CN109880911B - 25个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及25个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用。本发明提供一种人类染色体25个基因座的复合扩增体系，包括用于扩增25个基因座的特异性引物，所述25个基因座包括23个常染色体的STR基因座、1个性别识别基因座和1个Y染色体Indel位点。利用六色荧光标记技术对25对特异性引物进行分组荧光标记，通过引物序列和工作引物浓度的设计和优化，实现了25个人类染色体基因座的同时高效、特异、灵敏扩增。该复合扩增体系的检测结果具有很高的个体识别能力，且具有良好的数据兼容性，进而在实践上可以用于亲子鉴定和个体识别，有效降低了人类DNA分型的检测成本，提高了检测的工作效率。

Description

25个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学和生物检测技术领域，具体涉及25个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用。

背景技术

短串联重复序列(简称STR)也称为微卫星或简单序列重复(SSR)，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。STR基因座数量大，分部广泛，约占整个人类基因组的3％，而且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。

目前STR复合扩增技术为法医个体识别和亲子鉴定的主要技术手段，在世界各地的DNA实验室得到广泛应用。广泛应用于案件分析，为案件侦破提供有力证据。随着DNA检测技术的发展，很多国家利用STR复合扩增技术建立犯罪分子及嫌疑人的DNA数据库，即对在押犯人和犯罪嫌疑人的DNA数据分析并录入到数据库中，便于进行数据比对和嫌疑人排查等工作。

早期的STR复合扩增技术只能够实现在一个反应体系中扩增10个左右的STR基因座，随着应用的推广和数据比对需求的增加，10个基因座提供的信息不能满足要求，国内外的厂家开发出新的更多基因座的产品，比如美国ABI公司的AmpFISTR Identifiler试剂盒和美国Promega公司的16试剂盒都是15个STR基因座加性别决定基因。国内也有类似的产品，比如公安部二所的DNA Typer15能够同时实现15个基因座扩增(DNATyper15基因座的研究与选择，叶健等，《刑事技术》，2007年03)。

近年来随着DNA检测技术作为鉴定手段的应用越来越广，用户对试剂盒的基因座数量、信息含量、扩增时间和检测效率有了更高的要求。此外，在DNA数据库建设方面，对于试剂盒兼容性也提出了新的要求。随着我国DNA数据库建设规模的不断扩大，数据比对的作用越来越重要。数据比对是建立在STR复合扩增分析得到的数据基础之上，需要各个STR试剂盒涉及的基因座具有兼容性(中国法庭科学DNA数据库，《中国法医学杂志》，姜先华，2006年第12卷第5期)。

目前所采用的试剂盒大多以美国的CODIS标准规定的13个核心基因座(vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、TH01、TPOX)为基础，在此基础只是选择增加其它基因座，还有部分产品删除了13个核心序列中的部分基因座。随着用户对试剂盒的基因座数量、信息含量和兼容性的更高需求，各厂商推出了具有更多位点且符合最新CODIS位点的试剂盒。如果采用不同生产商的STR试剂盒，导入到DNA数据库中的数据是有基因座差异的。这样在比对的时候，不是所有数据都有效，只有相同基因座部分的数据可以比对，而不同的部分就无法应用。例如，Identifiler试剂盒和16试剂盒之间相同STR基因座为13个，其它两个STR基因座由于不同所以在数据比对时不能发挥作用。并且，这13个可比对基因座数据用于案件排除的时候是可靠的，但是用于案件认定的情况下往往是不够的，还需要更多的基因座数据。因此，由于现有技术中的STR试剂盒基因座的不同，导致数据兼容性不好，DNA数据库部分数据资源浪费、有效性降低。

随着STR检测试剂盒的应用越来越广泛，快速扩增也是试剂盒性能提升的重要性能，扩增速度的提高大大减少了时间成本的浪费，提高了工作效率。传统的试剂盒扩增时间在3～4小时左右，申请人前期开发的Goldeneye 20A试剂盒扩增时间也在2.5小时左右。因此，仍需进一步缩短扩增时间，提升试剂盒的性能和工作效率。

综上所述，DNA鉴定领域亟需开发能够实现一个反应同时扩增更多基因座、能提供更多信息量、具有更好兼容性和更快扩增速度的基因座扩增体系。

发明内容

为解决现有技术中存在的复合扩增同时检测的STR基因座的数量限制、试剂盒的兼容性差等技术问题，本发明提供一种能够同时检测25个染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用。

一方面，本发明提供一种用于人类染色体DNA分型的基因座分子标记，其特征在于，所述分子标记包括如下人类染色体上的25个基因座：常染色体的23个STR基因座：vWA、D10S1248、D2S441、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D22S1045、D1S1656、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、PentaE、TH01、TPOX；1个性别识别基因座Amelogenin；1个Y染色体Indel位点：rs2032678。

