CN113416791B - 同时扩增人25个str基因座的特异性扩增引物组、荧光标记扩增试剂盒及应用和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、荧光标记扩增试剂盒及应用和方法，属于分子遗传学技术领域。本发明所述特异性扩增引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1~50所示的引物，对应的人25个STR基因座包括23个常染色体STR基因座和2个性别鉴定STR基因座。本发明所述特异性扩增引物组对应的基因座包含了目前市面上主流案件需求的所有位点，同时还包含了2个性别鉴定基因座，可有效的预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误的风险；25个基因座联合起来，具有高个体识别力、高非父排除率的特征。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、荧光标记扩增试剂盒及应用和方法。
背景技术
STR（short tandem repeats，短串连重复序列）又称微卫星序列，是大量存在于人类基因组DNA中的短串连重复序列，重复单位为2~6个核苷酸。由于具有高度多态性和稳定性，并且与AMP-FLP和VNTR等分型方法相比，STR基因分型方法所扩增的产物长度小得多（小于500 bp），因此对于模板质量要求较低，即使降解的DNA模板也可以进行分析。此外，STR分型适用于多种DNA纯化方法所纯化的DNA，而这些纯化方法所获得的DNA量往往不够作Southern印迹分析。鉴于以上这些特点，STR分型技术已经广泛应用于法医身份识别鉴定。
法医DNA数据库是集成现代DNA检验技术、信息技术、网络技术和科学管理等要素，实现跨时空多元化应用、精确打击犯罪、保护人民、维护社会稳定的十分重要的科技利器。法医DNA数据库的核心在于所收录的STR（short tandem repeat）数据信息，一个完善的法医DNA数据库应该包含常染色体STR数据库和Y染色体STR数据库。Y染色体STR数据为案件提供侦查线索，缩小侦查范围，可以预测罪犯可能存在的地区、种族甚至姓氏，常染色体STR数据用于最后罪犯个体的筛查及确认。
最早由美国公布了13个CODIS核心基因座（CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA），随着我国法医DNA数据库的完善，我国公安部公布了属于我们自己的核心基因座（20个基因座，包含原美国13个CODIS核心基因座及Amelogenin、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E）及优选基因座（10个基因座，包换D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435用于扩大筛查使用），相对应的，公安DNA法医鉴定对试剂盒的基因座数量、信息含量及试剂盒的兼容性就有了更高的需求。而目前市面上，在优选基因座上各家的试剂盒各不相同，公安在使用过程中极不方便，且公安用户除了对基因座的需求增加以外，主要对扩增时间、适用检材种类、灵敏度等也有了越来越高的要求。
为了从根本上解决公安用户的使用需求，亟需开发一款新的常染色体STR试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、荧光标记扩增试剂盒及应用和方法。本发明所述特异性扩增引物组能够提高后续试剂盒检测的兼容性、减少扩增时间、提高试剂盒的检材适应性、提高试剂盒的灵敏度、缩短扩增片段大小、增加试剂盒的特异性，进一步满足公安用户的使用需求。
本发明提供了同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组，所述人25个STR基因座包括23个常染色体STR基因座和2个性别鉴定STR基因座，所述23个常染色体STR基因座分别是：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D10S1248、D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338、D1S1656、Penta D、D2S441、D19S433、D18S51、D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、CSF1PO、Penta E、D6S1043和D12S391；所述2个性别鉴定基因座为rs2032678和Amelogenin；所述特异性扩增引物组包括：rs2032678扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示；Amelogenin扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示；D5S818扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:5~6所示；D13S317扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示；D7S820扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示；D16S539扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示；D10S1248扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示；D3S1358扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示；TH01扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示；D21S11扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:19~20所示；D2S1338扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:21~22所示；D1S1656扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:23~24所示；Penta D扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:25~26所示；D2S441扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:27~28所示；D19S433扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:29~30所示；D18S51扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:31~32所示；D22S1045扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:33~34所示；vWA扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:35~36所示；D8S1179扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:37~38所示；TPOX扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:39~40所示；FGA扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:41~42所示；CSF1PO扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:43~44所示；Penta E扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:45~46所示；D6S1043扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:47~48所示；D12S391扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:49~50所示。
本发明还提供了同时扩增人25个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒，所述荧光标记扩增试剂盒包括反应体系和检测试剂，所述反应体系包括阳性对照DNA M2或阳性对照DNA 9948、上述技术方案所述特异性扩增引物组、反应预混液和去离子水；所述检测试剂包括分子量内标和等位基因阶梯。
优选的是，所述25个STR基因座的特异性扩增引物组的浓度如下：
