KR102446162B1 - 새로운 미니 ｓｔｒ 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 ｐｃｒ 키트 및 이를 이용한 인간 유전자 감식방법 - Google Patents
새로운 미니 ｓｔｒ 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 ｐｃｒ 키트 및 이를 이용한 인간 유전자 감식방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유전자 감식 식별력이 높은 SE33 좌위의 미니 STR을 포함하는 7개 좌위들의 미니 STRs을 인간 유전자 감식 기술에 도입하여 STR 분석 성공률을 향상시킨 멀티플렉스 PCR 키트 및 이를 이용한 인간 유전자 감식방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, DNA 분해 정도에 따라 식별하지 못하는 좌위의 STR을 식별하여 STR 분석 성공률을 향상시킴으로써 보다 많은 DNA 정보를 제공하고, 나아가 데이터베이스 수록 확대 및 신원확인 성공률 향상 등 보다 효율적인 DNA 감정에 기여할 수 있으며, 더 나아가서는 과학수사 결과의 신뢰도를 높일 수 있는 동시에 범죄현장의 재구성에 단서를 제공함으로써 범죄의 해결에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 새로운 미니 STR(mini STR) 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트 및 이를 이용한 인간 유전자 감식방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자 감식 식별력이 높은 SE33 좌위의 미니 STR을 포함하는 7개 좌위들의 미니 STRs을 인간 유전자 감식 기술에 도입하여 STR 분석 성공률을 향상시킨 멀티플렉스 PCR 키트 및 이를 이용한 인간 유전자 감식방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유전자 감식 식별력이 높은 SE33 좌위의 미니 STR을 포함하는 7개 좌위들의 미니 STRs을 인간 유전자 감식 기술에 도입하여 범죄현장에서 채취된 법과학 검체 내의 인간 게놈 DNA가 분해되거나 변성된 경우에도 유전자 감식이 가능하게 함으로써, 과학수사 결과의 신뢰도를 높일 수 있는 동시에 범죄현장의 재구성에 단서를 제공함으로써 범죄의 해결에 기여할 수 있는 기술을 제공하는 것에 관한 것이다.
범죄수사를 지원하는 법과학은 과학 및 공학적 기반 지식과 분석기법의 급속적인 발달로 인하여 빠른 속도로 발전해 왔다. 과학 수사를 위해서는 범죄 현장이나 대형 참사 현장에서 채취한 다양한 시료인 법과학 검체에 대해 물리학적 분석, 화학적 분석, 분자유전학적 분석 및 다양학 과학적 분석이 이루어진다. 이와 같은 분석을 통해 얻어진 결과물은 과학 수사에 있어서 범죄를 입증하거나 사고 원인 등을 밝히는데 핵심적인 역할을 한다. 특히, 범죄현장에서 채취된 법과학 검체 내의 인간 게놈 DNA 검출 및 분석은 불상자 신원 확인 및 범죄현장의 재구성에 일차적 단서를 제공함으로써 범죄의 해결에 기여한다.
범행현장에서의 채취된 법과학 검체 내의 인간 게놈 DNA 분석, 즉 유전자 감식은 범죄수사에 있어 일반적으로 사용되고 있다. 다양한 증거물에서 피해자 또는 피의자의 게놈 DNA를 추출할 수 있으며 이를 분석하여 피의자가 범행현장에 존재하였거나 피해자에게 위해를 가했음을 유추할 수 있다. 일반적으로 법과학 분야에서는 PCR을 기반으로 하여 염색체의 특정 DNA 부위(상염색체 및 성염색체 상의 STR 영역)를 증폭하고 STR 대립유전자형을 분석하여 유전자 감식을 수행하고 있다.
염색체 상의 특정 좌위에 존재하는 STR(short tandem repeat)은 개인에 따라 그 다양성이 존재하기 때문에 특정 좌위들의 STRs의 반복 횟수를 확인하여 대립유전자형을 분석함으로써 불상자의 신원확인을 위한 유전자 감식이 가능하다. 예를 들어, 특정 좌위의 STR에 대해 부계 쪽에서 12회의 반복과 19회가 반복된 대립유전자형을 갖고 있고 모계 쪽에서 15회의 반복과 18회의 반복된 대립유전자형을 가지고 있다면, 이로부터 태어난 1대 자손은 12회의 반복과 15회 또는 18회의 반복을 가질 수 있고, 19회의 반복과 15회 또는 18회의 반복성을 가질 수 있다.
