KR102074959B1 - 듀얼 멀티플렉스 시스템을 이용한 인간 객체의 str 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 듀얼 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 분석대상의 인간 객체의 STR 분석 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 듀얼 멀티플렉스 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용하여 24개 STR 유전좌위들(short tandem repeat loci)를 등시에 증폭하여 분석함으로써 신속하고 높은 정확도로 유전자 감식을 할 수 있는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석방법은 인간 유전자 감식에 있어서, 수입제품에 의존도가 100%인 상황에서, 높은 재현성 및 정확도로 유전자 감식이 가능하여 개인식별, 혈족 확인에 있어서 유용하다.
Description
본 발명은 듀얼 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 분석대상의 인간 객체의 STR 분석 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 듀얼 멀티플렉스 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용하여 24개 STR 유전좌위들(short tandem repeat loci)를 등시에 증폭하여 분석함으로써 신속하고 높은 정확도로 유전자 감식을 할 수 있는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다.
개인식별이나 혈연관계 여부 확인을 위한 유전자감정은 중합효소연쇄반응(PCR; Polymerase Chain Reaction) 이용을 기본으로 한 방법이 본격적으로 사용되고 있으며, 이러한 원리는 범죄 사건 등에 법의학적 타이핑이나 DNA 신원 확인 정보와 같은 DNA 데이터베이스 구축하는데 활용되고 있다. 인간 DNA 내에 어떤 형질 등을 나타내는 유전 정보를 담고 있지 않은 인트론(intron) 내에 다양하게 존재하는 것으로 알려진 짧은 반복 염기 서열(Short Tandem Repeat sequence)들은 유전자 감정의 마커로서 전 세계적으로 유용하게 사용되고 있으며 많은 유전자좌가 이러한 다형성을 갖는 STR 부위를 가지고 있다. STR 부위는 2개에서 7개의 염기 서열이 반복되는 구조로 되어 있는데, 특정 좌위에서의 짧은 반복 배열 수가 다름에 따라 이 좌위에서의 DNA 길이가 각 대립 형질(allele)에 따라 다르고 개인에 따라 고유의 대립 형질 갖게 된다. 따라서 이러한 특정 유전자좌의 STR 반복수(대립 형질)에 따라 개인식별이 가능하다. 또한, 인간의 성별을 식별하기 위하여 성염색체 아멜로게닌 좌위가 사용될 수 있다. 아멜로게닌 좌위는 유전자 은행(GenBank)에서 남성 DNA에 존재하는 Y 염색체 상의 좌위를 확인하는 경우 HUMAMELY로서 여성 DNA에 존재하는 X 염색체 상의 좌위를 확인하는 경우 HUMAMELX 로서 확인된다.
한편, 멀티플렉스 PCR 시스템은 한번의 PCR 반응으로 여러 유전좌위들(loci)의 프라이머를 넣고 한 튜브 내에서 실험반응을 수행하는 것으로서, 멀티플렉스 PCR 시스템을 사용하게 되면 감정인력 및 분석에 사용되는 taq 폴리머라아제(PCR 반응효소) 등 각종의 시약류의 절감 효과와 함께 유전자형 모세관 자동분석기의 가동을 최소화시켜 비용을 줄일 수 있는 큰 장점이 있다. 유전자감식에는 상용화된 고가의 반응시약류들이 소모되는 것을 감안할 때 예산상의 절감효과도 상당히 거둘 수 있는 장점을 지니고 있다. 이렇듯 멀티플렉스 PCR 시스템이 가지는 인력, 예산 면에서의 효용가치로 인하여 유전자감식을 선도하는 영국, 미국을 비롯한 선진국가에서는 자국의 현실에 맞는 멀티플렉스 PCR 시스템을 확립하려는 연구가 활발히 이루어져 왔다.