SEQ ID NO:1~2所示的rs2032678扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.11~0.16μM；SEQ ID NO:3~4所示的Amelogenin扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06~0.11μM；SEQ ID NO:5~6所示的D5S818扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06~0.11μM；SEQ IDNO:7~8所示的中D13S317扩增用引物对各引物的浓度分别为0.08~0.13μM；SEQ ID NO:9~10所示的D7S820扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.28~0.33μM；SEQ ID NO:11~12所示的D16S539扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12~0.17μM；SEQ ID NO:13~14所示的D10S1248扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12~0.17μM；SEQ ID NO:15~16所示的D3S1358扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.09~0.14μM；SEQ ID NO:17~18所示的TH01扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.07~0.12μM；SEQ ID NO:19~20所示的D21S11扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.17~0.22μM；SEQ ID NO:21~22所示的D2S1338扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.07~0.12μM；SEQ ID NO:23~24所示的D1S1656扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.13~0.18μM；SEQ ID NO:25~26所示的Penta D扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.26~0.31μM；SEQ ID NO:27~28所示的D2S441扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12~0.17μM；SEQ ID NO:29~30所示的D19S433扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.25~0.30μM；SEQ ID NO:31~32所示的D18S51扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10~0.15μM；SEQ ID NO:33~34所示的D22S1045扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10~0.15μM；SEQ ID NO:35~36所示的vWA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.08~0.13μM；SEQ ID NO:37~38所示的D8S1179扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.18~0.23μM；SEQID NO:39~40所示的TPOX扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12~0.17μM；SEQ ID NO:41~42所示的FGA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10~0.15μM；SEQ ID NO:43~44所示的CSF1PO扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10~0.15μM；SEQ ID NO:45~46所示的PentaE扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.32~0.37μM；SEQ ID NO:47~48所示的D6S1043扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06~0.11μM；SEQ ID NO:49~50所示的D12S391扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.27~0.32μM。
优选的是，所述反应预混液包括：0.19~0.38U/μL的热启动Taq DNA聚合酶、100~200 mM的Tris缓冲液、100~200mM的KCL、3.75~7.5mM的MgCl2、50~100mM的(NH4)2SO4、0.5~1μM的dNTP、1000~1500mM的甜菜碱、0.19%~0.38%的Triton、0.5~1mg/ml的BSA、5%~15%的Tween、2.5%~7.5%的甘油和去离子水。
优选的是，所述25个STR基因座按照如下方式分组：
第一组：rs2032678、Amelogenin、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539和D10S1248；
第二组：D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338和D1S1656；
第三组：Penta D、D2S441、D19S433和D18S51；
第四组：D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX和FGA；
第五组：CSF1PO、Penta E、D6S1043和D12S391。
优选的是，所述检测试剂中，对应各基因座的等位基因阶梯为：
第一组： rs2032678：1、2；Amelogenin：X、Y；D5S818：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18；D13S317：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；D7S820：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15；D16S539：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15；D10S1248：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18；
第二组：D3S1358：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；TH01：4、5、6、7、8、9、10、11、12；D21S11：24、25、26、27、28、28.2、29、29.2、30、31、31.2、32、32.2、33、33.2、34、34.2、35、35.2、36、36.2、37、38；D2S1338：11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28；D1S1656:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；
第三组：Penta D:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；D2S441:8.1、9、10、11、12、13、14、15、16；D19S433:6、7、8、9、10、11、11.2、12.2、13、13.2、14、14.2、15、15.2、16、16.2、17、18、18.2、19；D18S51:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27；
第四组：D22S1045:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19；vWA:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24；D8S1179:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19；TPOX:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15；FGA:13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32.2、33.2、34.2、43.2、44.2、45.2、46.2、47.2；
第五组：CSF1PO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；Penta E:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26；D6S1043:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25；D12S391:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。
优选的是，所述检测试剂中，所述分子量内标为BTY-550，其包含65bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、400bp、450bp、490bp、500bp、540bp和550bp共16条DNA片段。
本发明还提供了上述技术方案所述特异性扩增引物组或上述技术方案所述荧光标记扩增试剂盒在法医个体识别和/或法医DNA数据库建设和/或嫌疑人家系排查和/或司法亲缘关系鉴定中的应用。
本发明还提供了基于上述技术方案所述特异性扩增引物组或上述技术方案所述荧光标记扩增试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述特异性扩增引物组对待测样品进行扩增；将扩增产物在遗传分析仪中进行电泳；电泳后，在GeneMapper_IDX软件上进行分析。
优选的是，所述扩增的程序为：
变性：95℃，5min；扩增：94℃ 10s，59℃ 80s，30个循环；终止延伸 60℃，10min。
本发明提供了同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组。本发明所述特异性扩增引物组对应的基因座包含了目前市面上主流案件需求的所有位点，同时还包含了2个性别鉴定基因座，可有效的预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误的风险；25个基因座联合起来，具有高个体识别力、高非父排除率的特征。本发明还具有以下有益效果：
