、1.5uM；CSF1PO、1uM；D1S1656、1.5uM；THO1、1uM；D19S433、1uM；D8S1179、1uM；D10S1248、1.5uM；TPOX、1uM；vWA、1uM；D5S818、1uM；D2S1338、1.5uM。
在上述试剂盒中，优选地，所述特异性扩增引物分为五组：第一组，D16S539、D18S51、D21S11；第二组,D2S441、D13S317、FGA、D7S820；第三组，Amelogenin、D3S1358、D12S391、CSF1PO、D1S1656；第四组，THO1、D19S433、D8S1179、D10S1248；第五组，THOX、vWA、D5S818、D2S1338；每对特异性扩增引物中至少一条采用荧光染料标记其5端。
在上述试剂盒中，优选地，所述荧光染料为6-FAM、HEX、TF575、TF595、TF618中任意一种,且每组采用的荧光标记不同，并延伸到其它可能的六色荧光染料组合。
在上述试剂盒中，优选地，所述试剂盒中含有分子内标,且分子内标由TF650标记，共包含有19条片段，各个分子量大小为67、80、87、106、126、146、166、185、185、205、225、245、251、264、284、304、324、344、363、383，并延伸到其它可能用于第六色分子量内标的标记染料。
在上述试剂盒中，优选地，所述试剂盒的组分如下：2X PCR Master Mix，1.25mL；阳性基因组DNA，0.1ng/ul；5X引物混合物,0.5mL；去离子灭菌H20，1.25mL；其中，所述2XPCRMaster mix包含Taq DNA聚合酶、MgC12、Tris-HCl、KCl、dNTPs、BSA和PCR增强剂。
在上述试剂盒中，优选地，所述PCR增强剂为海藻糖、聚乙二醇、二甲亚砜、Twen20、NP4O、甜菜碱中的任意一种。
本发明还公开了一种根据上述结构的试剂盒，在检测包含DNA的血液、精斑、陈旧血痕、唾液斑、尿斑、牙齿、骨骼、软组织、鼻涕、痰液斑、呕吐物、口腔拭子、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞以及心脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肾脏、胰腺、脑、肠和胆等器官,对于其他分型体系或试剂盒难以获得完整分型结果的骨头、牙齿、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞、腐败降解的检材中的应用。
与现有技术相比，本发明，具有以下优点：
(1)本发明建立的20个基因座的迷你型扩增体系,扩增子片段进一步缩短，共有6个基因座核心扩增子小于120bp，10个基因座核心扩增子小于165bp，15个基因座核心扩增子小于200bp,20个基因座核心扩增子小于250bp。人类等细胞的DNA遗传物质是缠绕在组蛋白上的，最小的缠绕单位叫做核小体，很多的核小体为单位组成染色质，当DNA物质发生降解时，以核小体为单位缠绕的DNA受组蛋白保护而很难被核酸酶剪切断裂，即使是高度降解检材的DNA物质其片段长度分布范围也在146bp-200bp间，所以只要把STR基因座核心扩增子序列控制在200bp以内，就能获得这些基因座的检测分型结果。因此，本发明适用于高度降解或抑制剂含量高的疑难样本,在实际应用中可成功获得白骨化尸骨、牙齿、趾甲、接触性脱落细胞、陈旧案件检材样本等特殊生物检材的STR分型；
(2)本发明建立的六色STR荧光检测系统,20个基因座核心扩增子控制在250bp以内,提高了降解检材中基因座的检出数目；
(3)本发明针对微量、降解等疑难检材的检测,具有快速、灵敏度高和适应性强的优点。
附图说明
图1为本发明的试剂盒检测常规血痕样本分型结果图；
图2为本发明的试剂盒检测降解检材牙齿样本的检测分型结果图；
图3为本发明的试剂盒检测降解检材白骨样本的检测分型结果图；
图4为本发明的试剂盒检测降解检材趾甲样本的检测分型结果图；
图5为本发明的试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004001B)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 3.75ul)；
图6为现有PP21试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004001B)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 7.5ul)；
图7为本发明的试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004006-6)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 3.75ul)；
图8为现有PP21试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004006-6)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 7.5ul)；
图9为本发明的试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004005-4)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 3.75ul)；
图10为现有PP21试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004005-4)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 7.5ul)；