一种用于扩增所述的人类染色体上的25个基因座的的引物混合物，包括序列如SEQ ID NO.1～50所示的25对引物。

另一方面，本发明提供一种人类染色体25个基因座的复合扩增试剂盒，其包括所述的25个基因座的扩增引物。

本领域技术人员应当理解，用于复合扩增所述25个基因座的产品可以根据需要制备为不同的形式，其包括但不限于检测试剂、试剂盒、检测或扩增体系，所有包括所述25个基因座的扩增引物且能够实现所述25个基因座的复合扩增的产品均在本发明的保护范围内。

优选的，所述复合扩增试剂盒的引物成分为如下引物组成的混合物：25个基因座的扩增引物及两个内部质量参考(Internal Quality Control，IQC)的扩增引物。

优选的，所述25个基因座的扩增引物的序列如SEQ ID NO.1～50所示：其中，D3S1358、SEQ ID NO.1～2；CSF1PO、SEQ ID NO.3～4；D2S441、SEQ ID NO.5～6；D21S11、SEQID NO.7～8；Penta E、SEQ ID NO.9～10；D8S1179、SEQ ID NO.11～12；D5S818、SEQ IDNO.13～14；D19S433、SEQ ID NO.15～16；D16S539、SEQ ID NO.17～18；Penta D、SEQ IDNO.19～20；vWA、SEQ ID NO.23～24；D2S1338、SEQ ID NO.25～26；D18S51、SEQ ID NO.27～28；D22S1045、SEQ ID NO.29～30；TH01、SEQ ID NO.31～32；D12S391、SEQ ID NO.33～34；DYS393TPOX、SEQ ID NO.35～36；FGA、SEQ ID NO.37～38；D13S317、SEQ ID NO.39～40；D1S1656、SEQ ID NO.41～42；D10S1248、SEQ ID NO.43～44；D6S1043、SEQ ID NO.45～46；D7S820、SEQ ID NO.47～48、Amelogenin、SEQ ID NO.21～22；rs2032678、SEQ ID NO.49～50。

更优选的，所述复合扩增试剂盒中的引物在扩增时的工作浓度如下：D3S13580.03μM、CSF1PO 0.04μM、D2S441 0.05μM、D21S11 0.1μM、Penta E 0.13μM、D8S1179 0.78μM、D5S818 0.09μM、D19S433 0.3μM、D16S539 0.06μM、Penta D 0.1μM、vWA 0.08μM、D2S13380.1μM、D18S51 0.11μM、D22S10450.12μM、TH01 0.15μM、D12S391 0.08μM、TPOX 0.12μM、FGA0.17μM、D13S317 0.06μM、D1S1656 0.19μM、D10S1248 0.14μM、D6S10430.23μM、D7S8200.21μM；Amelogenin 0.09μM；rs2032678 0.06μM。

为实现所述25个基因座的同时快速扩增，可以选择六色荧光标记系统对所述扩增引物进行荧光染料标记。

所述荧光染料标记方法如下：将所述的25个基因座的扩增引物分为如下五组，分别用五种不同颜色的荧光染料标记五组的扩增引物，每组的扩增引物采用同一种颜色的荧光染料标记，每个基因座的一条扩增引物被荧光染料标记：第一组为D3S1358、CSF1PO、D2S441、D21S11、Penta E；第二组为D8S1179、D5S818、D19S433、D16S539、Penta D；第三组为Amelogenin、rs2032678、vWA、D2S1338、D18S51、D22S1045；第四组为TH01、D12S391、TPOX、FGA；第五组为D13S317、D1S1656、D10S1248、D6S1043、D7S820。

所述的五种不同颜色的荧光染料标记分别为蓝色、绿色、黄色、红色和紫色荧光素标记；优选的，其中，蓝色标记为5-FAM或6-FAM荧光素分子，绿色标记为HEX或JOE荧光素分子，黄色为TAMRA或NED荧光素分子，红色为ROX或Texas Red-X荧光素分子，紫色为PUR或NH618荧光素分子。更优选的，所述五种不同颜色的荧光染料标记为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX、NH618。

荧光素分子的选择包括但不限于上述具体的荧光素分子，本领域技术人员也可以根据需要选择其它与上述荧光素分子的光谱相近的荧光素分子。

优选的，试剂盒的两个内部质量参考分为一组，采用橙色荧光染料标记，选择ORG荧光素分子。

更优选的，所述荧光染料标记为在引物的5’端进行标记。

所述的复合扩增试剂盒的扩增反应程序如下：根95℃～98℃1min～5min；94℃～98℃5s～30s、58℃～62℃30s～1min、72℃20s～1min，共26～35个循环；60℃终延伸5min～30min。