（1）本发明提供的荧光标记扩增试剂盒，包含市面常用常染色体STR试剂盒全部基因座，具体包括23个常染色体STR基因座和2个性别鉴定基因座rs2032678和Amelogenin。通过研究筛选，确保所选基因座与市场主流试剂盒的基因座具有一定兼容性，即可以与已有DNA数据进行共享与交流，最后筛选出所述25个STR基因座。本发明的试剂盒可快速扩增、灵敏度高、同时可适用于各种检材的常染色体STR扩增检测。所选的25个基因座包含了公安部规定的20个核心基因座，以及四个优选基因座，包含了目前市面上主流试剂盒的所有位点。同时还包含了2个性别鉴定基因座，可以有效的预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误的风险。25个基因座联合起来，具有高个体识别力、高非父排除率的特征。
（2）本发明25个基因座的引物对（共25对引物）均经过特别设计优化，特异性强，无非特异性扩增，同时各条引物之间不互相产生干扰，不形成引物二聚体，引物长度皆在18~32bp之间，TM值在60℃左右，且每对引物均具有很高的特异性，所有25对引物之间均无相互作用，使得25个基因座对应的引物可以兼容于一个单管中。总体扩增产物长度在70~400bp之间（除FGA），更加利于降解检材的检测。经过扩增反应，每个基因座均能得到特异性的1~2条扩增带，对常见动物及微生物无非特异性扩增峰及引物峰等其他杂峰。
（3）本发明后续采用六色荧光标记系统，分别是FAM、HEX、TAMAR、ROX、PURPLE、ORG。其中FAM代表蓝色，HEX代表绿色，TAMAR代表黄色，ROX代表红色，PURPLE代表紫色，ORG代表橙色。借此，在一个反应中可以同时扩增25个基因座，充分满足了目前公安DNA数据库对比的兼容性。
（4）本发明开发的反应预混液具有不冻的特性，可以有效防止由于冻融引起的试剂性能下降的风险，同时本发明的反应预混液中包含Taq酶、dNTP、镁离子，不需要单独添加，可以有效的减少操作步骤，从而减少交叉污染的风险。本发明的反应预混液还具有快速、灵敏、适应性强的特点，反应时间缩短至60分钟，灵敏度高达0.03ng、适应各类DNA及各种血卡、FTA卡、唾液卡等。本发明PCR预混液和引物混合物均为5x，25μL扩增体系模板上样量最大可达到15μL，有助于低浓度模板的扩增。另外，本系统针对的样本是各种检材提取的DNA样本，扩增程序时间全长仅为60min，而且对于未稀释的高浓度样本，根据其浓度减少相应的扩增循环数，省略了稀释的步骤，同时扩增效率及整体均衡性不会受到影响。
（5）本发明的等位基因阶梯囊括了各个基因座最常见的所有等位基因及绝大多数的稀有等位基因，非常方便数据分析和基因分型结果的比对。
（6）本发明的分子量内标大小合适，可以有效区分65~550bp的DNA片段大小。
综上所述，本发明对现有技术的贡献包括：对基因座的合理筛选、设计各个基因座的引物、各个基因座的合理排列、选用合适的荧光染料、优化高效的反应预混液，优化物种特异性、优化扩增程序，筛选各个基因座的等位基因，设计大小合适的分子量内标，从而完成了一款可以满足当前法医身份鉴定、法医DNA数据库建设、司法亲缘关系鉴定的多功能STR身份鉴定试剂盒。
附图说明
图1为本发明提供的阳性对照 DNA M2基因分型图；
图2为本发明提供的阳性对照 DNA 9948基因分型图；
图3为本发明提供的等位基因阶梯分型图；
图4为本发明提供的分子量内标BTY-550图谱；
图5为本发明提供的疑似女儿基因分型图；
图6为本发明提供的疑似父亲基因分型图；
图7为本发明提供的血卡检材基因分型图；
图8为本发明提供的提取DNA检材基因分型图；
图9为本发明提供的泥土中混有的微生物与9948混合模板检测图；
图10为本发明提供的27种常见微生物检测图；
图11为本发明提供的Chicken、Dog、Duck、Bovine、Cat检测图；
图12为本发明提供的Mouse Balb/c、Porcine、Sheep、Fischer Rat、Rabbit检测图；
图13为本发明提供的本发明试剂盒扩增图谱；
图14为本发明提供的市面试剂盒试剂盒扩增图谱。
具体实施方式
本发明提供了同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组，所述人25个STR基因座包括23个常染色体STR基因座和2个性别鉴定STR基因座，所述23个常染色体STR基因座分别是：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D10S1248、D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338、D1S1656、Penta D、D2S441、D19S433、D18S51、D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、CSF1PO、Penta E、D6S1043和D12S391；所述2个性别鉴定基因座为rs2032678和Amelogenin；所述特异性扩增引物组包括：rs2032678扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示；Amelogenin扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示；D5S818扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:5~6所示；D13S317扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示；D7S820扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示；D16S539扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示；D10S1248扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示；D3S1358扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示；TH01扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示；D21S11扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:19~20所示；D2S1338扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:21~22所示；D1S1656扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:23~24所示；Penta D扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:25~26所示；D2S441扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:27~28所示；D19S433扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:29~30所示；D18S51扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:31~32所示；D22S1045扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:33~34所示；vWA扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:35~36所示；D8S1179扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:37~38所示；TPOX扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:39~40所示；FGA扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:41~42所示；CSF1PO扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:43~44所示；Penta E扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:45~46所示；D6S1043扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:47~48所示；D12S391扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:49~50所示。本发明所述引物组能够充分满足目前公安DNA数据库对比的兼容性，减少扩增时间、提高鉴定效率和试剂盒的检材适应性。本发明针对25个基因座，设计了25对引物，引物长度在18~30bp之间，TM值在60℃左右，且每对引物均具有很高的特异性，所有25对引物之间均无相互作用，使得25个基因座对应的引物可以兼容于一个单管中。总体扩增产物长度在70~470bp之间。经过扩增反应，每个基因座均能得到特异性的1~2条扩增带，对常见动物及微生物（常见微生物名称详见表2）无非特异性扩增峰及引物峰等其他杂峰，其他物种及常见微生物检测图谱见图9、图10、图11、图12。引物序列和在后续反应体系的引物混合物中的终浓度如表1所示。
