TWI614344B - 用以偵測突變的方法與引子組 - Google Patents

Abstract

在此揭示以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR)為基礎的方法，此方法可用以偵測樣本中目標基因之一所選區域中是否發生插入/缺失變異(相較於一參考序列)。目標基因具有一模板股與一密碼股。此方法運用包含一抑制引子以及一正向引子的引子組。所用的抑制引子與正向與子有部分序列重疊，但具有不同的熔點，且抑制引子的3’端經修飾而能夠防止抑制引子在PCR過程中延長。因此，在特定的PCR條件下，能偵測到PCR產物意味著在所選區域中發生了插入/缺失突變，而未偵測到PCR產物意味著在所選區域中並未發生插入/缺失突變。

Description

用以偵測突變的方法與引子組

本發明是關於用以偵測變異的方法與引子組。具體來說，本發明是關於插入和/或缺失變異的偵測。

基因突變(gene mutation)係指一特定基因或調控序列的核苷酸序列相較於天然(或正常)核苷酸序列有所改變。突變可以是點突變(point mutation；即，單一核苷酸置換)、一或多個核苷酸的缺失(deletion)或插入(insertion)、多個核苷酸的置換(substitution)或在染色體層級的互換(crossing-over)。

近年來，用以偵測點突變或染色體互換的技術發展迅速。舉例來說，可利用桑格式直接定序法(Sanger’s direct sequencing)來定序目標序列，以得知發生突變的一或多個核苷酸。然而此種直接定序的靈敏度不高，因而限制了此技術在臨床與研究領域等的應用。或者是可採用專一的引子和/或探針，以正向偵測目標序列上的點突變或互換。然而，運用上述方法來偵測插入突變與缺失突變的相關報導並不多見。傳統上，在設計用以偵測插入/缺失突變的引子或探針時，必須先知道突變部位的序列。當標的基因中帶有超過一個的插入和/或缺失核苷酸時，必須使用多個引子才能確保所有突變序列都能被偵測。此外，傳統方法極易發生偵測錯誤，部分是因為以引子或探針和標的基因進行 雜合(hybridization)時，突變部位可能形成環圈(looped out)，因此引子或探針仍可和具有突變核苷酸之標的基因發生非專一性的雜合(unspecific hybridization)。更有甚者，這些習知偵測方法之偵測靈敏度(detection sensitivity)通常較低，因而需要使用大量的去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid，簡稱DNA)和/或經過更多次的反應循環，使得整個反應耗時費力。在某些情形中，必須使用即時定量聚合酶連鎖反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，簡稱RTQ-PCR)和/或RTQ-PCR專用的設備才能夠進行偵測。因而，為了確保得到正確的偵測結果，習知方法可能需要花費較多時間或成本來優化反應參數。以上種種因素限制了這些技術在臨床試驗以及基礎研究等領域的應用。

有鑑於上述問題，相關領亟需提出一種能夠正確地偵測插入和/或缺失突變的方法。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明 的範圍。

本發明至少部分是基於一種新穎的引子設計方案，此種設計方案使得樣本中，帶有變異序列(相較於參考序列)的標的基因能夠被擴增，且因而能夠偵測到此種具有突變的標的基因。具體來說，所述標的基因具有模板股以及和此模板股互補的密碼股，而本發明提出的引子組及方法是針對該密碼股中一段選定區域來進行設計。此處所述的選定區域可能帶有或不帶有至少一變異核苷酸，此變異核苷酸可能是被插入到參考核苷酸序列中，或自參考核苷酸序列中被移除。於一實施例中，參考序列可為野生型(正常)序列，此時變異序列可帶有插入和/或缺失突變。或者是，參考序列可以是一種已知的突變序列，此時所謂的變異序列可以是野生型序列或任何其他突變序列。

有鑑於此，本發明的第一態樣是關於根據此引子設計方案的引子組。當可注意到，在根據此種方案設計特定引子組時，不需要事先知道經插入或刪除之序列(相對於參考序列)；不過，本發明當然亦可用來偵測已知的變異序列。相對應地，此處所教示的單一種引子組能夠偵測位於選定區域內的多種變異。因而，在本說明書中有時亦會將此處提出的能夠擴增這些突變序列的方法稱為通用插入/缺失聚合酶連鎖反應(universal insertion/deletion PCR，Unidel-PCR)或簡稱為「PCR」。