현재까지 알려진 CODIS(Combined DNA Index System) 코어 STR 좌위, 예를 들어 CODIS 20, 아멜로제닌(Amelogenin), D18S51, FGA, D21S11, D8S1179, vWA, D13S317, D16S539, D7S820, TH01, D3S1358, D5S818, CSF1PO, D2S1338, D19S433, D1S1656, D12S391, D2S441, D10S1248, DYS391 등을 기준으로 유전자 감식이 진행되고 있으며, CODIS 20을 포함하여 식별력이 높은 좌위들(예를 들어, SE33, PentaE, Penta D)을 추가로 분석하는 유전자 감식을 수행하여 불상자 신원을 확인하고 있다. 따라서, 현장 감정물 또는 불상자 시료와 같은 법과학 검체에서 가능한 모든 좌위를 분석하는 것은 DNA 감정을 성공하는데 있어 필수불가결하다.
그러나, 사건 현장에서 수집되는 시료들로부터 채취되는 DNA는 종종 외부 물질에 의한 오염, 강한 열 및 자외선(UV) 등에 장시간 노출되어 온전하지 않은 경우가 있다. 이러한 경우 채취된 법과학 검체 내의 DNA는 생화학적 또는 산화 반응이 야기되어 분해되거나 원하는 크기보다 작은 크기로 추출된다. 이와 같이 DNA 시료가 분해되거나 변성된 경우, 기존의 모세관전기영동(Capillary Electrophoresis, CE) 방법을 통해 STR(Short Tandem Repeat)의 분석을 수행하면 증폭 산물의 크기가 큰 좌위에서는 STR 대립유전자형 분석 결과를 얻을 수 없게 된다. 따라서, DNA 감정 결과, 증폭산물의 크기가 큰 좌위의 STR 대립유전자형 분석에 실패하게 되고, 일부 증폭산물의 크기가 작은 좌위에서만 STR 대립유전자형 분석 결과를 얻게 되어 데이터베이스에 수록하기가 부적합하거나 신원확인 자체가 불가능한 경우가 종종 발생한다.
현재 상용화되어 법과학적 감정을 목적으로 STR 분석에 널리 사용되고 있는 GlobalFilerTM PCR 증폭키트(ThermoFisher scientific사 제품)와 PowerPlex® 퓨전 시스템(Promega사 제품)은 일부 법과학 검체에 대해 유전자 감식이 불가능한 한계가 있다. DNA 시료가 분해되거나 변성된 경우, mtDNA(mitochondria DNA)의 가변 영역(HV I, HV2) 분석을 사용하기도 하지만, 시간이 많이 소요되고 모계로 유전하는 특성이 있어 모든 감정물에 적용하는데 한계가 있다.
본 발명자들은 분해되거나 변성된 DNA 시료에서도 분석이 가능하고 유전자 감식 식별력이 보다 향상된 STR 분석 기술의 개발을 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 기존에 사용되고 있던 GlobalFilerTM PCR 증폭키트(ThermoFisher scientific사 제품)와 PowerPlex® 퓨전 시스템(Promega사 제품)으로 분석이 불가능하였던 DNA 시료를 검출할 수 있는 새로운 미니 STR(mini STR) 조합을 이용한 유전자 감식기술을 개발하기에 이르렀다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명은 새로운 미니 STR(mini STR) 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트 및 이를 이용한 인간 유전자 감식방법을 제공하는데 그 목적이 있다. 구체적으로, 본 발명은 유전자 감식 식별력이 높은 SE33 좌위의 미니 STR을 포함하는 7개 좌위들의 미니 STRs을 인간 유전자 감식 기술에 도입하여 STR 분석 성공률을 향상시킨 멀티플렉스 PCR 키트 및 이를 이용한 인간 유전자 감식방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 유전자 감식 식별력이 높은 SE33 좌위의 미니 STR을 포함하는 7개 좌위들의 미니 STRs을 인간 유전자 감식 기술에 도입하여 범죄현장에서 채취된 법과학 검체 내의 인간 게놈 DNA가 분해되거나 변성된 경우에도 유전자 감식이 가능하게 함으로써, 과학수사 결과의 신뢰도를 높일 수 있는 동시에 범죄현장의 재구성에 단서를 제공함으로써 범죄의 해결에 기여할 수 있는 기술을 제공하는데 그 목적이 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기한 발명의 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 유전자 감식 식별력이 높은 SE33 좌위의 미니 STR을 포함하는 7개 좌위들의 미니 STRs을 인간 유전자 감식 기술에 도입하여 STR 분석 성공률을 향상시킨 멀티플렉스 PCR 키트 및 이를 이용한 인간 유전자 감식방법을 안출하였다.