프로메가(Promega Corporation, Madison, Wi, 미국)에서 상용 시판되고 있던 트리플렉스 PCR 키트(I, Ⅱ)에 근거하여 초기에는 트리플렉스 PCR 시스템 위주의 연구 개발이 활발히 이루어져 왔다(Kimpton et al.,1993; Urquhart et al., 1994). 그러나 4가지 유전좌위를 동시에 분석하는 콰드루플렉스 시스템(Sprecher et al., 1996 ; Lins et al., 1996 ; Robertson J.M et al., 1995)도 개발하기에 이르렀으며 현재는 그 이상의 유전좌위를 동시에 수행하는 멀티플렉스도 많은 연구가 이루어져 왔다(Kimpton et al., 1996; Evett et al.,1997).
최근 Thermofisher 사는 D3S1358, VWA, D16S539, CSF1PO, TPOX, Yindel, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, DYS391, D2S441, D19S433, TH01, FGA, D22S1045, D5S818, D13S317, D7S820, SE33, D10S1248, D1S1656, D12S391, 및 D2S1338를 포함하는 24개 유전좌위의 동시 증폭 및 4색 검출 방법을 개발하였다(Globalfiler).
또한, 프로메가사는 D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, Amelogenin, VWA, D8S1179, TPOX, 및 FGA를 포함하는 16개 유전좌위의 동시 증폭 및 4색 검출 방법을 개발하였다(Powerplex 16).
이러한 멀티플렉스 PCR 시스템의 지속적인 개발성과는 DNA 데이터베이스(DNA intelligence database)의 설립 및 운용에 박차를 가할만한 획기적인 성과였다. 영국의 경우 1995년부터 대상자들의 입력을 시작한 이래로 2013년 3월 현재 6,700,000명 이상의 데이터를 보유하고 있으며 이 데이터베이스를 통하여 범인을 찾아낸 케이스는 평균 1주당 300건 이상의 범인을 색출해 내는 성과를 거두고 있다. 미국의 경우 과거 각 주 단위로 실시해 오던 데이터베이스는 미연방수사국(FBI)이 관리하는 CODIS(Combined DNA Index 시스템)을 이용하여 연방 전체의 국립 DNA 데이터베이스를 구축 통합하여 2013년 10월 현재 12,300,000명 이상의 대상자를 입력하여 매우 효율적으로 운용되고 있는 것으로 알려졌다. 그 외의 네덜란드 1996년, 오스트리아, 독일 1997년 또는 1998년 초에 대상자의 입력을 시작하여 현재 입력이 활발하게 이루어지고 상당한 효과를 거두고 있는 것으로 알려지고 있다. 한국에서도 2010년 8월 “DNA 신원확인 정보의 이용 및 보호에 관한 법률”이 발효되어 2014년 현재 173,024명의 대상자를 입력하였으며, 2014년 현재 4,252건의 사건을 해결하는데 결정적인 증거로 사용되었다고 알려져 있다.
현재 한국에서 널리 사용되고 있는 체세포 염색체 STR 증폭 방법 역시 외국회사에서 제조, 판매하고 있는 상용 키트이다. 이는 1990년대 후반 PCR에 의한 STR 분석법 개발을 주도하였던 미국, 영국에서 개발된 STR 마커들을 해당 국가의 회사들이 인수해 키트로 상용화하였기 때문이다. 특히 범죄자 DNA 데이터베이스가 세계적으로 일반화되면서 국가 간의 DNA 정보 교환을 위해 모든 국가가 공통적인 STR 마커를 포함하여 사용할 것이 권유되었고 이에 따라 후발국들은 모두 해당 STR 마커들을 광범위하게 포함하고 있는 상용화 키트를 사용하게 되었다.
또한 위와 같은 상용화 키트는 편리하다는 장점도 있지만 외국회사의 기술에 의존하게 되는 단점을 지니고 있다. 실제로 이들 키트를 생산하는 회사는 앞서 살펴본 바와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 社와 프로메가社가 주요 회사이며 이들 회사에서 10여 종의 상용 키트들이 생산 판매되고 있다. 세계시장을 독점하다시피한 이들 두 회사의 키트 가격은 매우 비싼 편으로 유전자 감식 비용의 큰 부분을 차지하고 있는 실정이다.