根據本發明一實施方式，可用於此處所述之PCR式方法的引子組包含一抑制引子及一正向引子。抑制引子經設 計能夠阻止參考序列在PCR過程中被擴增。為了達到此一目的，抑制引子的序列與密碼股之選定區域的參考序列以及緊接於密碼股之選定區域前的至少一核苷酸殘基相同，且抑制引子的3’端經修飾以防止該抑制引子於該PCR過程中被延長。正向引子的序列與位於密碼股選定區域上游(upstream)之多個核苷酸殘基相同，且正向引子3’端的至少最後一個核苷酸殘基與抑制引子5’端的至少第一個核苷酸殘基相同。

根據本發明另一實施方式，抑制引子3’端經過磷酸基(phosphate group)、磷酸酯(phosphate ester)、反向3’-3’連接(inverted 3’-3’linkage)、2’,3’-二去氧核苷(2’,3’-dideoxynucleoside)或3’去氧核苷(3’-deoxynucleoside)的修飾。

在非必要的實施方式中，正向引子的熔點(melting temperature，Tm)不同於抑制引子的熔點。根據某些實施方式，抑制引子與正向引子的熔點皆分別高於或等於50℃。在一非必要的實施方式中，抑制引子的熔點為約65-75℃，而正向引子的熔點為約50-60℃。

根據本發明另一實施方式，抑制引子的長度為10-100個核苷酸。根據本發明又一實施方式，正向引子的長度為10-30個核苷酸。根據本發明再一實施方式，正向引子3’端的至少最後5-10個核苷酸和抑制引子5’端的至少前5-10個核苷酸相同。

在一實施例中，選定區域的序列如序列編號：1所示， 抑制引子的序列如序列編號：2所示，且正向引子的序列如序列編號：3所示。在另一實施例中，選定區域的序列如序列編號：4所示，抑制引子的序列如序列編號：5所示，且正向引子的序列如序列編號：6所示。在又一實施例中，選定區域的序列如序列編號：7所示，抑制引子的序列如序列編號：8所示，且正向引子的序列如序列編號：9所示。

本發明的第二種態樣是關於一種用以偵測一樣本中標的基因之PCR式方法，其中上述標的基因的一選定區域內可能帶有或不帶有至少一變異核苷酸(相較於正常序列)，所述的標的基因具有模板股以及與該模板股互補的密碼股。下文的實驗結果顯示，本方法在偵測插入/缺失變異方面展現了極高的靈敏度(sensibility)。此外，本方法能夠偵測未知序列的此種插入或缺失型的變異核苷酸。

根據本發明一實施方式，此PCR式方法包含以下步驟。將帶有標的基因的樣本與根據本發明上述實施方式所述的引子組混合，以得到反應混合物。接著，對混合物進行PCR，其依序包含以下步驟：變性(denaturing)、黏合(annealing)與延長(extension)。在黏合步驟中，黏合溫度使得正向引子和抑制引子能夠彼此競爭而與模板股黏合。其後，決定經過PCR過程後是否得到PCR產物。在本實施方式中，當可偵測到PCR產物時，表示樣本中標的基因選定區域內有一或多插入或缺失變異；而當無法偵測到PCR產物時，表示樣本中標的基因選定區域內沒有插入或缺失變異。

根據本發明另一實施方式，混合物中抑制引子與正向引子的莫耳比為約1：1至10：1；且較佳為3：1至10：1。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。同時，在此處「至少一」以及「一或多」等詞彙當包含一、二、三或更多種。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施方式的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。 或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

「核苷酸」(nucleic acid)一詞在此處係指由雜環鹼基(heterocyclic base)、醣類(sugar)與一或多個磷酸基(phosphate group)所組成的化合物。最常見的核苷酸是以嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)的衍生物作為鹼基，而醣類則是五碳去氧核醣(pentose deoxyribose)或五碳核醣(pentose ribose)。常見的嘌呤有腺嘌呤(adenine，A)與鳥糞嘌呤(guanine，G)；而常見的嘧啶有胞嘧啶(cytosine，C)、胸腺嘧啶(thymine，T)與尿嘧啶(uracil，U)。「核苷酸序列」(nucleotide sequence)一詞在此係指在一單股核酸(nucleic acid)中的寡核苷酸(oligonucleotide)或聚核苷酸(polynucleotide)之核苷酸排序。除非另有說明，單股核苷酸序列的左手端為5'端；而右手端為3'端。「下游」(downstream)一詞係指位於所述核苷酸序列之3'方向的一核苷酸序列；而「上游」(upstream)一詞則是指位於 所述核苷酸序列之5'方向的一核苷酸序列。