즉, 본 발명자들은 STR(short tandem repeat) 좌위들 중 STR 영역의 증폭 산물의 크기가 300 bp 이상으로 큰 총 7개 좌위들(유전자 감식 식별력이 높은 SE33 좌위 포함)을 선별하고 이를 미니 STR 분석 기술에 적용함으로써 새로운 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트를 개발하였다. 또한, 본 발명의 멀티플렉스 PCR 키트에는 1개의 성별 식별 좌위, 즉 아멜로제닌 좌위를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍도 추가로 포함시켰다.
특히, 본 발명의 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트는 유사한 목적으로 상용화된 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트인 AmpFLSTRTM MinifilerTM PCR 증폭 키트(ThermoFisher scientific사 제품)에서는 분석이 불가능하였던 SE33 좌위의 미니 STR과 TPOX 좌위의 미니 STR 분석이 가능하게 구성함으로써 유전자 감식 식별력을 향상시켰다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "검체" 또는 "법과학 검체"란 범죄 현장이나 대형 참사 현장에서 채취한 다양한 시료로서, 과학 수사를 위해 물리학적 분석, 화학적 분석, 분자유전학적 분석 및 다양학 과학적 분석 등이 이루어지는 시료를 의미한다. 법과학 검체로는 유전자 검출이 가능한 범죄현장의 다양한 증거물, 예를 들어, 타액, 혈액, 혈흔, 정액, 질액, 질분비물, 질벽 채취물(예를 들어 면봉 등의 검체도구를 이용하여 채취된 질분비물, 질 상피) 또는 이들의 혼합물, 머리카락, 체모, 땀, 각질 또는 이들의 혼합물, 의복, 속옷, 손수건, 마스크, 복면, 담배꽁초, 컵, 음료수병, 캔, 휴지 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 법과학 검체는 이에 제한되는 것이 아니며, 범죄 현장 등에서 채취한 다양한 시료로서 인간 게놈 DNA가 검출될 수 있는 시료라면 본 발명에서 사용될 수 있음은 물론이다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "유전자 샘플"이란 DNA, RNA, 역전사 효소에 의해 RNA로부터 생성된 cDNA, pre-PCR (예비 PCR)을 통해 증폭된 DNA 또는 cDNA 등을 포함하는 광의의 개념으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "STR(short tandem repeat) 대립유전자"란 개인식별에 사용될 수 있는 특정 염기서열의 반복 단위인 STR(short tandem repeat)의 반복 횟수가 특정수인 유전자를 의미한다. 예를 들어, STR 대립유전자의 반복 횟수가 16회일 때 대립유전자 16(allele 16)으로 표시할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "미니 STR(mini STR)"이란 특정 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머의 설계를 변경(예: 프라이머 위치 이동 등)함으로써 STR 영역을 포함하는 증폭산물의 크기를 작게 만드는 기술 자체를 의미하기도 하고, 이러한 기술을 이용한 유전자 감식을 위해 증폭대상이 되는 작은 STR 영역(설계 변경 전의 프라이머에 의해 증폭되는 STR 영역 보다 길이가 짧은 STR 영역 또는 단편)을 의미하기도 한다. 또한, "멀티플렉스 PCR"이란 하나의 반응 용기에서 복수 개의 좌위들의 미니 STRs을 PCR 증폭함으로써 복수 개의 STR 대립유전자형을 동시에 분석하는 것을 의미한다.
본 발명은 미니 STR(mini short tandem repeat) 조합을 이용한 인간 유전자 감식(유전자형 분석)에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 미니 STR(mini short tandem repeat) 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트는, CSF1PO 좌위의 STR(short tandem repeat) 영역을 특이적으로 증폭하여 CSF1PO 좌위의 미니 STR(mini STR) 증폭산물을 생성하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, D7S820 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 D7S820 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍과, TPOX 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 TPOX 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍과, FGA 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 FGA 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍과, D2S1338 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 D2S1338 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍과, D13S317 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 D13S317 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍과, SE33 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 SE33 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍을 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트는 성별을 구별하는 아멜로제닌(Amelogenin) 좌위를 특이적으로 증폭하는 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍을 더 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트는, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트에 있어서, 서열번호 1의 프라이머의 5'말단 및 서열번호 3의 프라이머의 5'말단에는 제1 표지물질이 표지되고, 서열번호 5의 프라이머의 5'말단 및 서열번호 7의 프라이머의 5'말단에는 제2 표지물질이 표지되며, 서열번호 9의 프라이머의 5'말단, 서열번호 11의 프라이머의 5'말단 및 서열번호 13의 프라이머의 5'말단에는 제3 표지물질이 표지되며, 서열번호 15의 프라이머의 5'말단에는 제4 표지물질이 표지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트에 있어서, 상기 제1 표지물질, 상기 제2 표지물질, 상기 제3 표지물질 및 상기 제4 표지물질은 서로 다른 파장에서 검출되는 형광물질일 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예의 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트는 서로 다른 파장에서 검출되는 형광물질로 표지된 미니 STR 증폭산물들을 분광학적 기법으로 구별하여 한번의 검사로 복수 개의 STR 대립유전자형을 동시에 분석하는 멀티플렉스 PCR 분석이 가능하다.