优选的，所述的扩增反应程序如下：95℃2min；94℃5s、60℃45s、72℃45s，共30个循环；60℃终延伸20min。

所述25个基因座的复合扩增试剂盒在进行扩增时，其25μl的扩增反应体系如下：2.5×反应预混液10μl，5×引物混合物5μl，去离子水8μl，模板DNA 2μl，其中引物混合物为所述的25个基因座的扩增引物混合物。

优选的，本发明提供的复合扩增试剂盒还包括含有镁离子、dNTP、DNA聚合酶的反应预混液，25个基因座的等位基因ladder，DNA标准品和荧光分子量内标。

本领域技术人员应该理解，聚合酶链式反应(PCR)扩增的主要成分包括模板、引物、dNTP、DNA聚合酶以及DNA聚合酶的缓冲液等。

其中，DNA聚合酶可以为抗体封闭修饰或化学修饰的热启动DNA聚合酶。每个扩增体系(25μl)一般需要2U～4U的Taq DNA聚合酶。

反应预混液包括dNTP、DNA聚合酶以及DNA聚合酶的缓冲液；其中，DNA聚合酶的缓冲液可以包括：50mM KCl，l0mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mM MgCl₂，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)等。本领域技术人员可以根据实际需要选择dNTP、DNA聚合酶以及与之匹配的缓冲液的分开的单独试剂，或者选择使用将dNTP、DNA聚合酶以及DNA聚合酶的缓冲液等制备成预混液的用于PCR扩增的常规试剂材料，以上选择均在本发明保护的范围内。

进一步地，本发明还提供一种人类染色体25个基因座的复合扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品处理：提取样品的基因组DNA作为扩增模板或直接采用免提取的样品作为扩增模板；

(2)利用序列如SEQ ID NO.1～50所示的扩增引物对步骤(1)获得的样本基因组DNA进行扩增；

(3)扩增产物的荧光信号检测；

(4)收集荧光信号数据，分析得到25个基因座的DNA分型结果。

其中，所述样品包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液和含有胎儿细胞的羊水中的一种或多种；所述免提取的样品包括滤纸、血卡、棉签、纱布中的一种或多种载体收集的人类血液或口腔细胞。

优选的，所述提取样品的基因组DNA可以采用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法的任意一种基因组提取方法。

优选的，所述样品的DNA模板量优选为0.5ng～4ng。

扩增反应可以在各种反应热循环仪上进行，如ABI 9700、ABI 9600、ABI2720、Bio-Rad iCycler、Bio-Rad Cl000等。

所述扩增产物带有荧光染料标记，荧光标记可以在激光激发下发光信号，步骤(3)中的荧光信号检测可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器进行电泳和检测；其中，分析测序仪包括但不限于ABI 377、310DNA sequencer，遗传分析仪包括但不限于ABI 3130、3100、3730系列genetic analyzer。

具体地，在测序仪或遗传分析仪上进行检测时，扩增产物与分子量内标(marker，internal lane standard)、以及甲酰胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条己知长度的荧光标记DNA片段组成，用来计算PCR扩增产物片段长度，从而可以判断基因分型以及与等位基因阶梯比对。

收集的荧光信号等数据可以在GeneMapper、GeneMarker、GeneScan等数据分析软件上分析，最终得到STR基因分型图谱和数据。

更进一步地，本发明提供所述的分子标记或所述的复合扩增试剂盒或所述的扩增引物组在个体识别或亲子鉴定中的应用或在人类染色体DNA基因座的数据库构建中的应用。

本发明主要技术方案的设计构思如下：

1、25个人类染色体基因座组合的筛选

选择目标基因座的考虑因素主要包括其遗传多态性、与现有检测试剂盒的兼容性以及新增基因座对提高个体识别能力的贡献等。发明人针对不同个体，通过对数据库中大量基因座的染色体的遗传多态性，并在对现有试剂盒利用的基因座进行充分分析的基础上，最终确定以下25个染色体基因座的组合：常染色体的23个STR基因座：vWA、D10S1248、D2S441、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D22S1045、D1S1656、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01、TPOX；1个性别识别基因座Amelogenin；1个Y染色体Indel位点：rs2032678。其中，在GoldenEye 20A试剂盒的基础上，本发明的试剂盒：(1)增加了4个常染色体上具有高度遗传多态性的基因座，D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248；(2)增加了1个Y染色体Indel位点rs2032678，这个位点的增加可以防止Amel在引物结合区发生突变形成无效等位基因或发生染色体缺失对检测结果造成的影响，rs2032678作为Amel的补充基因座，能够更好的辨别个体性别。因此，本发明的试剂盒除了突破了目前能够实现的最多的复合扩增同时检测基因座的数目，同时具有显著提高的个体识别能力和非父排出率。所述25个基因座在电泳图谱上的排布位置如图1所示。