在本說明書中，「目標基因」(target gene)一詞係指欲用以探究其「選定區域」(selected region)內是否帶有或不帶有插入/缺失變異的一種核苷酸序列。一般來說，目標基因為雙股DNA的形式，其係由一模板股(template strand)以及與該模板股互補的一密碼股(coding strand)所組成。根據本領域的習慣，密碼股的序列由5’至3’方向呈現(由左到右)；而模板股則是由3’至5’方向呈現(由左到右)。根據本發明之態樣與實施方式，抑制引子與正向引子經設計能夠和模板股中的一特定序列雜合(hybridize)或黏合(anneal)。

「參考序列」(reference sequence)一詞在此係指一種受到關注的特定序列。參考序列可以是「野生型」(wild-type)、「非突變」(non-mutated)或「正常」(normal)序列，這些序列中不帶有插入/缺失或其他突變。或者是，參考序列可以是一種突變的序列。

在此處，「變異」(variant)一詞係指一參考(reference)核酸分子的一或多個核苷酸發生了改變。當參考核酸分子是未經突變的野生型核酸分子時，變異序列可以是任何具有插入和/或缺失突變的突變序列。當參考序列是一種已知的突變序列時，變異序列包括野生型序列以及其他突變序列。

「插入變異」(insertion variant)一詞係指變異是由於在參考核酸分子中出現了一或多個額外的核苷酸；因此， 插入變異包含了插入突變。此外，基因剪接(gene splicing)序列也可視為插入突變，因為在DNA股中加入了額外的鹼基。「缺失變異」一詞則是指由參考核酸分子中移除一或多個核苷酸所導致的變異，且包括缺失突變。在本說明書中交替使用「插入和/或缺失變異」以及「插入/缺失變異」等用語可交替指稱插入變異或缺失變異或同時帶有插入與缺失兩種變異之情形。舉例來說，可將互換(crossing-over)序列視為包含插入突變與缺失突變的序列。。

「正向引子」(forward primer)在此係指一種單股核苷酸序列，其序列和欲複製的一單股核酸的序列相同。當正向引子處於適當的環境(如具有適當緩衝液、鹽類、溫度和/或pH值)下且環境中存有核苷酸以及用於核酸聚合的成分(如，DNA聚合酶(polymerase)或RNA聚合酶)，正向引子能夠作為一引子延長產物的合成起始點。具體來說，「正向引子」能夠和與密碼股5’端互補的序列雜合(或黏合)。在此處，「抑制引子」為單股核苷酸序列，其可和至少與選定區域5’端互補之序列雜合(或黏合)，且一如其名地，抑制引子不會起始(initiate)與之結合的核苷酸序列之擴增。

「雜合」一詞係指具有足夠互補性的二核苷酸序列經由華森-克李克(Watson-Crick)鹼基配對或其他非正規的配對而形成了複合物(complexes)或雜合體(hybrid)。雜合作用可能發生在兩股DNA之間、兩股RNA之間或一股 DNA與一股RNA之間。雜合作用會在相慣領域中習知的多種適當條件(如溫度、pH值、鹽類濃度等)下發生。

在此處，「擴增」(amplification)一詞係指能夠增加樣本中特定核苷酸序列含量的方法或過程。聚合酶連鎖反應(PCR)是相關領域熟知的擴增反應，下文將進一步詳述此處所用的PCR過程。在此處，「反應混合物」(reaction mixture)與「混合物」(mixture)等詞是用來指稱可用於後續聚合酶連鎖反應中的組成物。

參照第1圖來描述此處提出的引子設計方案，以利瞭解本發明之內容。當可注意到第1圖中所示的序列是為了說明本發明且僅為例示；因此申請專利範圍不受這些序列的限制。

如第1圖所示，標的基因是內皮生長因子受體外顯子19(epidermal growth factor receptor(EGFR)exon 19)，此標的基因的密碼股包含EGFR外顯子的第2214至2261個核苷酸，其序列為5’-TAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA-3’(序列編號：10)，而與密碼股互補的模板股包含以下序列3’-ATTTTAAGGGCAGCGATAGTTCCTTAATTCTCTTCGTTGTAGAGGCTT-5’(序列編號：11)。在本說明書的脈絡中，在模板股中選定了一區域以探究此選定區域中是否帶有或不帶有一或多插入/缺失變異。在本實施例中，密碼股中的選定區域之序列為TAAGAGAAGC(序列編號：1，即EGFR外顯子的第2240至2249個核苷酸)。

