CN1769489A - Pcr阻断联合荧光探针检测基因突变的方法及其所用的引物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及PCR阻断联合荧光探针检测基因突变的方法及其所用的引物，方法包括：(1)根据目标基因制备聚合酶链DNA扩增引物的步骤、(2)在具有上述引物的PCR反应液进行聚合酶链DNA扩增阻断的步骤、(3)荧光探针核酸杂交及荧光报告基团被酶解离、PCR荧光检测的步骤。本发明聚合酶链DNA扩增引物的序列3′端倒数第2、3位或第2、3、4位核苷酸硷基为原序列错配硷基。本发明方法以及本发明方法所使用的引物，能达到阻断PCR DNA扩增要求，不能使荧光探针中荧光报告基团解离，检测结果非常准确。
Description
技术领域
本发明涉及检测基因突变的方法，特别是PCR(聚合酶链DNA扩增)阻断联合荧光探针显示检测基因突变的方法及其所使用的引物。
背景技术
人体癌肿和遗传性疾病发生重要原因之一是其遗传基因发生突变，而微生物病原对药物产生耐药性，重要原因之一也是其遗传基因发生突变。因此，检测微生物病原耐药基因，可针对微生物病原对某种药物是否耐药，制定合理用药方案、指导临床治疗，除对耐药基因发生发展的控制律的研究提供条件，可杜绝抗生素及合成治疗药物的滥用；检测遗传基因突变、人体癌基因突变，对早期发现和确诊癌肿和遗传性疾病有重要作用，成为早期发现和确诊癌肿和遗传性疾病依据之一。
目前检测基因突变的方法包括核苷酸序列测定、核苷酸序列杂交、PCR单链构象法(SSCP)等。核苷酸序列测定所需设备投资大、检测成本高，无法推广。核苷酸序列杂交、PCR单链构象法不稳定、操作繁琐、在临床上推广应用价值不大。
为解决上述检测基因突变的方法的问题，人们发明了一种PCR阻滞联合荧光探针检测基因突变的方法，如中国《实用医学杂志》(2003年第19卷第5期467页)发表的文章——“等位基因特异性PCR检测HBV G1896A变异的缺陷和改进”公开的方法。该方法包括根据目标基因制备一种PCR DNA扩增引物的步骤、PCR阻滞的步骤、联合荧光探针显示的步骤。该方法的工作原理为：在PCR DNA扩增引物序列3′端倒数第2位核苷酸硷基设计并合成原序列错配硷基，PCR(聚合酶链DNA扩增)主要依靠3′端倒数第1-2位核苷酸硷基配对进行，由于错配硷基不能配对，而造成PCR DNA扩增阻滞，当遇到野生型(不含耐药基因突变点)核苷酸序列时PCR受到阻滞，使荧光探针中荧光报告基团解离减弱，荧光发射减弱。而当遇到突变型核苷酸序列时便能扩增，PCR未受阻滞，扩增结果使荧光探针报告基团酶解分离而发荧光。
上述PCR阻滞联合荧光探针检测基因突变的方法只能达到阻滞的效果，而不能达到阻断的效果，因此须将PCR的退火温度提高至68℃，致使PCR扩增受到阻断，但由于68℃是PCR扩增为最不适宜的退火温度，对于检测基因突变不具有普遍意义，而且敏感性大为降低，所以没有在临床上检测标本的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种PCR阻断联合荧光探针检测基因突变的方法及其所用的引物，该方法成本低、敏感性高、稳定性好、操作简单。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：
PCR阻断联合荧光探针检测基因突变的方法，它包括：
(1)根据目标基因制备聚合酶链DNA扩增引物的步骤、
(2)在具有上述引物的PCR反应液进行聚合酶链DNA扩增阻断的步骤、
(3)荧光探针核酸杂交及荧光报告基团被酶解离、PCR荧光检测的步骤；
聚合酶链DNA扩增引物的序列3′端倒数第2、3位或第2、3、4位核苷酸硷基为原序列错配硷基。
上述方案中，PCR反应液中还包括镁离子、苏糖醇；其中，镁离子的浓度在3.5-6.5mM/L之间，苏糖醇的浓度在1-5mM/L之间。
PCR阻断联合荧光探针检测基因突变的方法所用的引物，它的序列3′端倒数第2、3位或倒数第2、3、4位核苷酸硷基为原序列错配硷基。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、由于PCR主要依靠3′端倒数第2-4位核苷酸硷基与靶基因核苷酸硷基配对进行，而本发明引物以及本发明方法所使用的引物，它的序列3′端倒数第2、3位或倒数第2、3、4位核苷酸硷基为原序列错配硷基，错配硷基使目标基因3′端不能配对，而造成PCR DNA扩增阻断，聚合酶链DNA扩增不能进行，达到PCR阻断要求，不能使荧光探针中荧光报告基团解离，检测结果非常准确。
2、本发明方法中，增加了PCR反应液镁离子的浓度，并加入了DDT(苏糖醇)，能协助完成PCR DNA扩增阻断功能，能完全阻断非耐药基因的PCR DNA扩增，因此结果非常准确。
3、根据基因密码的改变，可测定基因核苷酸序列突变位点和核苷酸硷基改变状况。
4、本发明方法和引物可用于制备PCR荧光探针基因突变检测试剂盒。应用DNA引物，再和dNTP、TagDNA聚合酶、PCR缓和液配制PCR荧光探针检测基因突变试剂盒，进行耐药基因检测。