本发明还提供了同时扩增人25个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒，所述荧光标记扩增试剂盒包括反应体系和检测试剂，所述反应体系包括阳性对照DNA M2或阳性对照DNA 9948、上述技术方案所述特异性扩增引物组、反应预混液和去离子水；所述检测试剂包括分子量内标和等位基因阶梯。为了减少法医等使用者在排查过程中的重复扩增，本发明选择基因座方面，包含了目前主流试剂盒所有的23个常染色STR基因座，23个常染色体STR基因座分别是：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D10S1248、D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338、D1S1656、Penta D、D2S441、D19S433、D18S51、D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、CSF1PO、Penta E、D6S1043、D12S391；同时为了减少鉴定过程当中出现由于Y染色体基因缺失造成的性别鉴定错误，本发明在传统的性别鉴定基因座Amelogenin外，还加入了一个高度保守的Y染色体Indel位点：rs2032678，用于辅助性别鉴定。为了能在同一管中同时扩增25个基因座，在对25个基因座的引物进行设计时，使各对引物能在一个管中、稳定兼容互不反应，且特异性、二级结构、扩增效率、稳定性等大大提高。
将本发明荧光标记扩增试剂盒与市面上主流试剂盒位点对比，对比结果见表3。本试剂盒位点包含市面主流案件试剂盒的所有位点。
在本发明中，所述25个STR基因座的特异性扩增引物组的浓度如下：
SEQ ID NO:1~2所示的rs2032678扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.11~0.16μM；SEQ ID NO:3~4所示的Amelogenin扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06~0.11μM；SEQ ID NO:5~6所示的D5S818扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06~0.11μM；SEQ IDNO:7~8所示的中D13S317扩增用引物对各引物的浓度分别为0.08~0.13μM；SEQ ID NO:9~10所示的D7S820扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.28~0.33μM；SEQ ID NO:11~12所示的D16S539扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12~0.17μM；SEQ ID NO:13~14所示的D10S1248扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12~0.17μM；SEQ ID NO:15~16所示的D3S1358扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.09~0.14μM；SEQ ID NO:17~18所示的TH01扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.07~0.12μM；SEQ ID NO:19~20所示的D21S11扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.17~0.22μM；SEQ ID NO:21~22所示的D2S1338扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.07~0.12μM；SEQ ID NO:23~24所示的D1S1656扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.13~0.18μM；SEQ ID NO:25~26所示的Penta D扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.26~0.31μM；SEQ ID NO:27~28所示的D2S441扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12~0.17μM；SEQ ID NO:29~30所示的D19S433扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.25~0.30μM；SEQ ID NO:31~32所示的D18S51扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10~0.15μM；SEQ ID NO:33~34所示的D22S1045扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10~0.15μM；SEQ ID NO:35~36所示的vWA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.08~0.13μM；SEQ ID NO:37~38所示的D8S1179扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.18~0.23μM；SEQID NO:39~40所示的TPOX扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.12~0.17μM；SEQ ID NO:41~42所示的FGA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10~0.15μM；SEQ ID NO:43~44所示的CSF1PO扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.10~0.15μM；SEQ ID NO:45~46所示的PentaE扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.32~0.37μM；SEQ ID NO:47~48所示的D6S1043扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.06~0.11μM；SEQ ID NO:49~50所示的D12S391扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.27~0.32μM。各引物浓度更优选如表1所示。通过对引物浓度优化，本发明能够实现更好的均衡性及灵敏度。
在本发明中，所述反应预混液包括：0.19~0.38U/μL的热启动Taq DNA聚合酶、100~200 mM的Tris缓冲液、100~200mM的KCL、3.75~7.5mM的MgCl2、50~100mM的(NH4)2SO4、0.5~1μM的dNTP、1000~1500mM的甜菜碱、0.19%~0.38%的Triton、0.5~1mg/ml的BSA、5%~15%的Tween、2.5%~7.5%的甘油和去离子水。本发明所述去离子水为是高度去离子的水，电阻率达到18.2MΩ，能够完全排除外来离子对扩增体系的干扰。本发明所述反应预混液具有快速、灵敏度高、适应性强等特点，并且反应预混液可以在-20℃条件下不结冰，可以有效的防止冻融对试剂性能的影响。本发明的反应预混液灵敏度高达0.03ngDNA，有效扩增时间降低到60分钟，并且对不同来源（血液、血痕、精液、精斑、唾液、唾液斑、毛发、组织、指甲、体液等）的DNA均具有优良的扩增效果，同时对特种血卡、唾液卡、FTA卡也有非常好的扩增效果。
在本发明中，所述25个STR基因座优选进行分组，并且每个基因座的至少1个特异性扩增引物的5’端优选通过化学荧光染料进行标记。
在本发明中，所述25个STR基因座按照如下方式分组：
第一组：rs2032678、Amelogenin、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539和D10S1248；
第二组：D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338和D1S1656；
第三组：Penta D、D2S441、D19S433和D18S51；
第四组：D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX和FGA；
第五组：CSF1PO、Penta E、D6S1043和D12S391。
本发明优选采用六色荧光标记系统，分别是FAM、HEX、TAMAR、ROX、PURPLE和ORG；其中FAM代表蓝色，HEX代表绿色，TAMAR代表黄色，ROX代表红色，PURPLE代表紫色，ORG代表橙色。
具体地，本发明所述第一组到第五组优选分别采用不同的荧光染料标记，其中第一组优选采用FAM，代表蓝；第二组优选采用HEX，代表绿；第三组优选采用TAMAR，代表黄；第四组优选采用ROX，代表红；第五组优选采用PURPLE，代表紫；ORG代表橙色，用于内标。
更优选的，本发明25个基因座分布情况如下：
第一组，蓝，荧光染料为FAM，标记基因座：rs2032678、Amelogenin、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D10S1248；
第二组，绿，荧光染料为HEX，标记基因座：D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338、D1S1656；
第三组，黄，荧光染料为TAMAR，标记基因座：Penta D、D2S441、D19S433、D18S51；
第四组，红，荧光染料为ROX，标记基因座：D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX、FGA；
第五组，紫，荧光染料为PURPLE，标记基因座：CSF1PO、Penta E、D6S1043、D12S391。
在本发明中，所述检测试剂中，对应各基因座的等位基因阶梯为：