理論上，欲探究的選定區域的核苷酸長度並無特殊限制。根據本發明的非必要實施方式，選定區域最多可帶有99個核苷酸。舉例來說，選定區域的長度可為約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99個核苷酸。

為了偵測選定區域內的插入/缺失變異，設計了兩種引子(即，抑制引子及正向引子)，其分別可結合至模板股的不同但重疊部分。下文將詳細說明這兩種引子。

抑制引子

抑制引子的序列和密碼股之選定區域的參考序列以及緊接在該密碼股選定區域上游的至少一核苷酸殘基相同，因此在適當的雜合環境下，抑制引子可黏合至一與選定區域以及至少一相鄰核苷酸互補的序列。非必要地，抑制引子更包含緊接在密碼股選定區域上游的至少5至20個連續的核苷酸殘基。同樣非必要地，抑制引子可包含緊接在該選定區域下游的至少一核苷酸殘基。相似地，上述緊接在選定區域下游的核苷酸殘基可為至少5至20個核苷酸殘基。舉例來說，如第1圖所示，一例示的抑制引子之序列為CGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTC C(序列編號：2，選定區域以斜體標記)。如第1圖所示，此抑制引子包含了緊接在選定區域上游的15個連續核苷酸殘基(CGCTATCAAGGAAT)以及緊接在選定區域下游的9個連續核苷酸殘基(AACATCTCC)。本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可理解，由於此抑制引子涵蓋了整個所選 區域，當所選區域中沒有插入/缺失突變時，抑制引子可和密碼股形成相對較穩定的雜合體。相反地，當所選區域中帶有插入/缺失之核苷酸時，抑制引子和模板股在所選區域的部分會出現無法對齊(misalignment)的現象，而使得其中抑制引子或模板股其中之一形成環圈(loop)，而得到較不穩定的雜合體(見第1圖)。或者是，當插入/刪除之核苷酸位於所選區域的前端或尾端時，抑制引子與模板股無法對齊，因而在該端點處形成一分岔(fork)，而得到較不穩定的雜合體(圖中未繪示)。

顧名思義，抑制引子可以阻止此引子在PCR過程中被延長。要達到此一目的，可在一般引子的3’端加上非核苷阻斷物(non-nucleosidic blocker)，如磷酸基或磷酸酯。譬如由3’-間隔物(3’-Spacer)C3胞嘧啶-磷酸-尿嘧啶(C3cytosine-phosphate-guanine，簡稱C3-CPG)形成的3’-丙基磷酸酯(3’-propyl phosphate)就是一種很有效的3’端非核苷阻斷物。在3’位置上形成反向的3’-3’連接也能夠有效地防制聚合酶將核苷酸延長，因為在其3’位置尚沒有可用的羥基可供起始合成反應。另一種避免聚合酶在3’端進行延長的方法是利用核苷阻斷物(nucleosidic blocker)，如2’,3’-二去氧核苷(如2’,3’-ddC-CPG)或3’去氧核苷(如3’-dA-CPG、3’-dC-CPG、3’-dG-CPG或3’-dT-CPG)。當然，亦可採用可用以修飾抑制引子3’端的其他等效技術，而這些其他技術亦屬於本發明之範圍。

根據本發明的原理與精神，抑制引子應涵蓋整個選定區域以及至少一個額外的核苷酸殘基。因而，根據某些實施方式，本發明的抑制引子之長度為至少10-100個核苷酸。本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可理解，抑制引子的確切長度取決於欲探究的選定區域之長度以及該引子適用的反應條件，如黏合溫度與離子強度(ionic strength)。舉例來說，第1圖所示的抑制引子長度為33個核苷酸殘基。

根據本發明某些實施方式，抑制引子的熔點大於等於約50℃。在非必要且較佳的情形中，抑制引子的熔點約為55-85℃；且更加為約65-75℃。具體來說，抑制引子的熔點可為約55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85℃。序列編號2的抑制引子之熔點為約69℃。