2、六色荧光标记技术的开发

传统的五色荧光标记技术限制了复合扩增基因座的数量，而目前常用的几种六色荧光技术存在部分荧光染料发射波长过于接近导致遗传分析仪无法完全自动去除荧光染料信号间的相互渗透，从而产生渗透峰的问题。也存在着由于荧光素分子的最大吸收光波长与遗传分析仪激发光波长较远而导致的荧光发光效率低下的问题。综合考虑荧光素的物理和化学性质以及检测仪器的波长等因素，经过大量的筛选和对比实验，最终选择合适波长的荧光素与传统的五色荧光技术配合使用，开发用于复合扩增的六色荧光标记技术。

首先，综合考虑扩增片段长度等因素，将25个基因座分为五组，每组分别由不同荧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，两个基因座不能有重叠。通过合理匹配基因座的PCR扩增效率以及荧光素标记的荧光效率，使得扩增片段在毛细管电泳分析时具有接近的RFU值，显著提高了均衡性。

本发明经大量的优化实验得到如下优选的分组：第一组为D3S1358、CSF1PO、D2S441、D21S11、Penta E；第二组为D8S1179、D5S818、D19S433、D16S539、Penta D；第三组为Amelogenin、rs2032678、vWA、D2S1338、D18S51、D22S1045；第四组为TH01、D12S391、TPOX、FGA；第五组为D13S317、D1S1656、D10S1248、D6S1043、D7S820。

然后，针对上述25个基因座在其重复序列的侧翼和Indel插入/缺失位点的侧翼处分别设计特异性引物。引物设计的基本原则如下：每条引物退火温度接近或高于60℃。不能产生引物二聚体、引物内部的发夹结构等二级结构以及交叉反应，扩增产物长度在65-500bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到清晰单一扩增条带。

利用每组基因座的引物对进行复合扩增试验。确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，经不断调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到50％以上。

将五组基因座和一组内标的引物分别用蓝色、绿色、黄色、红色、紫色和橙色荧光素标记。每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端。蓝色标记可选择5-FAM、6-FAM或相近光谱的荧光素分子，绿色标记可选择HEX、JOE或相近光谱的荧光素分子，黄色标记可选择TAMRA或相近光谱的荧光素分子，红色标记可选择ROX或相近光谱的荧光素分子，紫色标记可选择NH618、或相近光谱的荧光素分子，橙色标记可以选择ORG。

最后，将五组25个基因座进行复合扩增，对产生非特异扩增的引物进行不断优化，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，经大量的优化和筛选，确定引物混合物中25对引物的最佳工作浓度，使得各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次建立了同时扩增包括23个常染色体STR基因座、1个Y-InDel和1个Amelogenin基因座的复合扩增体系，通过巧妙的引物序列及使用浓度设计，改进的六色荧光标记技术，实现了25个基因座的同时高效、特异、灵敏的扩增，是目前报道的人类DNA分型技术能够实现同时扩增的基因座数量较多的复合扩增体系；

(2)本发明提供的25个染色体基因座的组合，在GoldenEye 20A的基础上，新增了多个具有高度遗传多态性的基因座，显著提高了检测的个体识别能力；

(3)本发明提供的25个染色体基因座的组合，整合了目前国内外DNA分型检测试剂所采用的全部基因座，具有很好的分析数据兼容性，不仅能够兼容目前我国DNA数据库中已有的全部数据，并且对新一代产品也有很高的兼容性，克服了现有技术中的检测试剂的数据兼容性的问题；

(4)本发明提供的25个染色体基因座的遗传信息，高于同时使用现有技术中2-3个同类产品得到的信息量，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了50％以上人力、时间和物料成本，提高了检测的工作效率；

(5)本发明提供的复合扩增试剂盒具有很强的检材适应性，一种试剂盒可以扩增包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA以及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞多种检材的样本；

(6)本发明提供的复合扩增体系具有较强的扩增特异性和并且温度耐受范围较广，能够保证不同的PCR扩增仪均能得到较好的扩增结果。

附图说明

图1为本发明提供的25个基因座的排布示意图。

图2为本发明提供的复合扩增试剂盒的等位基因分型标准物Allelic Ladder图谱。

图3为本发明提供的复合扩增试剂盒9948的DNA分型图谱。

图4为对比例1中样本6的25个基因座的分型图谱。

图5为对比例2中9948(样本P)的25个基因座的分型图谱。

图6为实施例4中亲缘关系鉴定的疑似父亲的25个基因座的分型图谱。

图7为实施例4中亲缘关系鉴定的疑似儿子的25个基因座的分型图谱。

图8为实施例5中数据库建设中检材1的25个基因座的分型图谱。

图9为实施例5中数据库建设中检材2的25个基因座的分型图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 25个染色体基因座复合扩增试剂盒的开发