第一组： rs2032678：1、2；Amelogenin：X、Y；D5S818：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18；D13S317：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；D7S820：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15；D16S539：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15；D10S1248：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18；
第二组：D3S1358：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；TH01：4、5、6、7、8、9、10、11、12；D21S11：24、25、26、27、28、28.2、29、29.2、30、31、31.2、32、32.2、33、33.2、34、34.2、35、35.2、36、36.2、37、38；D2S1338：11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28；D1S1656:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；
第三组：Penta D:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；D2S441:8.1、9、10、11、12、13、14、15、16；D19S433:6、7、8、9、10、11、11.2、12.2、13、13.2、14、14.2、15、15.2、16、16.2、17、18、18.2、19；D18S51:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27；
第四组：D22S1045:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19；vWA:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24；D8S1179:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19；TPOX:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15；FGA:13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32.2、33.2、34.2、43.2、44.2、45.2、46.2、47.2；
第五组：CSF1PO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；Penta E:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26；D6S1043:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25；D12S391:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。
在本发明中，所述检测试剂中，所述分子量内标为BTY-550，其包含65bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、400bp、450bp、490bp、500bp、540bp和550bp共16条DNA片段。可以有效的区分65~550bp的DNA片段的大小。分子量内标是由不同大小荧光标记的DNA片段组成，目的是用来区分扩增产物的大小。
本发明还提供了上述技术方案所述特异性扩增引物组或上述技术方案所述荧光标记扩增试剂盒在法医个体识别和/或法医DNA数据库建设和/或嫌疑人家系排查和/或司法亲缘关系鉴定中的应用。
本发明还提供了基于上述技术方案所述特异性扩增引物组或上述技术方案所述荧光标记扩增试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述特异性扩增引物组对待测样品进行扩增；将扩增产物在遗传分析仪中进行电泳；电泳后，在GeneMapper_IDX软件上进行分析。
在本发明中，所述扩增的程序优选为：
变性：95℃，5min；扩增：94℃ 10s，59℃ 80s，30个循环；终止延伸 60℃，10min。本发明在扩增结束后，优选将扩增产物在15℃低温保存。
在本发明中，所述扩增的反应体系优选如下：以25μL扩增体系为例，每25μL扩增体系里加5μL特异性扩增引物组（引物混合物）、5μL PCR预混液、12.5μL去离子水和2.5μL阳性对照DNA M2或9948。在本发明中，所述阳性对照DNA M2或9948优选均购自苏州新海生物科技股份有限公司。
本发明应用荧光标记的方法在引物的5'端标记一个荧光染料，PCR产物在激光激发状态下，可以发射特定波长的光信号，通过遗传分析仪（ABI3130\ABI3500\ABI3730系列一传一）进行电泳检测可以收集到光信号，通过收集的光信号进行检测。
遗传分析仪检测原理是利用毛细管电泳的原理来进行检测。扩增产物、分子量内标、甲酰胺按一定比例混合，利用DNA的荷质比不变的特性，根据分子量大小来进行区分。
遗传分析仪得到的数据，通过Genemapper数据分析软件分析，可以得到样本的STR基因分型图谱及数据。
本发明可以应用到法医、司法鉴定、人类学研究等领域。
下面结合具体实施例对本发明所述的同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、荧光标记扩增试剂盒及应用和方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
试剂盒的优化
为了能使本发明的性能达到预期指标：同时扩增25个基因座、高灵敏度、适应各种类型检材、快速扩增等指标，本发明还试剂盒的各个部分均进行了优化。
（1）对试剂盒的组成进行优化
本发明可同时扩增25个基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其包含：引物混合物、PCR 预混液、去离子水、阳性对照DNA M2或9948、等位基因阶梯25A、分子量内标BTY-550、六色光谱校正试剂（包括蓝、绿、黄、红、紫、橙）。
阳性对照DNA M2或9948，是扩增标准品，用来检验扩增体系质量好坏。在本发明优选方案中，阳性对照均可以得到正确分型，灵敏度高达0.03ng，远低于标准的0.125ng。本发明扩增的M2分形图见图1、9948分型图见图2、M2或9948基因型见表4。
六色光谱校正试剂包含六条用六种荧光标记的DNA片段，用于对遗传分析仪进行光谱校正，从而适配本发明。
（2）引物混合物浓度的优化
引物混合物包含了25个基因座的引物对，为了使各个基因座扩增效率相当，均衡性指标达到《GB∕T 37226-2018 法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》中所述标准（基因座内≥70%、同一颜色组内≥50%、不同颜色组间≥30），对引物浓度进行了全面的优化，引物浓度见表1，扩增均衡性全面超越以上标准。
（3）反应预混液的优化
本发明的反应预混液灵敏度高达0.03ngDNA，有效扩增时间降低到60分钟，并且对不同来源（血液、血痕、精液、精斑、唾液、唾液斑、毛发、组织、指甲、体液等）的DNA均具有优良的扩增效果，同时对特种血卡、唾液卡、FTA卡也有非常好的扩增效果。反应预混液配方详参见表5。
对上表经换算后，PCR 预混液包含了0.19~0.38U/μL的热启动Taq DNA聚合酶、100~200 mM的Tris缓冲液、100~200mM的KCL、3.75~7.5mM的MgCl2、50~100mM的(NH4)2SO4、0.5~1μM的dNTP、1000~1500mM的甜菜碱、0.19%~0.38%的Triton、0.5~1mg/ml的BSA、5%~15%的Tween、2.5%~7.5%的甘油、去离子水。
（4）PCR扩增程序的优化
根据标准的扩增体系，配制扩增体系（25μL扩增体系里加5μL引物混合物、5μL PCR预混液、12.5μL去离子水、2.5μL阳性对照DNA M2或9948），配制25μL的扩增体系。按照优化好的扩增程序在ABI Proflex PCR仪上进行扩增，扩增程序如表6：
（5）检测试剂中等位基因阶梯的优化
本发明的等位基因阶梯25A囊括了各个基因座绝常见的所有等位基因及绝大多数的稀有等位基因，更加方便基因分型结果的比对。
以下所选等位基因阶梯（表7）囊括了各个基因座最常见的所有等位基因及绝大多数的稀有等位基因，更加方便基因分型结果的比对。
（6）检测试剂中分子量内标的优化
分子量内标BTY-550，其包含65bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、400bp、450bp、490bp、500bp、540bp、550bp共16条DNA片段，可以有效的区分65~550bp的DNA片段的大小。
（7）检测方法
使用本发明可同时扩增人25个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒，在PCR扩增结束后，将扩增产物在ABI 3500 XL进行电泳检测。8.5μL HiDi甲酰胺+0.5μL分子量内标BTY-550+1μL PCR产物/1μL等位基因阶梯25A；分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8 kVolts，进样时间12 sec，之后开始电泳。
电泳结束后，在GeneMapper_IDX软件上进行分析，阳性对照M2、9948均能得到正确分型，见图1：M2分型图；图2：9948分型图；图3：等位基因阶梯图；图4：分子量内标BTY-550。
实施例2
本发明试剂盒在亲缘关系鉴定中的应用