正向引子

本發明的正向引子經特殊設計，而使得其3’端和抑制引子的5’端重疊。如此一來，在雜合環境下，抑制引子可和正向引子競爭重疊部分的一或多核苷酸殘基，以便與密碼股的互補序列(即，模板股)雜合。具體來說，正向引子的序列與位於選定區域上游的多個核苷酸殘基相同，且該正向引子3’端的至少最後一個核苷酸殘基與該抑制引子5’端的至少第一個核苷酸殘基相同。非必要地，正向引子3’端的至少5、10或15個連續核苷酸殘基和抑制引子5’端的至 少5、10或15個連續核苷酸殘基相同。第1圖中例示的正向引子序列為AATTCCCGTCGCTATCAA(序列編號：3)，此序列最後9個連續殘基(即CGCTATCAA)與抑制引子的前9個連續殘基相同。

根據某些實施方式，正向引子的長度為10-30個核苷酸。根據本發明的原理與精神，正向引子的確切長度取決於其和抑制引子的重疊核苷酸殘基數目以及該引子適用的反應條件，如黏合溫度與離子強度。舉例來說，第1圖所示的正向引子長度為18個核苷酸殘基。

根據本發明某些實施方式，正向引子的熔點大於等於約50℃。在非必要且較佳的情形中，正向引子的熔點約為50-70℃；且更加為約55-60℃。具體來說，正向引子的熔點可為約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃。序列編號3的正向引子之熔點為約55℃。

當注意到，在非必要的實施方式中，抑制引子的熔點可和正向引子的熔點不同。如此一來，可將含有這兩種引子的PCR反應混合物分別置於不同的黏合溫度下，而分別控制這兩種引子和模板股之雜合。一般來說，抑制引子熔點與正向引子的熔點差為約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15℃。以第1圖所示的引子對為例，兩種引子的熔點差約為14℃。

偵測插入/缺失變異的方法

在詳細介紹了此處提出的引子設計方案以及例示的引子組之後，接著說明利用此種引子組的PCR式偵測方法。

根據本發明一實施方式，將帶有目標基因的樣本與此處提出的引子組混合，以得到可用於後續PCR處理的混合物。所述的目標基因是雙股DNA，具有模板股以及與模板股互補之密碼股。

當可理解，適用於本方法的引子組乃是根據上文所述的方案而設計，且因而在此省略了關於抑制引子與正向引子的詳細說明，以求簡潔與明瞭。

根據本發明多種實施方式，在PCR混合物中，抑制引子與正向引子的莫耳比為約1：1至10：1；且較佳為約3：1至10：1。舉例來說，兩者的莫耳比可為約1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。在一實驗例中，反應混合物中含有約0.2μM的正向引子與約1μM的抑制引子。

一般來說，模板股(以及密碼股)的選定區域內可能帶有或不帶有一或多插入/缺失變異。根據本發明的原理與精神，本方法適用以偵測已知或未知的變異序列。

在某些情形中，欲偵測的生物樣本中可能同時含有野生型序列與突變序列。譬如，在取自生物體組織的樣本中，可能含有某些突變細胞。在此種情形中，突變序列(相較於野生型序列)可能僅佔了一小部分。由於本方法在偵測插入/缺失突變時展現了極高的靈敏度，因此樣本中突變序列含量稀少不會影響偵測結果。在一實施例中，當樣本同 時含有野生型與突變序列時，即便突變序列的量僅有野生型序列的萬分之一，本方法都能夠偵測到突變序列的存在。此外，根據本發明某些實施例，只需10-1000份的目標基因即足以進行偵測。

本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可理解，反應混合物中可更包含其他擴增反應試劑。這些用於PCR的擴增反應試劑可包含，但不限於：緩衝劑(buffers)；反應試劑(reagents)；具有反轉錄酶(reverse transcriptase)活性、聚合酶(polymerase)和/或外切酶(exonuclease)活性的酵素；酵素輔助因子(enzyme cofactors)，如鎂或錳；鹽類；以及去氧三磷酸核苷(deoxyribonucleotide triphosphates，dNTPs)，如去氧三磷酸腺苷(deoxyadenosine triphosphate，dATP)、去氧三磷酸鳥苷(deoxyguanosine triphosphate，dGTP)、去氧三磷酸胞苷(deoxycytidine triphosphate，dCTP)、去氧三磷酸胸苷(deoxythymidine triphosphate，dTTP)及去氧三磷酸尿苷(deoxyuridine triphosphate，dUTP)。習知技藝人士可依據所用的PCR方法來選擇適當的擴增反應試劑。