1、25个染色体基因座复合扩增引物设计

对于复合扩增体系，尤其是本发明中25个基因座的复合扩增体系，对于引物序列的特异性、二级结构、与靶序列结合的稳定性、扩增效率等的要求极高，经过不断的扩增—优化—扩增的循环实验，得到了特异高效扩增25个基因座的25对引物，其具体序列表1所示：

表1 25个基因座的扩增引物

将上述引物按照对应基因座的如下分组方式进行不同颜色的荧光标记：第一组为D3S1358、CSF1PO、D2S441、D21S11、Penta E；第二组为D8S1179、D5S818、D19S433、D16S539、和Penta D；第三组为Amelogenin、Y indel、vWA、D2S1338、D18S51、D22S1045；第四组为TH01、D12S391、TPOX、和FGA；第五组为D13S317、D1S1656、和D10S1248、D6S1043、D7S820。

1～5组分别用蓝色、绿色、黄色、红色和紫色荧光素标记。每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端。蓝色标记选择6-FAM荧光素分子，绿色标记选择HEX荧光素分子，黄色标记选择TAMRA荧光素分子，红色标记选择ROX荧光素分子，紫色标记选择NH618荧光素分子。

2、复合扩增反应体系中引物浓度的优化

对于同时扩增25个基因座的复合扩增体系，为实现较高的扩增均衡度，对复合扩增体系中25对引物的浓度配比不断调整，逐步提高其扩增的均衡度，最终得到如下最优的引物浓度：D3S1358-0.03μM、CSF1PO-0.04μM、D2S441-0.05μM、D21S11-0.1μM、Penta E-0.13μM、D8S1179-0.78μM、D5S818-0.17μM、D19S433-0.3μM、D16S539-0.06μM、Penta D-0.1μM、vWA-0.08μM、D2S1338-0.1μM、D18S51-0.11μM、D22S1045-0.15μM、TH01-0.15μM、D12S391-0.19μM、TPOX-0.12μM、FGA-0.25μM、D13S317-0.06μM、D1S1656-0.19μM、D10S1248-0.14μM、D6S1043-0.23μM、D7S820-0.21μM；Amelogenin-0.09μM；Y-Indel位点：rs2032678-0.06μM。

25个染色体基因座复合扩增试剂盒由以下成分组成(表2)。

表2复合扩增试剂盒组成

其中，引物混合物为序列如SEQ ID NO.1～50所示的25对引物的混合物。

实施例2 25个染色体基因座复合扩增体系和程序的建立

针对25个基因座的扩增引物进行退火温度和循环数的优化，得到25个染色体基因座复合扩增的最优的反应程序：95℃保温2分钟；94℃保温5秒钟，60℃保温45秒钟，72℃保温45秒钟，该步骤运行30个循环；60℃保温20分钟；4-10℃保温。

实施例3应用复合扩增试剂盒对9948细胞株进行基因分型

利用本发明提供的试剂盒对9948细胞株进行25个染色体基因座的复合扩增。采用chelex-100方法提取来源于9948细胞株的模板DNA。扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3130遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapper IDX v1.2软件。所用的等位基因阶梯(ladder)等试剂材料均可从商业途径得到且为本领域技术人员常用的常规材料。

1、采用chelex-100方法提取DNA(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，HumanPress，1998)：

(1)取3μl培养的9948细胞株于500μl离心管中。

(2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加195μl 5％的chelex-100(l00-200mesh，购自Bio-Rad公司)，再加入5μl蛋白酶K(20mg/ml，购白天根生化科技有限公司)。

(3)震荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟。

(4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟。

(5)小心吸出约150μl上清，转移至新管中，10μl PCR反应体系取1μl作为模板。

2、聚合酶链式反应(PCR)扩增

(1)取缓冲液、引物混合物，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，加入模板DNA，配置成25μl反应体系(表3)。

表3 PCR扩增反应体系

其中，引物混合物为序列如SEQ ID NO.1～50所示的25对引物的混合物；反应预混液包括：50mM KCl，l0mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mM MgCl₂，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物，以及反应所需的Taq DNA聚合酶，所用的Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以，每个扩增体系(25μl)需要2U至4U的Taq DNA聚合酶。

(2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪(ABI 9700PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。95℃保温2分钟；94℃保温5秒钟，60℃保温45秒钟，72℃保温45秒钟，运行30个循环；60℃保温20分钟，4-10℃持续保温，直至取出样品。