본 발명과 관련된 한국 선행 특허는 KR 10-1672240, KR 10-1667526, KR 10-0277289, KR 10-1008828, KR 10-1414827, KR 10-1533792, KR 10-1457983, KR 10-0443569, KR 10-1341943, KR 10-1716108, KR 10-1198096, KR 10-2010-0081968 및 KR 10-2009-0111407이 있으며, 외국 선행 특허는 US 2012/0309637, US 9,090,943, US 9,797,841, 및 EP1135530 등이 있다.
이에 본 발명자들은 민감도와 정확성이 높은 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 16개좌의 STR 유전좌 및 9개좌의 STR 유전좌를 듀얼 멀티플렉스 시스템으로 증폭할 경우, 추가적인 형광염료의 사용 없이 기존의 기계로 분석이 가능하면서 샘플의 유전정보를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 24개 유전좌를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은
(a) 인간 객체 DNA 시료를 D8S1179, CSF1PO(Human c-fms protooncogene for CSF-1 receptor gene), D3S1358, D2S1338, 아멜로제닌(Amelogenin), vWA(von Willebrand factor A), TH01, D18S51, D5S818, D21S11, TPOX(Human thyroid peroxidase gene), FGA(Human fibrinogen alpha chain), D13S317, D7S820, D16S539 및 D19S433를 포함하는 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제1프라이머 세트; 및 아멜로제닌, SE33, D1S1656, Penta D, D22S1045, D10S1248, D12S391, D2S441 및 Penta E를 포함하는 유전자 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제2프라이머 세트와 각각 독립적으로 반응시켜 증폭 시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭 산물을 이용하여 상기 유전좌위의 대립유전자형을 결정하는 단계; 를 포함하는 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석방법을 제공한다.
본 발명은 또한, D8S1179, CSF1PO(Human c-fms protooncogene for CSF-1 receptor gene), D3S1358, D2S1338, 아멜로제닌(Amelogenin), vWA(von Willebrand factor A), TH01, D18S51, D5S818, D21S11, TPOX(Human thyroid peroxidase gene), FGA(Human fibrinogen alpha chain), D13S317, D7S820, D16S539 및 D19S433를 포함하는 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제1프라이머 세트; 및 아멜로제닌, SE33, D1S1656, Penta D, D22S1045, D10S1248, D12S391, D2S441 및 Penta E를 포함하는 유전자 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석방법은 인간 유전자 감식에 있어서, 수입제품에 의존도가 100%인 상황에서, 높은 재현성 및 정확도로 유전자 감식이 가능하여 개인식별, 혈족 확인에 있어서 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 듀얼 멀티플렉스 시스템에서 분석하는 유전좌의 위치를 형광 마커별로 표시한 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 듀얼 멀티플렉스 시스템에서 제1 프라이머 세트를 이용한 샘플 분석 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 듀얼 멀티플렉스 시스템에서 제2 프라이머 세트를 이용한 샘플 분석 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 듀얼 멀티플렉스 시스템에서 제1 프라이머 세트를 이용한 샘플 분석 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 듀얼 멀티플렉스 시스템에서 제2 프라이머 세트를 이용한 샘플 분석 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서의 용어 'STR'은 인간 게놈(genome) 내의 어떤 형질 등의 유전정보를 담고 있지 않은 인트론(intron) 내에 널리 분포한 것으로 알려진 반복염기서열(tandem repeat sequence)들은 유전자 감정의 마커(marker)로서 범세계적으로 유용하게 사용되고 있다. 인간의 게놈에서 많은 유전좌위가 다형성의 STR 부위를 함유하고 있다. STR 좌위는 길이가 2 내지 7개의 염기쌍인 짧은 반복 서열 요소로 구성되어 있는데, 인간의 게놈에는 매 15 kb마다 한 번씩, 2백 만개의 삼량체 및 사량체 STR이 존재하는 것으로 추정된다. 특정 좌위에서의 짧은 반복 배열 단위의 수가 변함에 따라, 이 좌위에서의 DNA 길이가 각 대립 형질(allele) 및 각 개인에따라 변하게 된다. STR 좌위는 이 반복 배열의 측부에 동정되어 있는 특정 프라이머 서열을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR)을 통해 증폭시킬 수 있다.