之後對反應混合物進行PCR處理；此處理依序包含變性步驟、黏合步驟與延長步驟；茲分述如下。

在變性步驟中，將由模板股與密碼股形成的雙股DNA(DNA duplex)變性(即，熔化)。雙股DNA確切的變性過程取決於其大小、序列與分子組成(主要是G-C鍵結相對於A-T鍵結的比例或G-C%)。在適當的溫度下，雙股DNA通常 會在一秒內就變性，上述溫度約介於80℃(一般為G-C%較低且較小的分子)至約95℃(一般為較大的分子，如人類基因組DNA)之間；在某些情形中，變性溫度可能更低。

在變性步驟之後，將反應混合物冷卻至黏合溫度，而使得抑制引子和正向引子能夠彼此競爭與模板股黏合之機會。本領域具有通常知識者當可理解，互相雜合的兩序列不必然需要完全互補。因而，抑制引子不但可和帶有參考序列的模板股雜合，也會和選定區域內具有插入/缺失變異的模板股雜合。然而，如上文所述，相較於由抑制引子和參考序列模板股所形成的雜合體，由抑制引子和變異序列模板股所形成雜合體較不穩定；因此抑制引子和變異序列模板股所形成的雜合體較易變性，因而使得正向引子有機會黏合至此種變異的模板股，並形成相對較穩定的雜合體。因而，在後續的延長步驟中，能夠擴增選定區域中帶有變異核苷的標的基因；而帶有和抑制引子黏合的參考序列之目標基因股則不會擴增。

在非必要的實施方式中，黏合步驟包含兩個階段。在第一黏合階段中，所用的第一黏合低於(或接近)抑制引子熔點且高於正向引子熔點。在這種情形下，只有抑制引子可和模板股雜合，而正向引子則不會和模板股雜合。其後，在第二黏合階段中，進一步將混合物冷卻至第二黏合溫度，此溫度低於(或接近)正向引子熔點，因而使得正向引子可和模板股雜合。然而，在設計時，使得正向引子的3’端和抑制引子的5’端重疊。因而，當抑制引子已經在 第一黏合階段中和模板股形成較穩定的雜合體時，在正向引子的3’端會出現分岔結構(參見第1圖)，而使得所形成之正向引子與模板股的雜合體相對較不穩定。換句話說，對於選定區域內不具有插入/缺失突變的參考密碼股，抑制引子會穩定地黏合至參考模板股，且因而可抑制核苷酸在後續步驟中延長。另一方面，當密碼/模板股的選定區域內存有變異的核苷酸時，由抑制引子和此變異模板股所形成的雜合體相對較不穩定，而容易變性，因而使得正向引子有機會黏合至此種變異的模板股並形成相對穩定的雜合體。因而，在後續延長步驟中能夠擴增選定區域內帶有變異核苷的目標基因；而帶有和抑制引子黏合的參考序列之目標基因則不會擴增。

在黏合步驟之後，將溫度調整到延長溫度，以使得核苷酸能夠延長。理想的延長溫度為本領域所熟知；一般來說，延長溫度約為70-80℃。然而，在考量相關因素(如所用的聚合酶種類)後，亦可採用其他溫度。

之後使反應混合物在變性、黏合與延長等步驟間循環，以持續擴增目標基因(特別是，選定區域中帶有變異核苷的標的基因)。此處提出的PCR處理可運用於任何已知的PCR熱循環裝置(thermocycler)及其均等物。此外，此處提出的PCR式方法相容於大多數的既有PCR處理。因而，能夠將本方法運用於各種PCR技術，包括但不限於非對稱聚合酶連鎖反應(asymmetric PCR)、熱啟動聚合酶連鎖反應(hot start PCR)、迷你引子聚合酶連鎖反應(miniprimer PCR)、多引子聚合酶連鎖反應(multiplex-PCR)、巢式聚合酶連鎖反應(nested PCR)，即時定量PCR聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription PCR)、固相聚合酶連鎖反應(solid phase PCR)與遞減聚合酶連鎖反應(touchdown PCR)。

本方法亦包含PCR產物之偵測。根據本發明實施方式，存有PCR產物表示目標基因之選定區域內有一或多插入/缺失變異；而沒有PCR產物表示目標基因之選定區域內沒有插入/缺失變異。