图11为本发明的试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004005-8)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 3.75ul)；
图12为为现有PP21试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004005-8)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 7.5ul)；
图13为本发明的试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004007-3)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 3.75ul)；
图14为现有PP21试剂盒检测2001年案件陈旧检材DNA样本(A201912004007-3)的检测结果分型图(12.5ul体系，DNA input 7.5ul；
图15为灵敏度及均衡性的检测结果——12.5pg 2800M检测结果/复孔1；
图16为灵敏度及均衡性的检测结果——25pg 2800M检测结果/复孔1；
图17为灵敏度及均衡性的检测结果——50pg 2800M检测结果/复孔1；
图18为灵敏度及均衡性的检测结果——100pg 2800M检测结果/复孔1；
图19为灵敏度及均衡性的检测结果——500pg 2800M检测结果/复孔1；
图20为灵敏度及均衡性的检测结果——1ng 2800M检测结果/复孔1。
具体实施方式
本发明提供了一种针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，建立的20个基因座的迷你型扩增体系,扩增子片段进一步缩短，共有6个基因座核心扩增子小于120bp，10个基因座核心扩增子小于165bp，15个基因座核心扩增子小于200bp,20个基因座核心扩增子小于250bp，本发明建立的六色STR荧光检测系统,20个基因座核心扩增子控制在250bp以内,提高了降解检材中基因座的检出数目；针对微量、降解等疑难检材的检测,具有快速、灵敏度高和适应性强的优点，本发明适用于高度降解或抑制剂含量高的疑难样本,在实际应用中可成功获得白骨化尸骨、牙齿、趾甲、接触性脱落细胞、陈旧案件检材样本等特殊生物检材的STR分型。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做出详细说明。
本发明提供的一种针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，包括20对核心基因座的特异性扩增引物,特异性扩增引物的核心PCR产物均小于250bp，其中STR基因座为:D16S539、D18S51、D21S11、D2S441、D13S317、FGA、D7S820、Amelogenin、D3S1358、D12S391、CSF1PO、D1S1656、THO1、D19S433、D8S1179、D10S1248、THOX、vWA、D5S818及D2S1338。
在上述试剂盒中，优选地，所述20对基因座的所述特异性扩增引物的序列如下:D16S539、SEQ ID NO.1～2；D18S51、SEQ ID NO.3～4；D21S11、SEQ ID ON.5～6；D2S441、SEQID NO.7～8；D13S317、SEQ ID NO.9～10；FGA、SEQ ID NO.11～12；D7S820、SEQ IDNO.13～14；Amelogenin、SEQ ID NO.15～16；D3S1358、SEQ ID NO.17～18；D12S391、SEQ ID NO.19～20；CSF1PO、SEQ ID NO.21～22；D1S1656、SEQ ID NO.23～24；THO1、SEQ ID NO.25～26；D19S433、SEQ ID NO.27～28；D8S1179、SEQ ID NO.29～30；D10S1248、SEQ ID NO.31～32；THOX、SEQ ID NO.33～34；vWA、SEQ ID NO.35～36；D5S818SEQ ID NO.37～38；D2S1338、SEQID NO.39～40。
在上述试剂盒中，优选地，所述特异性扩增引物的浓度如下:D16S539、1uM；D18S51、1uM；D21S11、1.5uM；D2S441、1uM；D13S317、1uM；FGA、1uM；D7S820、1.5uM；Amelogenin、1uM；D3S1358、1uM；D12S391、1.5uM；CSF1PO、1uM；D1S1656、1.5uM；THO1、1uM；D19S433、1uM；D8S1179、1uM；D10S1248、1.5uM；TPOX、1uM；vWA、1uM；D5S818、1uM；D2S1338、1.5uM。
具体如下表：
Figure BDA0002401497660000071
Figure BDA0002401497660000081
在上述试剂盒中，优选地，所述特异性扩增引物分为五组：第一组，D16S539、D18S51、D21S11；第二组,D2S441、D13S317、FGA、D7S820；第三组，Amelogenin、D3S1358、D12S391、CSF1PO、D1S1656；第四组，THO1、D19S433、D8S1179、D10S1248；第五组，THOX、vWA、D5S818、D2S1338；每对特异性扩增引物中至少一条采用荧光染料标记其5端。