3、扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3130遗传分析仪进行电泳和检测。

(1)取(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液。

(2)混匀后分装，每管10μl，再分别加入1μl扩增产物和等位基困阶梯(ladder)(等位基困阶梯如图2所示)，简短离心将液体收集到离心管管子底部。

(3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态。

(4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间4秒钟)，开始电泳检测。

(5)大约50分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和分型结果。

结果如图3所示，利用本发明提供的试剂盒获得的9948细胞株的25个染色体基因座的DNA分型与数据库中的信息一致，证明本发明提供的试剂盒能够实现25个染色体基因座的一次性准确检测。

对比例1采用不同序列的引物进行扩增

将vWA,D10S1248基因座的引物分别替换为表4中的引物序列，利用实施例1和2中的复合扩增体系和程序，利用实施例3中的检测方法，以样本6为例进行25个染色体基因座的分型，结果如图4数据显示:对于不同DNA量下杂合子位点，vWA可能出现等位基因扩增失衡，甚至等位基因漏检现象；D10S1248的主峰有较明显的加A不完全现象(图中圈出)。结果表明，用于替换的表4中的引物对，可能在DNA分型过程中造成不良影响，不适合用于本发明的引物组合，引物序列对于试剂盒的检测结果的影响较大。

表4对比例1中使用的引物序列

对比例2引物浓度变化的影响

将D5S818,D12S391,FGA,D22S1045基因座的引物浓度分别替换为表5中的引物浓度，利用实施例1和2中的复合扩增体系和程序，利用实施例3中的检测方法，进行9948细胞株25个染色体基因座的分型，结果如图5所示，结果表明，引物浓度的调整会明显影响试剂盒各染料组及整体均衡性。其中D22S1045的引物浓度调整后，电泳图谱中该基因座的产物峰高发生了明显变化，比相邻的DYS458的峰高超过2倍，均衡性上达不到试剂盒实现准确检测的要求；D5S818,D12S391,FGA的引物浓度分别调整后，峰高相应发生明显下降，同样无法达到试剂盒实现准确检测对于均衡性的要求。

表5对比例2中使用的引物浓度

基因座	引物对浓度
		D5S818	0.09μM
D12S391	0.1μM
		FGA	0.18μM
D22S1045	0.17μM

实施例4应用复合扩增试剂盒进行亲缘关系鉴定

利用本发明提供的试剂盒对来自疑似父子的2份血卡样本进行25个基因座的复合扩增。采用血卡片直接扩增的方法进行PCR扩增。扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3130遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapper IDX v1.2软件。所用的等位基因阶梯(ladder)等试剂材料均可从商业途径得到且为本领域技术人员常用的常规材料。

1、采用直径1.2mm的打孔器分别在来自祖孙二人的血卡样本上打取血片，需注意血片打取位置应充分渗透血液样本并已干燥完全。将打取的血卡片作为模板置于PCR扩增管中备用。

2、聚合酶链式反应(PCR)扩增

(1)取缓冲液、引物混合物，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，加入模板DNA，配置成25μl反应体系(表6)。

表6 PCR扩增反应体系

其中，引物混合物为序列如SEQ ID NO.1～50所示的25对引物的混合物；反应预混液包括：50mM KCl，l0mM TrisHCl(pH8.3，25℃)，2.0mM MgCl₂，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物，以及反应所需的Taq DNA聚合酶，所用的Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以，每个扩增体系(25μl)需要2.5U至5U的热启动Taq DNA聚合酶。

(2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪(ABI 9700PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。95℃保温2分钟；94℃保温5秒钟，60℃保温45秒钟，72℃保温45秒钟，运行30个循环；60℃保温20分钟，4-10℃持续保温，直至取出样品。

3、扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3130遗传分析仪进行电泳和检测。

(1)取(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液。

(2)混匀后分装，每管10μl，再分别加入1μl扩增产物。另取等位基困阶梯(ladder)(等位基困阶梯如图2所示)1μl与扩增产物一样加入上述混合液分装的管中，简短离心将液体收集到离心管管子底部。

(3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态。

(4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间4秒钟)，开始电泳检测。

(5)大约50分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和分型结果。

结果如图6(疑似父亲)、图7(疑似儿子)所示，利用本发明提供的试剂盒获得的疑似父子的25个染色体基因座的分型信息进行比对，疑似父子在25个染色体基因座上的分型均表现一致，符合遗传规律。结合实际情况，可以做出支持疑似父子为父子的亲缘关系判定。

实施例5应用复合扩增试剂盒进行司法鉴定

利用本发明提供的试剂盒对市面上常用的2种血卡样本进行25个染色体基因座的复合扩增。采用血卡片直接扩增的方法进行PCR扩增。扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3130遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapper IDX v1.2软件。所用的等位基因阶梯(ladder)等试剂材料均可从商业途径得到且为本领域技术人员常用的常规材料。