이러한 유전좌위의 대립 형질들은 증폭된 부위 내에 함유되어 있는 반복 서열의 복제수(the number of copy)에 따라 구분되며, 전기 영동법으로 분리한 후, 방사성, 형광, 실버 스테인 및 색채 등 적당한 검출 방법을 사용하여 식별한다.
본 발명에서 용어 '증폭'은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), WO 89/06700 및 EP 329,822의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR, WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; MA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR, 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA, 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, D-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), DL-PCR(PC), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
상기 멀티플렉스 증폭은 멀티플렉스 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 57-61℃의 어닐링(annealing) 온도 조건을 갖고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 58-60℃의 어닐링 온도 조건을 가지며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 58.5-59.5℃의 어닐링 온도 조건을 갖는다.
상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 PCR을 실시하는 데 적정한 싸이클 수가 요구된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 27-29 싸이클로 실시한다. 본 발명의 멀티플렉스 PCR 증폭을 26 싸이클 이하로 실시하는 경우에 500 RFU 이하의 피크들이 형성되었고, 30 싸이클에서는 2,000 RFU 이상의 피크가 형성되었지만 노이즈가 증가하고 불완전한 A 삽입이 발생하여 적합하지 않다.
본 발명에서 용어 '듀얼 멀티플렉스 시스템'은 하나의 샘플에서 수득한 핵산 시료를 각각의 독립된 프라이머 세트를 이용하여, 멀티플렉스 시스템을 동시에 2회 이상 수행하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 '프라이머(primer)'는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드트리포스페이트 및 중합 반응 효소 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분한 것으로 해석된다. 이러한 프라이머의 디자인은 주형이 되는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들어, 프라이머 디자인용 프로그램(예를 들어, PRIMER 3, VectorNTI 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 발명에서는 STR 유전좌의 위치를 듀얼 멀티플렉스 시스템을 이용하여 분석할 경우, 형광염료를 추가로 사용하지 않으면서 분석 민감도와 정확도가 증가하는 지를 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 인간 객체 DNA 시료를 D8S1179, CSF1PO(Human c-fms protooncogene for CSF-1 receptor gene), D3S1358, D2S1338, 아멜로제닌(Amelogenin), vWA(von Willebrand factor A), TH01, D18S51, D5S818, D21S11, TPOX(Human thyroid peroxidase gene), FGA(Human fibrinogen alpha chain), D13S317, D7S820, D16S539 및 D19S433으로 구성된 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제1프라이머 세트; 및 아멜로제닌, SE33, D1S1656, Penta D, D22S1045, D10S1248, D12S391, D2S441 및 Penta E로 구성된 유전자 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제2프라이머 세트와 각각 독립적으로 반응시켜 증폭을 실시한 다음, 각 유전좌의 대립유전자형을 결정하여 감식한 결과, 높은 민감도와 정확도로 인간 객체의 유전자를 감식할 수 있음을 확인하였다(도 2, 3).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 인간 객체 DNA 시료를 D8S1179, CSF1PO(Human c-fms protooncogene for CSF-1 receptor gene), D3S1358, D2S1338, 아멜로제닌(Amelogenin), vWA(von Willebrand factor A), TH01, D18S51, D5S818, D21S11, TPOX(Human thyroid peroxidase gene), FGA(Human fibrinogen alpha chain), D13S317, D7S820, D16S539 및 D19S433를 포함하는 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제1프라이머 세트; 및 아멜로제닌, SE33, D1S1656, Penta D, D22S1045, D10S1248, D12S391, D2S441 및 Penta E를 포함하는 유전자 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제2프라이머 세트와 각각 독립적으로 반응시켜 증폭 시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭 산물을 이용하여 상기 유전좌위의 대립유전자형을 결정하는 단계; 를 포함하는 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 각 STR좌를 증폭할 수 있고, GC 비율이 40 내지 60% 범위를 유지하며, 종열반복 배열이 없는 유전자 서열과 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1프라이머 세트는 서열번호 1 내지 32의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2프라이머 세트는 서열번호 33 내지 50의 염기서열로 표시되는 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 증폭산물은 80 내지 400bp인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자의 