在上述试剂盒中，优选地，所述荧光染料为6-FAM、HEX、TF575、TF595、TF618中任意一种,且每组采用的荧光标记不同，并延伸到其它可能的六色荧光染料组合。
在上述试剂盒中，优选地，所述试剂盒中含有分子内标,且分子内标由TF650标记，共包含有19条片段，各个分子量大小为67、80、87、106、126、146、166、185、185、205、225、245、251、264、284、304、324、344、363、383，并延伸到其它可能用于第六色分子量内标的标记染料。
在上述试剂盒中，优选地，所述试剂盒的组分如下：2X PCR Master Mix，1.25mL；阳性基因组DNA，0.1ng/ul；5X引物混合物,0.5mL；去离子灭菌H20，1.25mL；其中，所述2XPCRMaster mix包含Taq DNA聚合酶、MgC12、Tris-HCl、KCl、dNTPs、BSA和PCR增强剂。
在上述试剂盒中，优选地，所述PCR增强剂为海藻糖、聚乙二醇、二甲亚砜、Twen20、NP4O、甜菜碱中的任意一种。
本发明还公开了一种根据上述结构的试剂盒，在检测包含DNA的血液、精斑、陈旧血痕、唾液斑、尿斑、牙齿、骨骼、软组织、鼻涕、痰液斑、呕吐物、口腔拭子、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞以及心脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肾脏、胰腺、脑、肠和胆等器官,对于其他分型体系或试剂盒难以获得完整分型结果的骨头、牙齿、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞、腐败降解的检材中的应用。
以下为本发明进行的检材试验：
实施例一
实际案件中的血迹及困难检材(牙齿、白骨、指甲、脱落细胞等)样本分别使用本发明试剂盒的检测。本发明所述的试剂盒由如下组成:2X PCR Mastermix,基因组DNA 100pg/uL,5X引物混合物,ddH20；其中,所述的2X PCR Master mix成分为:Mg2+,Tris-HCl,K+,dNTPs,热启动Taq酶,PCR增强剂等,增强剂可以为海藻糖、聚乙二醇、NP4、甜菜碱等一种、两种或几种，Mg2+通过MgC12获得，K+通过KCl获得。
1.各种检材样品分别由广东省公安厅刑侦局、中山大学法医系、南方医科大学法学院的实验室提供。
2.各种检材的基因组DNA提取
各种检材基因组DNA的提取参考《GAT383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行,各种样本均由磁珠法工作站作站或Chelex法提取。
3.操作步骤如下：
3.1扩增体系为：
本发明试剂盒组分 10uL体系 12.5uL体系 25uL体系
2X PCR Master Mix 5uL 6.25uL 12.5uL
5X引物混合物 2uL 2.5uL 5uL
样本DNA提取物 1uL～2uL 1uL～2uL 1uL～2uL
dd H2O 补足到10uL 补足12.58uL 补足25uL
3.2扩增程序为：
本发明试剂盒
Figure BDA0002401497660000101
3.3扩增产物在遗传分析仪上检测。
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标SS383组成上样混合物{(0.5μLSS383)×(进样数)+(9.5μl去离子甲酰胺)×(进样数)}。将10uL上样混合物与本试剂盒中1μL扩增产物或系统中等位基因分析标准Allelic ladder混合,避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
3.4分型分析
用分型分析软件Genemapper ID-X 1.4分析遗传分析仪检测的数据，将样品分析数据和分型标准物(图1)比较。
4.结论
使用本发明所述试剂盒对阳性对照及实际案件中的血迹及微量降解检材(牙齿、白骨、指甲、脱落细胞等)样本的检测。试剂盒的检出率高。大部分样本扩增较好,微量降解检材也能得到正确分型。广东省公安厅刑侦局、中山大学法医系、南方医科大学法医学院的实验室提供的微量降解检材，使用10uL体系也都能够正确分型，没有出现基因座丢失的现象。因此试剂盒在检测牙齿、白骨、指甲、脱落细胞等困难微量检材也能得到好的分型结果(见附图2～4)。
实施例二
实际案件—2001年陈旧检材样本分别使用本发明试剂盒和PP21(美国Promega公司)试剂盒检测。
本发明所述的试剂盒由如下组成:本发明所述的试剂盒由如下组成:2X PCRMastermix,基因组DNA 100pg/uL,5X引物混合物,ddH20；其中,所述的2X PCR Master mix成分为:Mg2+,Tris-HCl,K+,dNTPs,热启动Taq酶,PCR增强剂等,增强剂可以为海藻糖、聚乙二醇、NP4、甜菜碱等一种、两种或几种，Mg2+通过MgC12获得，K+通过KCl获得。
PP21使用其试剂盒体系及程序具体如下：
1.检材样品由广东省公安厅刑侦局实验室提供。
2.检材的基因组DNA提取
检材基因组DNA的提取参考《GAT383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行,此样本均由磁珠法工作站提取。
3.操作步骤如下
3.1扩增体系为:
本发明试剂盒组分 12.5uL体系
2X PCR Master Mix 6.25uL
5X引物混合物 2.5uL
样本DNA提取物 3.75uL
PP21试剂盒组分 12.5uL体系
5X PCR Master Mix 2.5uL