본 발명의 일 구체예의 미니 STR(mini short tandem repeat) 조합을 이용하는 인간 유전자 감식방법은, 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와, 전술한 바와 같은 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 멀티플렉스 PCR로 증폭하는 단계와, 멀티플렉스 PCR 결과에 기초하여 CSF1PO 좌위, D7S820 좌위, TPOX 좌위, FGA 좌위, D2S1338 좌위, D13S317 좌위 및 SE33 좌위에 각각 대응하는 STR 대립유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 미니 STR 조합을 이용하는 인간 유전자 감식방법은, 아멜로제닌(Amelogenin) 좌위에 대한 XX형 또는 XY형 분석에 의해 남녀 성별을 구별할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 미니 STR 조합을 이용하는 인간 유전자 감식방법은 서로 다른 파장에서 검출되는 형광물질로 표지된 미니 STR 증폭산물들을 분광학적 기법으로 구별하여 한번의 검사로 복수 개의 STR 대립유전자형을 동시에 분석하는 멀티플렉스 PCR 분석이 가능하다.
한편, 본 발명에 있어서 정방향 프라이머의 5'말단은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 (SYBR green), 6-FAM, FAM, VIC, JOE, NED, HEX, TET, PET 및 TAMRA 등과 같은 표지물질로 표지될 수 있다.
본 발명의 새로운 미니 STR(mini STR) 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트는 현재 상용되고 있는 GlobalFilerTM PCR 증폭키트와 PowerPlex® 퓨전 시스템이 DNA 분해 정도에 따라 식별하지 못하는 좌위들의 미니 STRs을 식별하여 종래기술의 부족한 식별력을 추가적으로 제공할 수 있고, 유전자 감식 식별력이 높은 SE33 좌위의 미니 STR을 식별하여 신원확인의 정확도를 높일 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명은 DNA 분해 정도에 따라 식별하지 못하는 좌위의 미니 STR을 식별하여 STR 분석 성공률을 향상시킴으로써 보다 많은 DNA 정보를 제공하고, 나아가 데이터베이스 수록 확대 및 신원확인 성공률 향상 등 보다 효율적인 DNA 감정에 기여할 수 있다.
또한, 본 발명은 새로운 미니 STR(mini STR) 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 범죄현장에서 채취된 법과학 검체 내의 인간 게놈 DNA가 분해되거나 변성된 경우에도 유전자 감식이 가능하게 함으로써, 과학수사 결과의 신뢰도를 높일 수 있는 동시에 범죄현장의 재구성에 단서를 제공함으로써 범죄의 해결에 기여할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1의 본 발명의 미니 STR(mini STR) 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트로 증폭한 경우 멀티플렉스 PCR 증폭산물의 크기 분포를 나타내는 모식도이다.
도 2는 멀티플렉스 PCR 증폭산물의 크기 분포에 있어서, 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 GlobalFilerTM PCR 증폭키트와 PowerPlex® 퓨전 시스템과 비교하는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 인간 유전자를 감식하는 과정(STR 대립유전자형 분석 과정)을 나타내는 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 2800M 표준 DNA를 STR 분석한 결과 그래프로서, 각 좌위 별로 STR 대립유전자형을 식별하고 있는 것을 나타내고 있다.
도 5a 및 도 5b는 각각 종래의 GlobalFilerTM PCR 증폭키트 및 PowerPlex® 퓨전 시스템을 이용하여 STR 분석한 결과 그래프로서, 일부 좌위들에서 STR 대립유전자형을 식별하지 못하고 있는 것을 나타낸다.
도 5c는 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 STR 분석한 결과 그래프로서, 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이 종래의 STR 분석용 PCR 증폭키트가 식별하지 못한 STR 대립유전자형을 식별하는 것을 나타내고 있다.