相關領域已有多種技術可用以決定PCR產物存在與否；這些技術包括但不限於：電泳(gel electrophoresis)、螢光共振能量轉移(fluorescence resonant energy transfer)以及標記探針雜合(hybridization to a labeled probe)。所述的標記探針可帶有至少一種以下標記：生物素(biotin)、螢光基團(fluorescent moiety)、抗原(antigen)分子量標籤(molecular weight tag)以及探針熔點修飾基(modifier of probe Tm)。此外，亦可在延長步驟中加入一標記(如，螢光或放射性標記)，以標記PCR產物。所述的偵測步驟包含測量螢光強度(fluorescence)、分子量(mass)、電量(charge)和/或化學螢光強度(chemiluminescence)。可在PCR過程中進行此一偵測步驟(如RT-PCR)，或可在PCR過程完成後進行偵測。

下文舉出多種實施例來闡明本發明之部分態樣，以使本發明所屬技術領域中具有通常知識者能藉以實踐本發 明。因此不應將這些實施例視為對本發明範圍之限制。本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於此處提的說明，當可在不需過度推衍的情形下運用本發明。此處提及的所有文獻，皆視為已完全引用而成為本說明書的一部份。

實施例I 偵測EGFR外顯子19的插入/缺失突變

由馬偕醫院(台灣)取得總計134個臨床樣本，樣本採集均經過患者的告知後同意。處理樣本以分離其中的核酸分子。在初期實驗中，進行Unidel-PCR擴增所用的試劑如下：PCR 2X Master Mix緩衝液(JMR)20μl、0.2μM正向引子(序列編號：3)、2μM抑制引子(序列編號：2)、0.2μM反向引子(AGCAGCTGCCAGACATGAGA；序列編號：19)、與分離的DNA(野生型或突變株)1μl(10⁵份)或模板DNA 100ng，加水使最終體積為20μl。利用ABI 9700 PCR設備進行PCR，反應中所用的循環條件為：變性溫度95℃持續10分鐘；之後溫度循環為94℃(60秒)、60℃(60秒)與72℃(60秒)，進行45個循環；最後在72℃(10分鐘)下進行延長。

在PCR完成後，自PCR槽中取出一樣本，並在洋菜膠上進行電泳分離。樣本與對照標記皆以溴化乙錠(ethidium bromide，EtBr)染色並以螢光偵測顯影，同時以電荷耦合元件相機擷取影像。將洋菜膠上的產物帶切下，並定序其 中所含的核酸。定序結果顯示利用此處提出的Unidel-PCR方法可以偵測到多種EGFR外顯子19的突變株；表一摘要整理了這些突變株的突變序列、突變位置以及受突變影響的胺基酸殘基。野生型EGFR外顯子19的序列包含序列編號：10所示的序列(即EGFR外顯子19的第2214至2261個核苷酸)。

交互比較定序結果以及Unidel-PCR的偵測結果，可發現在含有插入/缺失突變的34個樣本中，本方法皆能正向偵測到其中含有插入/缺失突變(表二)。

實施例II 偵測敏感度

選用帶有序列編號12(E746-A750del)的突變株DNA片段之樣本來探究Unidel-PCR的靈敏度。取含有10⁷份DNA片段的樣本分別稀釋成不同濃度的野生型DNA片段與突變株DNA片段樣本，並依預定的比例混合。之後利用實驗例I中所述的材料與方法來進行Unidel-PCR擴增，並偵測PCR產物，結果如第2圖所示。

在本實驗中，反應混合物中野生型DNA片段與突變株DNA片段的比例為100：1或10：1；而第2圖的照片顯示在反應過程中野生型DNA片段並未擴增(負對照組，N)，而突變DNA片段則被擴增(正對照組，P)。

實施例III 例示引子組

根據此處所提出的引子設計方案，可設計出適用於Unidel-PCR偵測方法的各種引子組，此處提出兩種例示性質的引子組。

ATP13A2基因負責編碼人類ATP酶13A2；ATP13A2基因的外顯子16的序列如下：

(序列編號：17)當欲探究在核苷酸78-88的選定區域( CCCAGAGCCTC )內是否含有插入/缺失突變時，一例示抑制引子可具有以下序列：CTGGT CCCAGAGCCTC GC(序列編號：5)，其中以粗體與斜體標記與所述選定區域相同的核苷酸殘基；而一正向引子可具有以下序列：GCATTCCTGCCCCTGGT(序列編號：6)，其中正向引子的最後5個核苷酸殘基與抑制引子的前5個核苷酸殘基序列相同。所用的反向引子序列可為：GTGAGGAGGCCAAGCAGGTCA(序列編號：20)。