5X引物混合物 2.5uL
样本DNA提取物 7.5uL
3.2扩增程序为：本发明试剂盒
Figure BDA0002401497660000121
PP21试剂盒
Figure BDA0002401497660000122
3.3扩增产物在遗传分析仪上检测。
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标SS383组成上样混合物{(0.5μ1SS383)×(进样数)+(9.5μl去离子甲酰胺)×(进样数)}。将10ul上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准Allelic ladder混合,避免产生气泡。95℃变性3分钟,冰浴3分钟,并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
3.4分型分析
分别应用本发明所述试剂盒和PP21试剂盒对2001年案件中的陈旧降解检材提取的6份样本检测，用分型分析软件Genemapper IDX分析遗传分析仪电泳结果数据，分别如图5～14所示，将样品检测数据进行分型分析，分型结果如下：
Figure BDA0002401497660000131
Figure BDA0002401497660000141
4.结论
本发明所述试剂盒的DNA样本使用量为3.75uL，PP21试剂盒的DNA样本使用量为7.5uL，分型结果中本发明所述试剂盒的检出率及灵敏度要高于PP21试剂盒。因此，在微量降解类型检材上本发明所述试剂盒有较好表现,明显优于对照PP21试剂盒。本发明所述试剂盒更适合于刑事案件的使用，并能够增加案件检材的检出率、提高检测的效率，最终能明显提高疑难案件的破案率。
实施例三
对本发明的灵敏度及均衡性进行测试，如图15～20所示。使用阳性DNA对照2800M、及9947A作为检测样本对本发明试剂盒进行灵敏度及均衡性检测。
本发明所述的试剂盒由如下组成:本发明所述的试剂盒由如下组成:2X PCRMastermix,基因组DNA 100pg/uL,5X引物混合物,ddH20；其中,所述的2X PCR Master mix成分为:Mg2+,Tris-HCl,K+,dNTPs,热启动Taq酶,PCR增强剂等,增强剂可以为海藻糖、聚乙二醇、NP4、甜菜碱等一种、两种或几种，Mg2+通过MgC12获得，K+通过KCl获得。
1.检材2800M(10ng/uL)、9947A(0.125ng/uL)阳性DNA对照样品由广东省公安厅刑侦局实验室提供。
2.检材2800M阳性DNA对照样本浓度梯度稀释。
将2800M 10ng/uL稀释成1ng/uL、500pg/uL、100pg/uL、50pg/uL、25pg/uL、12.5pg/uL。等六种不同的浓度。进行25uL体系的扩增检测，每种浓度的2800M阳性DNA对照加量1uL，做三个重复的平行检测。
3.操作步骤如下
3.1扩增体系为:
本发明试剂盒组分 25uL体系
2X PCR Master Mix 12.5uL
5X引物混合物 5uL
样本DNA提取物 1uL(2800M)/7.5uL(9947A)
H<sub>2</sub>O 6uL/0uL
3.2扩增程序为：
本发明试剂盒
Figure BDA0002401497660000151
Figure BDA0002401497660000161
3.3扩增产物在遗传分析仪上检测。
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标SS383组成上样混合物{(0.5μl SS383)×(进样数)+(9.5μl去离子甲酰胺)×(进样数)}。将10ul上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准Allelic ladder混合,避免产生气泡。95℃变性3分钟,冰浴3分钟,并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
3.4分型分析用分型分析软件Genemapper IDX分析遗传分析仪检测的数据，将样品分析数据和分型标准物比较。
4.结论
应用本发明所述试剂盒灵敏度及均衡性检测结果表明。25uL的扩增体系，能够检测出50pg的2800M阳性DNA对照的全部基因座信息(如图17所示)，检测灵敏度达到了50pg，即使低至25pg时也能够检测出绝大部分基因座的信息(如图16所示)，只有少数基因座的等位基因信息缺失，此检测灵敏度达到或超过了同类型STR进口试剂盒。在检测峰高均衡性方面，当2800M及9947A的DNA模板加入量在500pg～1ng范围，检测数据的峰高均衡性较好。
与现有技术相比，本发明，具有以下优点：
(1)本发明建立的20个基因座的迷你型扩增体系,扩增子片段进一步缩短，共有6个基因座核心扩增子小于120bp，10个基因座核心扩增子小于165bp，15个基因座核心扩增子小于200bp,20个基因座核心扩增子小于250bp。人类等细胞的DNA遗传物质是缠绕在组蛋白上的，最小的缠绕单位叫做核小体，很多的核小体为单位组成染色质，当DNA物质发生降解时，以核小体为单位缠绕的DNA受组蛋白保护而很难被核酸酶剪切断裂，即使是高度降解检材的DNA物质其片段长度分布范围也在146bp-200bp间，所以只要把STR基因座核心扩增子序列控制在200bp以内，就能获得这些基因座的检测分型结果。因此，本发明适用于高度降解或抑制剂含量高的疑难样本,在实际应用中可成功获得白骨化尸骨、牙齿、趾甲、接触性脱落细胞、陈旧案件检材样本等特殊生物检材的STR分型；
(2)本发明建立的六色STR荧光检测系统,20个基因座核心扩增子控制在250bp以内,提高了降解检材中基因座的检出数目；