크기를 크기 표준물(size standard)과 비교/평가하여 실시하며, 상기 크기 표준물은 DNA 마커 또는 유전좌위-특이적 대립유전자 래더인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 시료는 혈액, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 분리된 DNA 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액, 모발, 타액, 소변, 구강세포 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 인간 객체의 유전자 감식은 대립유전자형을 결정하고, 이를 대조군과 비교하여 객체의 유전자 형을 결정하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 방법으로 범죄 현장에서 발견된 혈액 샘플 내의 DNA의 유전자 감식을 수행할 경우, 결정된 대립유전자형이 범죄자 인터페이스에 존재하는 지 여부를 판단하여, 용의자를 특정할 수 있으며, 친자확인에 이용할 경우, 샘플 객체의 대립유전자형을 결정하고 이를 친부 또는 친보의 대립유전자형을 대조군으로 비교하여 친자 여부를 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 제1프라이머 세트 및 제2프라이머 세트는 형광염료로 표지되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 서열번호 1 내지 8 및 서열번호 33 내지 34의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트는 제1형광염료로 표지되고, 상기 서열번호 9 내지 16 및 서열번호 35 내지 40의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트는 제2형광염료료 표지되며, 상기 서열번호 17 내지 24 및 서열번호 41 내지 46의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트는 제3형광염료로 표지되고, 상기 서열번호 25 내지 32 및 서열번호 47 내지 50의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트는 제4형광염료로 표지되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 유전자 감식 방법에 이용되는 프라이머는 유전좌위에 상보적으로 결합하는 한 쌍의 프라이머 중 하나의 프라이머의 5'말단에 형광염료가 표지된다. 상기 제1형광염료 내지 제4형광염료는 모세관 전기영동을 통해 검출할 수 있도록 한 레인에 3 내지 4개의 유전좌위를 배치하는 구성하기 위한 표지이다.
본 발명에 있어서, 상기 형광염료는 6-FAM, VIC, NED, PET, ROX, HEX, dR110, dR6G, dTAMRA 및 dROX로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 유전자 감식 방법에 이용되는 프라이머는 피크 균형을 맞추기 위한 최적의 배합비를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1프라이머 세트에서 D8S1179 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 1.0-5.0μM의 최종 농도를 가지고, CSF1PO 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, D3S1358 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, D2S1338 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지고, Amelogenin 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, vWA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 1.0-5.0μM의 최종 농도를 가지고, TH01 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, D18S51 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, D5S818 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 1.0-5.0μM의 최종 농도를 가지고, D21S11 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 5.0-20.0μM의 최종 농도를 가지고, TPOX 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, FGA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지고, D13S317 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 2.0-8.0μM의 최종 농도를 가지고, D7S820 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지고, D16S539 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 2.0-8.0μM의 최종 농도를 가지고, D19S433 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지며, 제2프라이머 세트에서 SE33 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, Amelogenin 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, D1S1656 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, Penta D 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, D22S1045 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, D10S1248 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지고, D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지고, D2S441 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.1-2.0μM의 최종 농도를 가지고, Penta E 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-3.0μM의 최종 농도를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자를 분리(separate)하기 위한 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 실시한다.