도 2는 멀티플렉스 PCR 증폭산물의 크기 분포에 있어서, 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 GlobalFilerTM PCR 증폭키트와 PowerPlex® 퓨전 시스템과 비교하는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 인간 유전자를 감식하는 과정(STR 대립유전자형 분석 과정)을 나타내는 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 2800M 표준 DNA를 STR 분석한 결과 그래프로서, 각 좌위 별로 STR 대립유전자형을 식별하고 있는 것을 나타내고 있다.
도 5a 및 도 5b는 각각 종래의 GlobalFilerTM PCR 증폭키트 및 PowerPlex® 퓨전 시스템을 이용하여 STR 분석한 결과 그래프로서, 일부 좌위들에서 STR 대립유전자형을 식별하지 못하고 있는 것을 나타낸다.
도 5c는 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 STR 분석한 결과 그래프로서, 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이 종래의 STR 분석용 PCR 증폭키트가 식별하지 못한 STR 대립유전자형을 식별하는 것을 나타내고 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예 1: 프라이머 세트 설계 및 제작
본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 제작하기 위해 STRBase (https:/strbast.nist.gov)를 참고하여, 국립과학수사연구원에서 개인식별에 사용하고 있는 GlobalFilerTM PCR 증폭키트(ThermoFisher scientific사 제품)와 PowerPlex® 퓨전 시스템(Promega사 제품)에 포함된 증폭 산물이 큰 7개 좌위들 (SE33, CSF1PO, D7S820, D13S317, D2S1338, TPOX 및 FGA)을 선정하였고, 이들 총 7개 좌위의 STR 영역을 작은 크기의 증폭산물로 특이적으로 증폭하여 각 좌위별 STR 대립유전자형을 분석할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 또한, 성별을 판별할 수 있는 아멜로제닌(Amelogenin) 좌위를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍도 제작하였다. 제작된 프라이머 세트의 정보는 하기 표 1과 같다(표 1에 표시된 색상은 각 정방향 프라이머의 5'말단에 표지된 형광물질의 발광색을 나타냄).
이러한 프라이머 세트를 포함하는 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트는 상기 7개 좌위들(SE33, CSF1PO, D7S820, D13S317, D2S1338, TPOX 및 FGA)의 STR 영역의 PCR 증폭산물의 크기를 줄여서 증폭하는 미니 STR 기술을 적용하였고, 유사한 목적으로 상용화된 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트인 AmpFLSTRTM MinifilerTM PCR 증폭 키트(ThermoFisher scientific사 제품)에서는 분석이 불가능하였던 SE33 좌위의 미니 STR과 TPOX 좌위의 미니 STR 분석이 가능하게 구성함으로써 유전자 감식 식별력을 향상시켰다. 본 발명의 미니 STR(mini STR) 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트로 증폭한 경우 멀티플렉스 PCR 증폭산물의 크기 분포는 도 1에 도시된 바와 같다.
전술한 바와 같이 선별된 좌위들(아멜로제닌 좌위 제외)에 대한 프라이머 세트는 본 발명이 목표로 하는 미니 STR 영역의 특이적 증폭에 적합하게 제작하였다. 이를 위해 선별된 좌위들에 대한 미니 STR 영역의 증폭산물의 크기가 330 bp 미만이 되도록 표 1의 프라이머 세트를 제작하였다. 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트는 GlobalFilerTM PCR 증폭키트 보다 STR 영역의 증폭산물의 크기가 평균 108 bp 정도 줄어들도록 프라미어를 제작하였고, PowerPlex® 퓨전 시스템 보다는 STR 영역의 증폭산물의 크기가 평균 136 bp 정도 줄어들도록 프라이머를 제작하였다.
본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트와 상용되는 종래의 STR 키트들(PowerPlex® 퓨전 시스템 및 GlobalFilerTM PCR 증폭키트)를 STR 영역의 증폭산물 크기 면에서 비교하였다. 하기 표 2는 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 사용한 경우 STR 증폭산물 크기 감소를 나타내고 있다{표 2에 나타낸 색상은 각 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머의 쌍(정방향 프라이머의 5'말단에 형광물질 표지)에 의해 증폭된 STR 영역의 증폭산물에 표지된 형광물질의 발광색을 나타냄}.