(3)本发明针对微量、降解等疑难检材的检测,具有快速、灵敏度高和适应性强的优点。
本发明并不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，其特征在于，包括20对核心基因座的特异性扩增引物,所述特异性扩增引物的核心PCR产物均小于250bp，其中STR基因座为:D16S539、D18S51、D21S11、D2S441、D13S317、FGA、D7S820、Amelogenin、D3S1358、D12S391、CSF1PO、D1S1656、THO1、D19S433、D8S1179、D10S1248、THOX、vWA、D5S818及D2S1338。
2.根据权利要求1所述的针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，其特征在于，所述20对基因座的所述特异性扩增引物的序列如下:D16S539、SEQ ID NO.1～2；D18S51、SEQ IDNO.3～4；D21S11、SEQ ID ON.5～6；D2S441、SEQ ID NO.7～8；D13S317、SEQ ID NO.9～10；FGA、SEQ ID NO.11～12；D7S820、SEQ ID NO.13～14；Amelogenin、SEQ ID NO.15～16；D3S1358、SEQ ID NO.17～18；D12S391、SEQ ID NO.19～20；CSF1PO、SEQ ID NO.21～22；D1S1656、SEQ ID NO.23～24；THO1、SEQ ID NO.25～26；D19S433、SEQ ID NO.27～28；D8S1179、SEQ ID NO.29～30；D10S1248、SEQ ID NO.31～32；THOX、SEQ ID NO.33～34；vWA、SEQ ID NO.35～36；D5S818SEQ ID NO.37～38；D2S1338、SEQ ID NO.39～40。
3.根据权利要求1所述的针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物的浓度如下:D16S539、1uM；D18S51、1uM；D21S11、1.5uM；D2S441、1uM；D13S317、1uM；FGA、1uM；D7S820、1.5uM；Amelogenin、1uM；D3S1358、1uM；D12S391、1.5uM；CSF1PO、1uM；D1S1656、1.5uM；THO1、1uM；D19S433、1uM；D8S1179、1uM；D10S1248、1.5uM；TPOX、1uM；vWA、1uM；D5S818、1uM；D2S1338、1.5uM。
4.根据权利要求1所述的针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物分为五组：第一组，D16S539、D18S51、D21S11；第二组,D2S441、D13S317、FGA、D7S820；第三组，Amelogenin、D3S1358、D12S391、CSF1PO、D1S1656；第四组，THO1、D19S433、D8S1179、D10S1248；第五组，THOX、vWA、D5S818、D2S1338；每对特异性扩增引物中至少一条采用荧光染料标记其5端。
5.根据权利要求4所述的针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为6-FAM、HEX、TF575、TF595、TF618中任意一种,且每组采用的荧光标记不同，并延伸到其它可能的六色荧光染料组合。
6.根据权利要求1所述的针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有分子内标,且分子内标由TF650标记，共包含有19条片段，各个分子量大小为67、80、87、106、126、146、166、185、185、205、225、245、251、264、284、304、324、344、363、383，并延伸到其它可能用于第六色分子量内标的标记染料。
7.根据权利要求1所述的针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组分如下：2X PCR Master Mix，1.25mL；阳性基因组DNA，0.1ng/ul；5X引物混合物,0.5mL；去离子灭菌H20，1.25mL；其中，所述2XPCR Master mix包含Taq DNA聚合酶、MgC12、Tris-HCl、KCl、dNTPs、BSA和PCR增强剂。
8.根据权利要求7所述的针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，其特征在于，所述PCR增强剂为海藻糖、聚乙二醇、二甲亚砜、Twen20、NP4O、甜菜碱中的任意一种。
9.根据权利要求1～8任一项所述的针对微量、降解检材的mini-STR试剂盒，其特征在于，在检测包含DNA的血液、精斑、陈旧血痕、唾液斑、尿斑、牙齿、骨骼、软组织、鼻涕、痰液斑、呕吐物、口腔拭子、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞以及心脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肾脏、胰腺、脑、肠和胆等器官,对于其他分型体系或试剂盒难以获得完整分型结果的骨头、牙齿、指甲、毛发、皮肤、脱落细胞、腐败降解的检材中的应用。
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