전기영동은 분산된 공간적으로 동일한 전기장의 영향 하에 입자의 움직임의 흐름에 관한 것이다(Lyklema, J. (1995). Fundamentals of Interface and Colloid Science. vol. 2. p. 3.208; Hunter, R.J. (1989). Foundations of Colloid Science. Oxford University Press; Dukhin, S.S.; B.V. Derjaguin (1974). Electrokinetic Phenomena. J. Willey and Sons; Russel, W.B.; D.A. Saville and W.R. Schowalter (1989). Colloidal Dispersions. Cambridge University Press; Kruyt, H.R. (1952). Colloid Science. Volu El1, Irreversible systems. Elsevier 및 Dukhin, A.S.; P.J. Goetz (2002). Ultrasound for characterizing colloids. Elsevier). 전기영동의 종류로는 친화성 전기영동(Affinity electrophoresis), 모세관 전기영동(Capillary electrophoresis) 및 겔 전기영동(Gel electrophoresis) 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자를 분리하기 위한 모세관 전기영동을 이용하여 실시한다. 상기 모세관 전기영동은 전하를 띄고 있는 이온들에 전기장을 걸어주어 각 이온들은 반대전하를 띤 전극으로 이동하는 데 이때의 이동속도는 각 이온들의 평균 전하, 크기, 모양, 용매의 성질에 따라 달라진다. 모세관 전기영동은 이온들이 가느다란 관을 통하여 존재하도록 한 상태에서 관의 양끝에 전기장을 걸어 줄 때 이온들이 관내에서 그들의 성질에 따라 각기 다른 속도로 일정한 방향성을 가지면서 이동하는 성질을 이용하여 물질을 분리하는 장치이다.
본 발명은 다른 관점에서, D8S1179, CSF1PO(Human c-fms protooncogene for CSF-1 receptor gene), D3S1358, D2S1338, 아멜로제닌(Amelogenin), vWA(von Willebrand factor A), TH01, D18S51, D5S818, D21S11, TPOX(Human thyroid peroxidase gene), FGA(Human fibrinogen alpha chain), D13S317, D7S820, D16S539 및 D19S433를 포함하는 유전좌위 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제1프라이머 세트; 및 아멜로제닌, SE33, D1S1656, Penta D, D22S1045, D10S1248, D12S391, D2S441 및 Penta E를 포함하는 유전자 각각을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 제2프라이머 세트를 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 반응 완충액, DNA 중합 효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물)를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 중합 효소는 예를 들어, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합 효소일 수 있다. 또한, 반응 완충액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물로서, 이러한 완충 용액들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Tris, Tricine, MOPS, 또는 HEPES일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 이 외에도, 상기 키트는 필요에 따라, DNA 중합 효소 조인자를 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 시료에서 DNA 샘플 수득
시료가 모근 또는 구강상피세포일 경우에는 하기의 방법으로 DNA 샘플을 수득하였다(E-Prep DNA extraction solution, Viagen Biotech):
시료에 E-Prep Solution(Viagen Biotech) 100-200μl를 첨가한 다음, Porteinase K(20mg/ml, Sigma Aldrich) 10μl를 첨가한 뒤, 섞어 원심분리를 수행한 다음, 튜브 기벽에 모인 시료를 모은 후 63℃ 항온 수조에서 20분간 배양하고, 다시 85℃ 항온수조에서 15분간 배양한 뒤, 13,000rpm/min으로 4분간 원심 분리하여 상등액 50-100μl를 회수하였다.
시료가 모근, 구강 상피세포가 아닌 경우에는 하기의 방법으로 DNA 샘플을 수득하였다(Qiagen human genomic DNA extraction kit, Qiagen, USA):
시료에 ATL buffer(Qiagen, USA) 350-400μl를 주입한 다음, 56℃ 항온수조에서 1시간 배양하고, 상등액 전체를 회수하여 다른 튜브에 옮겨 담은 후, AL buffer(Qiagen, USA 350-400μl를 첨가한 다음 70℃ 항온수조에서 10분간 배양한 후, 100% 에탄올 200μl를 첨가하였다. 상기 용액을 column에 넣어 13,000rpm 으로 1분간 원심분리하여 collection tube에 담긴 용액은 버리고 column에 AW1 buffer 650μl를 첨가한 뒤, 13,000rpm 으로 1분간 원심분리한 뒤, collection tube에 담긴 용액을 버린 다음, 상기 과정을 2회 반복하였다. 세척된 column을 1.5ml 튜브에 끼운 다음, 3차 증류수 20μl를 첨가하고 상온에서 5분간 배양한 뒤, 13,000rpm으로 1분간 원심부리하여 최종 genomic DNA를 수득하였다.