1、采用直径1.2mm的打孔器分别在2种血卡样本上打取血片，需注意血片打取位置应充分渗透血液样本并已干燥完全。将打取的血卡片作为模板置于PCR扩增管中备用。

2、聚合酶链式反应(PCR)扩增

(1)取缓冲液、引物混合物，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，加入模板DNA，配置成10μl反应体系(表7)。

表7 PCR扩增反应体系

其中，引物混合物为序列如SEQ ID NO.1～50所示的25对引物的混合物；反应预混液包括：50mM KCl，l0mM Tris HCl(pH8.3，25℃)，2.0mM MgCl₂，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物，以及反应所需的Taq DNA聚合酶，所用的Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以，每个扩增体系(10μl)需要1U至2U的热启动Taq DNA聚合酶。

(2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪(ABI 9700PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。95℃保温2分钟；94℃保温5秒钟，60℃保温45秒钟，72℃保温45秒钟，运行30个循环；60℃保温20分钟，4-10℃持续保温，直至取出样品。

3、扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3130遗传分析仪进行电泳和检测。

(1)取(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液。

(2)混匀后分装，每管10μl，再分别加入1μl扩增产物。另取等位基困阶梯(ladder)(等位基困阶梯如图2所示)1μl与扩增产物一样加入上述混合液分装的管中，简短离心将液体收集到离心管管子底部。

(3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态。

(4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间4秒钟)，开始电泳检测。

(5)大约50分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和分型结果。

检材1和2的分型结果分别如图8和图9所示，利用本发明提供的试剂盒获得的STR数据库建设样本的25个染色体基因座的分型信息，导出分型结果，录入数据库。

本领域技术人员可以理解的是，上面的描述仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案将被认为在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，对本发明进行有关的修改和变化对于本领域技术人员来讲都将是可能的，因而，这种修改和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。

序列表

<110> 基点认知技术（北京）有限公司

<120> 25个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用

<160> 50

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgacagagca agaccctgt 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaacagagg cttgcatgt 19

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acagtaactg ccttcataga taga 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgagccttct cagatactat ctcc 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaagggcta caggaatcat g 21

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cattcttatt taacatcaca aaaatctt 28

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccctgattct tcagcttgta gatg 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ataggaggta gatagactgg atag 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggagattga agtgagccga gat 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcctttgct agttctgtgg tctt 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttttgtattt catgtgtaca ttcg 24

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttacctatc ctgtagatta ttttcactg 29

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gggtgatttt cctctttggt atc 23

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtgcttttta gccaagtgat tcca 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caaaaagcta taattgtacc actg 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcaataggtt tttaaggaac aggt 24

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcaaacaaag gcagatccca ag 22

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acttaaaaac ctaatgacac agtt 24

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgatcacacc actacactcc ag 22

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcctttttta gatatgtgat tagaagt 27

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttctcttaag gtgctcaccc cttt 24

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggaataaaga acaaaatgtc tac 23

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agccctagtg gatgataaga ataa 24

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ataggacaga tgataaatac ataggat 27

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtggatttgg aaacagaaat ggct 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cctaccagaa tgccagtccc agag 24

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atgccactgc acttcactct g 21

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agtattggat aagctacttt aaaaataa 28

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

taagacccac tatgggcaaa cctt 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tccaccattt cttagctgtg tgac 24

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gggcttccga gtgcaggtc 19

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aagggtatct gggctctggg 20

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gagaaagaat caacaggatc aatg 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ttcagcctcc atatcacttg agct 24

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gcacagaaca ggcacttagg g 21

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

caggttaatt aagagattca tcca 24

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ctgtaaccaa aataaaatta ggcat 25

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tactttttct atgactttgc gctt 24

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

acccatctaa cgcctatctg tatt 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

acagacagaa agatagatag atga 24

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ccccatataa gttcaagcct gtgt 24

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gaaatagaat cactagggaa ccaa 24

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tgagcattag ccccaggacc 20

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

atcccacccc tggatattat aatt 24

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aatagtgtgc aaggatgggt ggat 24

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tgaaggcttt gacttggact gaga 24

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ttcaccatgt tggtcaggct g 21

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

caagagttac acgatggaag gca 23

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

agtgatttaa actctctgaa tcag 24

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

ataccttttt ttctactgat acct 24

Claims (13)

1.一种人类染色体25个基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于，包括以下人类染色体25个基因座的扩增引物：常染色体的23个STR基因座：vWA、D10S1248、D2S441、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D22S1045、D1S1656、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01、TPOX；1个性别识别基因座Amelogenin；1个Y染色体Indel位点：rs2032678；