对来自疑似父女的两份头发进行直接复合扩增，检测25个基因座。扩增方法采用直接扩增的方法:取一段带有毛囊的头发，直接放入扩增体系中，使毛囊完全浸入液体以内，扩增程序采用本发明标准扩增程序，扩增仪器采用ABI Proflex PCR仪，遗传分析仪采用3500xl遗传分析仪，分析软件采用GeneMapper-ID-X分析软件。本实施例操作步骤如下：
①用剪刀在头发毛囊上方0.5cm处剪短，将剪短的带有毛囊的头发放入200μL PCR管中。用于扩增的头发一定要有毛囊，如没有毛囊不可用，无法获得正确的分型。
②根据本发明的标准反应体系配制10μL扩增体系：2μL引物混合物、2μL反应预混液、6μL去离子水，加入带有剪好头发的PCR管中。在ABI Proflex PCR仪上进行PCR扩增，扩增程序为：变性：95℃，5min；扩增：94℃ 10s，59℃ 80s，30个循环；终止延伸 60℃，10min；15℃恒温保存。
③遗传分析仪检测并进行数据分析
PCR扩增结束后，将扩增产物在ABI 3500 XL进行检测。8.5μL HiDi甲酰胺+0.5μL分子量内标BTY-550+1μL PCR产物/1μL等位基因阶梯25A；分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8 kVolts，进样时间12 sec，之后开始电泳。
④电泳结束后在GeneMapper_IDX软件上进行分析，见图5：疑似女儿基因分型图；图6：疑似父亲基因分型图；疑似父亲、女儿基因分型结果见表8。
利用本发明对获得的25个基因座的基因分型进行分析比对，可以发现疑似父女的25个基因座基因信息均符合遗传规律，可以判定为父子关系。
实施例3
本发明试剂盒在法医当中的应用
本发明在法医领域主要用于违法犯罪人员DNA数据库的建设及对违法犯罪嫌疑人身份的鉴定。
全国法医DNA数据库是我国公安部建设的全国违法犯罪人员DNA数据库，如今数据库突破5000万数据，是公安系统案件侦破的主要工具。数据库通常采用血样直接扩增检测的方法建库，违法犯罪嫌疑人身份的鉴定工作中检材通常为复杂检材，采用提取DNA后进行扩增检测方法进行检测。本发明可以兼顾两种不同的检材，方便全国DNA数据库的建设及对违法犯罪嫌疑人身份的鉴定。操作的详细部分如下：
①已知违法犯罪人员检材通常为血卡，可以直接扩增。使用直径1mm的打孔器，直接在干燥血卡上打取直径1mm血片，放入200μL PCR管中。
②未知违法犯罪人员通常为案件现场检材，检材复杂，通常采用先提取DNA，后扩增的方法进行数据的检测分析。DNA通过Chelex-100和磁珠法进行DNA的提取（提取方法参照郑秀芬《法医DNA分析》第四章DNA提取）。
③反应体系的配制及扩增，参照本发明标准体系配制10μL反应体系，见下表9。在ABI Proflex PCR仪上进行PCR扩增，扩增程序为：变性：95℃，5min；扩增：94℃ 10s，59℃80s，30个循环；终止延伸 60℃，10min；15℃恒定。
④遗传分析仪检测并进行数据分析
PCR扩增结束后，将扩增产物在ABI 3500 xl上进行检测。8.5μL HiDi甲酰胺+0.5μL分子量内标BTY-550+1μL PCR产物/1μL等位基因阶梯25A； 分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8 kVolts，进样时间12 sec，之后开始电泳。
电泳结束后在GeneMapper_IDX软件上进行分析，分析完成后将分析的数据导出CODIS格式文件，然后将导出的数据上传全国DNA数据库。图7为血卡检材分型图，图8为提取DNA检材基因分型图。由图可见，直扩血卡及提取DNA，所有基因座分型正确，且杂合子基因座两个峰高一致，无峰高失衡现象，同一颜色组及不同颜色组各基因座峰高相当，均衡性高。
实施例4
本发明试剂盒与市面试剂盒灵敏度对比
灵敏度指可检出全部基因座分型的最低DNA浓度，本发明具有极高的灵敏度，在DNA浓度低至30pg，仍可检出全部基因座分型。
违法犯罪嫌疑人身份的鉴定工作中检材通常为微量检材，常见的如脱落细胞，水洗过的衣服等。对1000倍稀释微量血提取DNA，进行PCR扩增检测。操作的详细部分如下：
①将血液稀释1000倍后，将稀释血喷洒在泥土上。
②对喷洒稀释血的泥土进行磁珠法提取DNA（提取方法参照郑秀芬《法医DNA分析》第四章DNA提取）。
③反应体系的配制及扩增，参照本发明标准体系配制10μL反应体系，见下表10。在ABI Proflex PCR仪上进行PCR扩增，扩增程序为：变性：95℃，5min；扩增：94℃ 10s，59℃80s，30个循环；终止延伸 60℃，10min；15℃恒定。
④遗传分析仪检测并进行数据分析
PCR扩增结束后，将扩增产物在ABI 3500 xl上进行检测。8.5μL HiDi甲酰胺+0.5μL分子量内标BTY-550+1μL PCR产物/1μL等位基因阶梯25A； 分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8 kVolts，进样时间12 sec，之后开始电泳。
电泳结束后在GeneMapper_IDX软件上进行分析，分析完成后将分析的数据导出CODIS格式文件，然后将导出的数据上传全国DNA数据库。图13为本发明扩增图谱，丢峰均圈出来，应出峰44个，实际出峰41个，丢峰3个，丢峰率6.8%，图14为市面一常见试剂盒，应出峰54个，实际出峰45个，丢峰9个，丢峰率20%。由此看见本发明灵敏度明显高于市面试剂盒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 百特元生物科技（北京）有限公司
<120> 同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、荧光标记扩增试剂盒及应用和方法
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataccttttt ttctactgat acctttgt 28
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagcttaaa ctgggaagct g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgattttc ctctttggta tcc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaatctcctc cttcaacttg g 21
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attttccatg ttggtcaggc tgactatg 28
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggggtctaa gagcttgtaa aaag 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggaataagt gcagtgcttg g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actgcagtcc aatctgggt 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agatccctcc tgtgggctga aaag 24
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atttaaatat gtgagtcaat tccccaag 28
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atacatttgc tggcttcttc cc 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcaggggtg gtagagatgg a 21
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagcaagaca ccatctcaag aaag 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaatcttcac tctccttccc aaatg 25
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agtctatttc aataggtttt taaggaac 28
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaataacaa acccgactac ca 22
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgaatgtat gattggcaat attttt 26
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aagccctagt ggatgataag aataatc 27
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
attgcaactt atatgtattt ttgtatttca tg 32
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaccgtcgac tggcacagaa ca 22
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gctgtacttt ttctatgact ttgc 24
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgtcagacc ctgttctaag tacttc 26
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aattgaaccc aggaggtgga gattga 26
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
actgagattt acacaattgg cttc 24