실시예 2. 듀얼 멀티플렉스 시스템을 이용한 STR 유전좌 증폭
D18S1179, CSF1PO, D3S1358, D2S1338, Amelogenin, vWA, TH01, D18S51, D5S818, D21S11, TPOX, FGA, D13S317, D7S820, D16S539, D19S433 16개 STR 유전자 좌위들과 SE33, Amelogenin, D1S1656, Penta D, D22S1045, D10S1248, D12S391, D2S441, Penta E의 9개 STR 유전자 좌위들에 각각 대응되는, 형광물질로 표지된 프라이머들을 포함하는 듀얼 멀티플렉스 PCR 시스템을 사용하여 DNA 샘플 내 서열을 PCR 증폭하였다.
PCR 반응물은 20μl를 기준으로 2X PCR master mix(Qiagen, USA) 10μl, 시료 DNA 1-10ng, 10X 프라이머 세트 2μl, DW 나머지의 부피로 제작하였으며, DNA 샘플의 최소 검출 한계치는 0.5~1 ng으로 법의학적 시료들의 특성상 극미량의 검체에 해당하는 프로필도 본 키트를 사용해 검출할 수 있는 민감도를 갖는 것을 확인하였다.
각 프라이머 세트별 서열 정보 및 증폭산물 크기는 하기 표 1/2와 같다.
듀얼 멀티플렉스 PCR 반응은 하기의 조건으로 수행하였다.
Veriti Thermal Cycler (ABI, USA) 혹은 이에 상응하는 성능을 지닌 기기
(1) 초기반응(predenaturation): 95 ℃ 11분
(2) 증폭반응(denaturation, amplification, extension): 30회 사이클링
95 ℃ 1분 → 60 ℃ 1분 → 72 ℃ 1분
(3) 최종연장(Final extension): 60 ℃ 60분
(4) 냉각(Chilling): 4 ℃ 지속
실시예 3. STR 유전좌 결정
3130XL Genetic Analyzer (ABI, USA), 3730XL Genetic Analyzer (ABI, USA) 및 3500 or 3500XL Genetic Analyzer (ABI, USA)를 이용하여 모세관(capillary) 전기영동을 이용하여 증폭산물의 크기를 결정하였다.
실시예 2에서 수득한 증폭 산물 1μl와 본 발명에서 제작한 allelic ladder 1μl를 준비한 다음, Hi-Di formamide 9.3μl와 GeneScan-500 LIZ(ABI, USA) 0.05μl를 혼합하고, 상기 증폭 산물 및 래더를 각각 첨가하고 95℃에서 3분간 denaturation 시킨 후, 상기 혼합물을 분석 장비의 모세관에 주입하고, 전기영동에 의해 전개가 완료된 증폭산물을 GeneMapper ID v3.2(ABI, USA) 또는 GeneMApper ID-X(ABI, USA)를 이용하여 래더를 기반으로 크기를 결정하였다.
그 결과 도 2 및 3에 개시된 바와 같이 특정 샘플에 대한 STR 유전좌위를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. DNA Allelic Ladder 제작
본 발명은 검체 DNA에 형광 표지된 PCR 프라이머 세트(중합효소연쇄반응 시발체 세트)를 이용하여 형광이 부착된 검체 DNA 사본을 대량 증폭하고 이렇게 증폭된 DNA를 DNA 염기서열 분석기(DNA sequencer, Genetic analyzer)를 이용하여 분석하는 방법이기 때문에, 증폭된 형광 표지 DNA의 정확한 base-pair의 수를 얻기 위해서는 실험적 오차를 보정해주는 base-pair 표지자(size standard)가 필요하다.