상기 표 2에 도시된 바와 같이 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트는 현재 상용되고 있는 PowerPlex® 퓨전 시스템 및 GlobalFilerTM PCR 증폭키트에 비해 STR 증폭산물의 크기를 평균 100 bp 이상 줄이는 미니 STR 방식을 채택하여 프라이머 세트를 설계하였기 때문에, 상기와 같은 STR 분석 키트들의 부족한 식별력을 추가적으로 제공할 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트의 STR 증폭산물의 크기를 GlobalFilerTM PCR 증폭키트와 PowerPlex® 퓨전 시스템의 STR 증폭산물의 크기와 대조하여 비교한 것이 도 2에 도시되어 있다.
특히, 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트는 유전자 감식 식별력이 높은 SE33 좌위에 대해 미니 STR 기술을 적용하였기 때문에 인간 유전자 감식 식별력을 높일 수 있고, SE33 좌위의 경우 GlobalFilerTM PCR 증폭키트의 분석 좌위에 포함되어 있지만, PowerPlex® 퓨전 시스템의 분석 좌위에는 포함되지 않아 교차 확인이 되지 않았던 종래의 문제점도 해결할 수 있다.
실시예 2: 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트 준비 및 이를 이용한 STR 분석
프라이머는 표준 DNA 시료인 2800M 콘트롤 DNA(Promega사 제품)(0.5 ng/μL, ×20배 희석)을 주형으로서 사용한 단일 증폭 과정을 통해 특이적 증폭 여부를 확인한 후, 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트로 혼합하여 제작하였다. 멀티플렉스 프라이머 세트로 제작하기 위해 그래디언트(gradient) PCR을 진행하여 적정 용융 온도(melting temperature; Tm)를 설정하였다. 형광 염료를 각 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머의 5'말단에 표지하였다.
본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 이용한 멀티플렉스 PCR 증폭은 ProFlex PCR 시스템(ThermoFisher Scientific사 제품)을 이용하여 하기 표 3 및 표 4의 조성과 하기 표 5의 PCR 증폭조건 하에서 수행하였고, 증폭된 앰플리콘에 대해 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 수행하였으며, 분석장비인 3500xL 제네닉 애널라이저(Applied Biosystems사 제품)를 이용하여 최종 분석하였다. 그리고 STR 데이터 분석을 위해 GeneMapperTM ID-X 소프트웨어(ThermoFisher Scientific사 제품)를 사용하였다. 이와 같이 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 인간 유전자를 감식하는 과정(STR 대립유전자형 분석 과정)은 도 3에 도시된 바와 같다.
| 좌위 (프라이머 서열번호) | 정방향 프라이머(μM) | 역방향 프라이머(μM) |
| CSF1PO (서열번호 1 및 2) | 0.2 | 0.2 |
| D7S820 (서열번호 3 및 4) | 0.2 | 0.2 |
| TPOX (서열번호 5 및 6) | 0.1 | 0.1 |
| FGA (서열번호 7 및 8) | 0.2 | 0.2 |
| 아멜로제닌 (서열번호 9 및 10) | 0.15 | 0.15 |
| D2S1338 (서열번호 11 및 12) | 0.15 | 0.15 |
| D13S317 (서열번호 13 및 14) | 0.2 | 0.2 |
| SE33 (서열번호 15 및 16) | 0.4 | 0.4 |
| 성분 | 부피 (μL) |
| 프라이머 믹스 세트 | 2 |
| 10X Gold STaR 버퍼 (Promega) | 2 |
| EagleTaq DNA 폴리머라아제 (5U/μL) (Roche CUSTOMBIOTECH) | 1 |
| 증류수 | 14 |
| DNA 시료 or 콘트롤 DNA (2800M) 0.5 ng/uL | 1 |
| 합계 | 20 |
| 사이클 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 수 | |
| 단계1 | 초기 변성 | 95℃ | 11분 | 1회 |
| 단계2 | 변성 | 95℃ | 30초 | 30회 |
| 어닐링 | 59℃ | 30초 | ||
| 연장 | 72℃ | 45초 | ||
| 단계3 | 최종 연장 | 72℃ | 15분 | 1회 |
| 25℃ | ∞ |
우선, 상기와 같이 얻어진 STR 데이터 값을 Promega사의 2800M 콘트롤 DNA에 제시되어 있는 STR 대립유전자(allele) 데이터 값과 비교하여, 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트에 의해 각 좌위의 미니 STR 영역이 특이적으로 증폭되는지 여부를 확인하였다. 각 STR 마커들의 피크 높이 밸런스(Peak height balance)를 맞추기 위해 프라이머 농도 비율을 조정하였고, 균일한 멀티플렉스 STR 데이터를 얻었다(도 4). 따라서, 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트는 STR 대립유전자형 분석을 통한 인간 유전자 감식에 적합한 것임을 확인할 수 있었다.