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aaattacacc atcagtttcc ct 22
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ataccttttt ttctactgat acctttgt 28
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agagcttaaa ctgggaagct g 21
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ataccttttt ttctactgat acctttgt 28
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agagcttaaa ctgggaagct g 21
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggtgattttc ctctttggta tcc 23
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aaatctcctc cttcaacttg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
attttccatg ttggtcaggc tgactatg 28
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gggggtctaa gagcttgtaa aaag 24
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aggaataagt gcagtgcttg g 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
actgcagtcc aatctgggt 19
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agatccctcc tgtgggctga aaag 24
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atttaaatat gtgagtcaat tccccaag 28
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
atacatttgc tggcttcttc cc 22
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atcaggggtg gtagagatgg a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagcaagaca ccatctcaag aaag 24
<210> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agtctatttc aataggtttt taaggaac 28
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gaaataacaa acccgactac ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
acgaatgtat gattggcaat attttt 26
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aagccctagt ggatgataag aataatc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attgcaactt atatgtattt ttgtatttca tg 32
<210> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaccgtcgac tggcacagaa ca 22
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gctgtacttt ttctatgact ttgc 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
atgtcagacc ctgttctaag tacttc 26
<210> 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aattgaaccc aggaggtgga gattga 26
Claims (7)
1.同时扩增人25个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光标记扩增试剂盒包括反应体系和检测试剂，所述反应体系包括阳性对照DNA M2或阳性对照DNA9948、同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组、反应预混液和去离子水；所述检测试剂包括分子量内标和等位基因阶梯；
所述同时扩增人25个STR基因座的特异性扩增引物组包括：rs2032678扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示；Amelogenin扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示；D5S818扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:5~6所示；D13S317扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示；D7S820扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示；D16S539扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示；D10S1248扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示；D3S1358扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示；TH01扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示；D21S11扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:19~20所示；D2S1338扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:21~22所示；D1S1656扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:23~24所示；Penta D扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:25~26所示；D2S441扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:27~28所示；D19S433扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:29~30所示；D18S51扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:31~32所示；D22S1045扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ IDNO:33~34所示；vWA扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:35~36所示；D8S1179扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:37~38所示；TPOX扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:39~40所示；FGA扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:41~42所示；CSF1PO扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:43~44所示；Penta E扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:45~46所示；D6S1043扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:47~48所示；D12S391扩增用引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO:49~50所示；
所述反应预混液包括：0.19~0.38U/μL的热启动Taq DNA聚合酶、100~200 mM的Tris缓冲液、100~200mM的KCL、3.75~7.5mM的MgCl2、50~100mM的(NH4)2SO4、0.5~1μM的dNTP、1000~1500mM的甜菜碱、0.19%~0.38%的Triton、0.5~1mg/ml的BSA、5%~15%的Tween、2.5%~7.5%的甘油和去离子水；
所述25个STR基因座的特异性扩增引物组的浓度如下：