이를 DNA allelic ladder라고 하며 모든 STR 키트에는 각 키트에 적합한 DNA allelic ladder가 필요하며 DNA allelic ladder는 키트의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 STR 검색에 사용된 임상검체로부터 homogenous STR을 선별하고, 선별된 STR을 PCR 증폭하여 PCR 증폭산물을 운반체 플라스미드(vector plasmid)에 DNA 클로닝(cloning)하여 allelic ladder library를 제작하였다. Allelic ladder library에서 STR의 각 base-pair 크기에 알맞게 PCR하여 그 산물들을 혼합하여 각 peak balance를 맞추기 위한 농도 조절 과정을 거쳐 제작 완료하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 구체적인 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> NGeneBio
<120> Method for Analysing Human Subject STR loci by using Dual
Multiplex System and Kits using Thereof
<130> P17-B071
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 1
cacacggcct ggcaacttat 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 2
tcctgtagat tattttcact gtgg 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 3
caaggactag caggttgcta a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 4
gtgcacactt ggacagcatt t 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 5
ctataatccc aggtacttgg ga 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 6
ggtgtgtatt ccctgtgcct 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 7
tcctagcact tagaactgtt tctt 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 8
agacttcatg gtcctgacta ca 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 9
acccctttga agtggtacca 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 10
gcatgcctaa tattttcagg gaat 24
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 11
taagaataat cagtatgtga cttgga 26
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 12
ggacagatga taaatacata ggatg 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 13
aaatgtgcca gggagcccaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 14
aggttctgag tgcccaagga 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 15
tctggtgtgt ggagatgtct ta 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 16
aattagttgg gcatggtggc a 21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 17
cctctttggt atccttacgt aatat 25
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 18
catttgtatc tttatctgta tccttattt 29
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 19
gtgagtcaat tccccaagtg aa 22
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 20
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tatcccaccc ctggatatta taa 23
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<212> DNA
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<220>
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<400> 50
catgattgat acatggaaag aattct 26
Claims (8)
- (a) 인간 객체 DNA 시료를 D8S1179, CSF1PO(Human c-fms protooncogene for CSF-1 receptor gene), D3S1358, D2S1338, 아멜로제닌(Amelogenin), vWA(von Willebrand factor A), TH01, D18S51, D5S818, D21S11, TPOX(Human thyroid peroxidase gene), FGA(Human fibrinogen alpha chain), D13S317, D7S820, D16S539 및 D19S433을 포함하는 유전좌위 각각을 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 1 내지 32의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성되는 제1프라이머 세트; 및 아멜로제닌, SE33, D1S1656, Penta D, D22S1045, D10S1248, D12S391, D2S441 및 Penta E를 포함하는 유전자 각각을 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 33 내지 50의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성되는 제2프라이머 세트와 각각 독립적으로 반응시켜 증폭 시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭 산물을 이용하여 상기 유전좌위의 대립유전자형을 결정난 단계; 를 포함하는 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 증폭산물은 80-400bp인 것을 특징으로 하는 증폭 산물
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자의 크기를 크기 표준물(size standard)과 비교하고 평가하여 실시하며, 상기 크기 표준물은 DNA 마커 또는 유전좌위-특이적 대립유전자 래더인 것을 특징으로 하는 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 시료는 혈액, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 분리된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- D8S1179, CSF1PO(Human c-fms protooncogene for CSF-1 receptor gene), D3S1358, D2S1338, 아멜로제닌(Amelogenin), vWA(von Willebrand factor A), TH01, D18S51, D5S818, D21S11, TPOX(Human thyroid peroxidase gene), FGA(Human fibrinogen alpha chain), D13S317, D7S820, D16S539 및 D19S433를 포함하는 유전좌위 각각을 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 1 내지 32의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성되는 제1프라이머 세트; 및 아멜로제닌, SE33, D1S1656, Penta D, D22S1045, D10S1248, D12S391, D2S441 및 Penta E를 포함하는 유전자 각각을 증폭할 수 있도록 설계된 서열번호 33 내지 50의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성되는 제2프라이머 세트를 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트
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