另外，假設一人工參考序列具有以下的密碼股：

(序列編號：18)當欲探究在核苷酸25-116的選定區域(以粗體與斜體標記者)內是否含有插入/缺失變異時，一例示抑制引子可具有以下序列：

(序列編 號：8)，其中以粗體與斜體標記與所述選定區域相同的核苷酸殘基；而一正向引子可具有以下序列：AGGCTAGCGTAACCCCT(序列編號：9)，其中正向引子的最後9個核苷酸殘基與抑制引子的前9個核苷酸殘基序列相同。所用的反向引子序列可為：TGTATAAGCGGCTACCAGCAG(序列編號：21)。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為示意圖，概要地說明根據本發明實方式的引子設計方案；以及第2圖為照片，呈現出根據本發明一實施例來偵測插入/缺失突變之電泳結果。

<110> 黃志凱 陳冀寬 王道遠

<120> 用以偵測突變的方法與引子組

<160> 21

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 內皮生長因子外顯子19

<400> 1

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> DNA

<213> ATP13A2基因外顯子16

<400> 4

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

<210> 7

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 假設性選定序列

<400> 7

<210> 8

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 8

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 9

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 內皮生長因子外顯子19

<400> 10

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 內皮生長因子外顯子19

<400> 11

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 內皮生長因子外顯子19突變株

<400> 12

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> 內皮生長因子外顯子19突變株

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> DNA

<213> 內皮生長因子外顯子19突變株

<400> 14

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 內皮生長因子外顯子19突變株

<400> 15

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 內皮生長因子外顯子19突變株

<400> 16

<210> 17

<211> 227

<212> DNA

<213> ATP13A2基因外顯子16

<400> 17

<210> 18

<211> 355

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 假設性標的序列

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 21

Claims (9)

1. 一種聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)式方法，用以偵測一樣本中一標的基因之一選定區域內相對於一參考序列是否有插入或缺失變異，包含以下步驟：(a)形成一混合物，其包含該樣本與一引子組，其中該樣本中的該標的基因包含一模板股，以及一密碼股其與該模板股互補，且該引子組包含：(i)一抑制引子，其包含序列編號：2所示序列，其中該抑制引子之3’端經修飾以防止該抑制引子於該PCR過程中延長；以及(ii)一正向引子，其包含序列編號：3所示序列；(b)對該混合物依序進行以下步驟：一變性步驟、一黏合步驟、及一延長步驟，其中於該黏合步驟中，該正向引子與該抑制引子競爭以黏合至該模板股；以及(c)決定經過步驟(a)與(b)後是否得到一PCR產物，其中該PCR產物之存在表示該樣本中該標的基因之該選定區域內存有該插入或缺失變異，且該PCR產物之欠缺表示該樣本中該標的基因之該選定區域內不存有該插入或缺失變異，其中該選定區域之該參考序列包含序列編號：1所示序列。
2. 如請求項1所述之方法，其中於該混合物中，該抑制引子與該正向引子所用的莫耳比為約1：1至10：1。
3. 如請求項1所述之方法，其中該正向引子之熔點與該抑制引子之熔點不同。
4. 如請求項3所述之方法，其中該正向引子與該抑制引子之熔點分別大於等於50℃。
5. 如請求項1所述之方法，其中該抑制引子之3’端經過一磷酸基、一磷酸酯、一反向3’-3’連接、一2’,3’-二去氧核苷或一3’去氧核苷之修飾。
6. 一種引子組，用以經過PCR來偵測一標的基因之一選定區域內相對於一參考序列是否有插入或缺失變異，該標的基因具有一模板股以及與該模板股互補的一密碼股，該引子組包含：(i)一抑制引子，其包含序列編號：2所示序列，其中該抑制引子之3’端經修飾以防止該抑制引子於該PCR過程中延長；以及(ii)一正向引子，其包含序列編號：3所示序列，其中該選定區域之該參考序列包含序列編號：1所示序列。
7. 如請求項6所述之引子組，其中該抑制引子之3’端經過一磷酸基、一磷酸酯、一反向3’-3’連接、一2’,3’-二去氧核苷或一3’去氧核苷之修飾。
8. 如請求項6所述之引子組，其中該正向引子之熔點與該抑制引子之熔點不同。
9. 如請求項8所述之引子組，其中該正向引子與該抑制引子之熔點分別大於等於50℃。