다음으로, 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 종래의 STR 분석키트와 비교 분석을 하였다. PCR 조성 및 반응조건은 상기 표 3, 표 4 및 표 5에 제시된 바와 같다. 이를 위해, 표준 DNA 시료로 사용되는 Promega사의 2800M 콘트롤 DNA, K562 게놈 DNA, 9948 남성 DNA와 Applied Biosystems사의 콘트롤 DNA 9947A, DNA 콘트롤 007을 혼합하여 대립형질 사다리(allelic ladder)로 사용하였고, 한국인 130명의 DNA 시료들을 이용하여 비교 분석 실험을 하였다. 대부분의 시료에서 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트의 STR 분석 결과는 GlobalFilerTM PCR 증폭 키트의 STR 분석결과와 100% 일치하는 것을 확인하였다.
그러나, 일부 DNA 시료(DNA의 변성이나 분해가 있을 것으로 추정되는 시료)를 GlobalFilerTM PCR 증폭키트 및 PowerPlex® 퓨전 시스템을 이용하여 STR 분석한 결과, 일부 좌위들에서 STR 대립유전자형을 식별하지 못하였다(도 5a 및 도 5b참조). 즉, GlobalFilerTM PCR 증폭 키트에서는 5개 좌위(CSF1PO, TPOX, D7S820, SE33 및 D2S1338)의 결과를 얻지 못했고, PowerPlex® 퓨전 시스템에서 5개 좌위(D13S317, D2S1338, CSF1PO, TPOX 및 D7S820)의 결과를 얻지 못하였다.
반면에, GlobalFilerTM PCR 증폭키트 및 PowerPlex® 퓨전 시스템이 일부 좌위의 STR 대립유전자형 분석에 실패한 현장 시료 DNA를 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 분석한 결과, 7개 좌위 모두에서 STR 대립유전자형을 식별할 수 있었다(도 5c 참조). 한편, 이러한 STR 대립유전자형 분석 결과는 D13S317과 FGA 좌위를 통한 비교를 통해 GlobalFilerTM PCR 증폭키트 및 PowerPlex® 퓨전 시스템의 STR 대립유전자형 분석 결과와 일치하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트는 GlobalFilerTM PCR 증폭키트 및 PowerPlex® 퓨전 시스템에서 분석에 실패한 좌위(각각 5개 좌위)의 STR 분석이 가능하였고, 공통적으로 분석되는 2개의 좌위에 대한 STR 분석 결과는 GlobalFilerTM PCR 증폭키트 및 PowerPlex® 퓨전 시스템의 STR 분석 결과와 일치하였다.
상기와 같은 실험결과에 입각할 때, 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트는 현재 상용되고 있는 GlobalFilerTM PCR 증폭키트와 PowerPlex® 퓨전 시스템이 DNA 분해 정도에 따라 식별하지 못하는 좌위들의 미니 STRs을 식별하여 종래기술의 부족한 식별력을 추가적으로 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 미니 STR 멀티플렉스 PCR 키트는 DNA 분해 정도에 따라 식별하지 못하는 좌위의 STR을 식별하여 STR 분석 성공률을 향상시킴으로써, 보다 많은 DNA 정보를 제공하고, 나아가 데이터베이스 수록 확대 및 신원확인 성공률 향상 등 보다 효율적인 DNA 감정에 기여할 수 있으며, 더 나아가서는 과학수사 결과의 신뢰도를 높일 수 있는 동시에 범죄현장의 재구성에 단서를 제공함으로써 범죄의 해결에 기여할 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
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<120> Multiplex PCR Kit for identifying human genotype profile using
new combination of mini STRs and method for identifying human
genotype profile using the same
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<160> 16
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<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSF1PO forward primer
<400> 1
tgctaaccac cctgtgtctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSF1PO reverse primer
<400> 2
tcctgtgtca gaccctgttc 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D7S820 forward primer
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cgattccaca tttatcctca ttgac 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D7S820 reverse primer
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ggctgactat ggagttattt taagg 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TPOX forward primer
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TPOX reverse primer
<400> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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aatgccccat aggttttgaa ct 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGA reverse primer
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gatttgtctg taattgccag ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amelogenin forward primer
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ccctgggctc tgtaaagaat ag 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 10
atcagagctt aaactgggaa gc 22
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<211> 20
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agaggccctt gtcagtgttc 20
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<211> 21
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<400> 12