SEQ ID NO:1~2所示的rs2032678扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.132μM；SEQID NO:3~4所示的Amelogenin扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.080μM；SEQ ID NO:5~6所示的D5S818扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.079μM；SEQ ID NO:7~8所示的中D13S317扩增用引物对各引物的浓度分别为0.097μM；SEQ ID NO:9~10所示的D7S820扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.297μM；SEQ ID NO:11~12所示的D16S539扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.135μM；SEQ ID NO:13~14所示的D10S1248扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.152μM；SEQ ID NO:15~16所示的D3S1358扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.114μM；SEQ ID NO:17~18所示的TH01扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.089μM；SEQ ID NO:19~20所示的D21S11扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.189μM；SEQ ID NO:21~22所示的D2S1338扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.086μM；SEQ ID NO:23~24所示的D1S1656扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.160μM；SEQ ID NO:25~26所示的Penta D扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.272μM；SEQ ID NO:27~28所示的D2S441扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.145μM；SEQ ID NO:29~30所示的D19S433扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.265μM；SEQ ID NO:31~32所示的D18S51扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.117μM；SEQ ID NO:33~34所示的D22S1045扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.121μM；SEQ ID NO:35~36所示的vWA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.093μM；SEQID NO:37~38所示的D8S1179扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.205μM；SEQ ID NO:39~40所示的TPOX扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.144μM；SEQ ID NO:41~42所示的FGA扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.124μM；SEQ ID NO:43~44所示的CSF1PO扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.129μM；SEQ ID NO:45~46所示的Penta E扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.356μM；SEQ ID NO:47~48所示的D6S1043扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.086μM；SEQ ID NO:49~50所示的D12S391扩增用引物对中各引物的浓度分别为0.302μM。
2.根据权利要求1所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述25个STR基因座按照如下方式分组：
第一组：rs2032678、Amelogenin、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539和D10S1248；
第二组：D3S1358、TH01、D21S11、D2S1338和D1S1656；
第三组：Penta D、D2S441、D19S433和D18S51；
第四组：D22S1045、vWA、D8S1179、TPOX和FGA；
第五组：CSF1PO、Penta E、D6S1043和D12S391。
3.根据权利要求1或2所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述检测试剂中，对应各基因座的等位基因阶梯为：
第一组： rs2032678：1、2；Amelogenin：X、Y；D5S818：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18；D13S317：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；D7S820：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15；D16S539：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15；D10S1248：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18；
第二组：D3S1358：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；TH01：4、5、6、7、8、9、10、11、12；D21S11：24、25、26、27、28、28.2、29、29.2、30、31、31.2、32、32.2、33、33.2、34、34.2、35、35.2、36、36.2、37、38；D2S1338：11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28；D1S1656:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；
第三组：Penta D:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；D2S441:8.1、9、10、11、12、13、14、15、16；D19S433:6、7、8、9、10、11、11.2、12.2、13、13.2、14、14.2、15、15.2、16、16.2、17、18、18.2、19；D18S51:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27；
第四组：D22S1045:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19；vWA:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24；D8S1179:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19；TPOX:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15；FGA:13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32.2、33.2、34.2、43.2、44.2、45.2、46.2、47.2；
第五组：CSF1PO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；Penta E:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26；D6S1043:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25；D12S391:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。
4.根据权利要求1所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述检测试剂中，所述分子量内标为BTY-550，其包含65bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、400bp、450bp、490bp、500bp、540bp和550bp共16条DNA片段。
5.权利要求1~4任一项所述荧光标记扩增试剂盒在法医个体识别和/或法医DNA数据库建设和/或嫌疑人家系排查和/或司法亲缘关系鉴定中的应用。
6.基于权利要求1~4任一项所述荧光标记扩增试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
利用所述特异性扩增引物组对待测样品进行扩增；将扩增产物在遗传分析仪中进行电泳；电泳后，在GeneMapper_IDX软件上进行分析。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述扩增的程序为：
变性：95℃，5min；扩增：94℃ 10s，59℃ 80s，30个循环；终止延伸 60℃，10min。
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