所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.1～50所示：其中，D3S1358、SEQ ID NO.1～2；CSF1PO、SEQ ID NO.3～4；D2S441、SEQ ID NO.5～6；D21S11、SEQ ID NO.7～8；Penta E、SEQID NO.9～10；D8S1179、SEQ ID NO.11～12；D5S818、SEQ ID NO.13～14；D19S433、SEQ IDNO.15～16；D16S539、SEQ ID NO.17～18；Penta D、SEQ ID NO.19～20；vWA、SEQ ID NO.23～24；D2S1338、SEQ ID NO.25～26；D18S51、SEQ ID NO.27～28；D22S1045、SEQ ID NO.29～30；TH01、SEQ ID NO.31～32；D12S391、SEQ ID NO.33～34；DYS393 TPOX、SEQ ID NO.35～36；FGA、SEQ ID NO.37～38；D13S317、SEQ ID NO.39～40；D1S1656、SEQ ID NO.41～42；D10S1248、SEQ ID NO.43～44；D6S1043、SEQ ID NO.45～46；D7S820、SEQ ID NO.47～48、Amelogenin、SEQ ID NO.21～22；rs2032678、SEQ ID NO.49～50。

2.根据权利要求1所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述复合扩增试剂盒中的25个基因座的引物在扩增时的工作浓度如下：D3S1358 0.03μM、CSF1PO 0.04μM、D2S441 0.05μM、D21S11 0.1μM、Penta E 0.13μM、D8S1179 0.78μM、D5S818 0.09μM、D19S433 0.3μM、D16S539 0.06μM、Penta D 0.1μM、vWA 0.08μM、D2S1338 0.1μM、D18S51 0.11μM、D22S10450.12μM、TH01 0.15μM、D12S391 0.08μM、TPOX 0.12μM、FGA 0.17μM、D13S317 0.06μM、D1S1656 0.19μM、D10S1248 0.14μM、D6S1043 0.23μM、D7S820 0.21μM；Amelogenin 0.09μM；rs2032678 0.06μM。

3.根据权利要求1所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述扩增引物携带有荧光染料标记。

4.根据权利要求3所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，将所述的25个基因座的扩增引物分为如下五组，分别用五种不同颜色的荧光染料标记五组的扩增引物，每组的扩增引物采用同一种颜色的荧光染料标记，每个基因座的一条扩增引物被荧光染料标记：第一组为D3S1358、CSF1PO、D2S441、D21S11、Penta E；第二组为D8S1179、D5S818、D19S433、D16S539、Penta D；第三组为Amelogenin、rs2032678、vWA、D2S1338、D18S51、D22S1045；第四组为TH01、D12S391、TPOX、FGA；第五组为D13S317、D1S1656、D10S1248、D6S1043、D7S820。

5.根据权利要求4所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述的五种不同颜色的荧光染料标记分别为蓝色、绿色、黄色、红色和紫色荧光素标记；其中，蓝色标记为5-FAM或6-FAM荧光素分子，绿色标记为HEX或JOE荧光素分子，黄色为TAMRA或NED荧光素分子，红色为ROX或Texas Red-X荧光素分子，紫色为PUR或NH618荧光素分子。

6.根据权利要求1～5任一项所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，其扩增反应程序如下：95℃～98℃1min～5min；94℃～98℃5s～30s、58℃～62℃30s～1min、72℃20s～1min，共26～35个循环；60℃终延伸5min～30min。

7.根据权利要求6所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，其扩增反应程序如下：95℃2min；94℃5s、60℃45s、72℃45s，共30个循环；60℃终延伸20min。

8.根据权利要求1～5任一项所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，其25μl的扩增反应体系如下：2.5×反应预混液10μl，5×引物混合物5μl，去离子水8μl，模板DNA 2μl，其中引物混合物为所述的25个基因座的扩增引物混合物。

9.根据权利要求1～5任一项所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，还包括含有镁离子、dNTP、DNA聚合酶的反应预混液，25个基因座的等位基因ladder，DNA标准品和荧光分子量内标。

10.一种人类染色体25个基因座的复合扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品处理：提取样品的基因组DNA作为扩增模板或直接采用免提取的样品作为扩增模板；

(2)利用序列如SEQ ID NO.1～50所示的扩增引物混合物对步骤(1)获得的样本基因组DNA进行扩增；

(3)扩增产物的荧光信号检测；

(4)收集荧光信号数据，分析得到25个基因座的DNA分型结果。

11.根据权利要求10所述的复合扩增方法，其特征在于，所述样品包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液和含有胎儿细胞的羊水中的一种或多种；所述免提取的样品包括滤纸、血卡、棉签、纱布中的一种或多种载体收集的人类血液或口腔细胞。

12.权利要求1～9任一项所述的复合扩增试剂盒在个体识别或亲子鉴定中的应用。

13.权利要求1～9任一项所述的复合扩增试剂盒在人类染色体DNA基因座的数据库构建或DNA家谱构建中的应用。

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