ttcctactgg cccataatcc a 21
<210> 13
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<400> 13
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<213> Artificial Sequence
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<400> 15
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<210> 16
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<223> SE33 reverse primer
<400> 16
caacatctcc cctaccgcta 20
Claims (9)
- 미니 STR(mini short tandem repeat) 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트에 있어서,
CSF1PO 좌위의 STR(short tandem repeat) 영역을 특이적으로 증폭하여 CSF1PO 좌위의 미니 STR(mini STR) 증폭산물을 생성하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과,
D7S820 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 D7S820 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍과,
TPOX 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 TPOX 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍과,
FGA 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 FGA 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍과,
D2S1338 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 D2S1338 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍과,
D13S317 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 D13S317 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍과,
SE33 좌위의 STR 영역을 특이적으로 증폭하여 SE33 좌위의 미니 STR 증폭산물을 생성하는 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍을 포함하되,
단일 증폭 과정을 통해, 상기 CSF1PO 좌위, 상기 D7S820 좌위, 상기 TPOX 좌위, 상기 FGA 좌위, 상기 D2S1338 좌위, 상기 D13S317 좌위, 그리고 상기 SE33 좌위의 STR 영역에 대한 PCR 증폭산물의 크기가 330 bp 미만인 것을 특징으로 하는, 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트. - 제1항에 있어서,
성별을 구별하는 아멜로제닌(Amelogenin) 좌위를 특이적으로 증폭하는 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍을 더 포함하는, 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트. - 제2항에 있어서,
DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함하는, 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트. - 제3항에 있어서,
서열번호 1의 프라이머의 5'말단 및 서열번호 3의 프라이머의 5'말단에는 제1 표지물질이 표지되고, 서열번호 5의 프라이머의 5'말단 및 서열번호 7의 프라이머의 5'말단에는 제2 표지물질이 표지되며, 서열번호 9의 프라이머의 5'말단, 서열번호 11의 프라이머의 5'말단 및 서열번호 13의 프라이머의 5'말단에는 제3 표지물질이 표지되며, 서열번호 15의 프라이머의 5'말단에는 제4 표지물질이 표지되는 것을 특징으로 하는, 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트. - 제4항에 있어서,
상기 제1 표지물질, 상기 제2 표지물질, 상기 제3 표지물질 및 상기 제4 표지물질은 서로 다른 파장에서 검출되는 형광물질인 것을 특징으로 하는, 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트. - 제5항에 있어서,
서로 다른 파장에서 검출되는 형광물질로 표지된 미니 STR 증폭산물들을 분광학적 기법으로 구별하여 한번의 검사로 복수 개의 STR 대립유전자형을 동시에 분석하는 것을 특징으로 하는, 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트. - 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 미니 STR 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 멀티플렉스 PCR로 증폭하는 단계와,
멀티플렉스 PCR 결과에 기초하여 CSF1PO 좌위, D7S820 좌위, TPOX 좌위, FGA 좌위, D2S1338 좌위, D13S317 좌위 및 SE33 좌위에 각각 대응하는 STR 대립유전자형을 결정하는 단계를 포함하되,
단일 증폭 과정을 통해, 상기 CSF1PO 좌위, 상기 D7S820 좌위, 상기 TPOX 좌위, 상기 FGA 좌위, 상기 D2S1338 좌위, 상기 D13S317 좌위, 그리고 상기 SE33 좌위의 STR 영역에 대한 PCR 증폭산물의 크기가 330 bp 미만인 것을 특징으로 하는, 미니 STR 조합을 이용하는 인간 유전자 감식방법. - 제7항에 있어서,
아멜로제닌(Amelogenin) 좌위에 대한 XX형 또는 XY형 분석에 의해 남녀 성별을 구별하는 것을 특징으로 하는, 미니 STR 조합을 이용하는 인간 유전자 감식방법. - 제8항에 있어서,
서로 다른 파장에서 검출되는 형광물질로 표지된 미니 STR 증폭산물들을 분광학적 기법으로 구별하여 한번의 검사로 복수 개의 STR 대립유전자형을 동시에 분석하는 것을 특징으로 하는, 미니 STR 조합을 이용하는 인간 유전자 감식방법.
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| KR1020200090456A KR102446162B1 (ko) | 2020-07-21 | 2020-07-21 | 새로운 미니 ｓｔｒ 조합을 이용한 인간 유전자 감식에 사용되는 멀티플렉스 ｐｃｒ 키트 및 이를 이용한 인간 유전자 감식방법 |
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| Forensic Sci Int Genet.,19:148-155(2015.7.19.)* |
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