5、根据PCR阻断状况，荧光强度测定，可相对测定耐药基因突变程度和其它状况，测定结果显示PCR阻断联合荧光探针检测的阳性和阴性。
本发明方法和引物，对于基因突变检测的准确性很高，可在极大程度上克服现常规方法(核苷酸序列测定、核苷酸序列杂交、PCR单链构象法等)操作较繁琐、耗时、准确性较低的缺点，体现了技术先进性、准确性，具有广泛的实用性，能在临床上推广。另外由于本发明方法在PCR扩增最有利的条件下进行，克服了现有的PCR阻滞联合荧光探针检测基因突变的方法敏感性大为降低的缺点。
具体实施方式
本发明方法实施例1，该方法为用PCR阻断联合荧光探针检测基因突变的方法检测血清标本，看被测血清标本是否发生乙肝病毒G1896A基因突变。
乙肝病毒毒株的基因前C区1896位点的G-A基因变异，使干襻结构趋于稳定，造成对干扰素应答不敏感。它的基因变异与HBeAg阴性HBV感染流行率与地区优势基因型相关。
对乙肝病毒毒株前C区1896位点的G-A基因变异检测，对合理使用干扰素治疗乙肝有重要作用。
本发明方法实施例1乙肝病毒(HBV)1896基因突变PCR荧光检测的步骤依次为：
1、根据目标基因制备聚合酶链DNA扩增引物的步骤；
2、在具有上述引物的PCR反应液进行聚合酶链DNA扩增阻断的步骤；
3、荧光探针核酸杂交及荧光报告基团被酶解离、PCR荧光检测的步骤。
其具体步骤如下：
1、根据目标基因确定并制备聚合酶链DNA扩增引物的步骤：
根据乙肝病毒(HBV)G1896A变异设计、确定并合成PCR扩增DNA引物。
相关乙肝病毒基因野生型未突变核苷酸序列为：
5′-ACTGT TCAAG CCTCC AAGCT TT G-3′；
相关乙肝病毒基因突变型含突变核苷酸序列为：
5′-ACTGT TCAAG CCTCC AAGCT TT A -3′；
确定的相关乙肝病毒基因突变型检测突变核苷酸引物序列设计为：
5′-ACTGT TCAAG CCTCC AAGCA AA A-3′；
本发明方法实施例1中所使用的引物，它的序列3′端倒数第2、3、4位核苷酸硷基为原序列错配硷基，即：核苷酸引物序列3′端倒数第2、3、4位核苷酸硷基应为原序列错配硷基，由TTT换为AAA。
2、在具有上述引物的PCR反应液进行聚合酶链DNA扩增阻断的步骤：
(1)采用DNA提取试剂提取被测血清标本DNA：
a、采取被测人的新鲜血液，分离血清成为待测标本血清，在-18℃下存放(可保存7-10天)。
b、将待测标本血清40μl加入DNA提取液40μl混匀，在100℃下放置10分钟。12000rpm离心10分钟，取血清上清液备用。
(2)PCR反应准备：
a、取具有上述引物PCR反应液、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、DNA提取液、稀释液、阴性对照品、强阳性标准品、临界阳性标准品、矿物油备用。
PCR反应液、PCR缓冲液包括镁离子、苏糖醇；其中，镁离子的浓度在3.5-6.5mM/L之间，苏糖醇的浓度在1-5mM/L之间。
b、阳性标准品变性：取强阳性标准品、临界阳性标准品、阴性对照品各5μl分别加入稀释液45μl混匀，在100℃下放置10分钟变性备用。
(3)取出PCR反应液、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶分别在5000rpm下离心数秒。取5支0.2ml离心管，各离心管中分别加入PCR反应液6μl、PCR缓冲液20μl、TaqDNA聚合酶2μl，充分混匀，5000rpm下离心数秒，备用。
(4)取待测标本血清上清液、强阳性标准品变性液、临界阳性标准品变性液、阴性对照品变性液各2μl，分别加入已分装的PCR反应管离心管中；空白对照加dH2O 2μl到已分装的PCR反应管离心管中。各离心管在5000rpm下离心数秒后，分别加入矿物油20μl。
3、荧光探针核酸杂交及荧光报告基团被酶解离、PCR荧光检测的步骤：
(1)分别将5支离心管置于在PCR荧光检测仪设备上，调控荧光激发波长487nm，检测波长525nm。上机扩增，预变性94℃，2分钟，然后93℃，50秒→55℃，120秒，以强阳标准品A1、弱阳标准品A2的基因拷贝数/ml分别5×108、5×104制备标准曲线，测定标本基因拷贝数/ml。
(2)以空白对照调0，扩增完毕立即测定各管扩增后荧光度。
检测结果与判断：
1、强阳标准品A1、临界阳性标准品A2的基因拷贝数/ml分别5×108、5×104。
2、测定各离心管扩增后荧光度，强阳性标准品、临界阳性标准品、阴性对照、待测标本荧光度各为A1、A2、N、AX。
3、测量监控：荧光度A1＞A2＞N，本次试验有效。
4、待测标本AX＞阴性对照N×1.5值时，判定为阳性。
5、待测标本AX≤阴性对照N判定为阴性。
6、待测标本AX≤阴性对照N×1.5值，又＞阴性对照N，可用待测标本液，重复检测1次，如待测标本值仍在此间，判定为阴性。
7、待测标本如为阳性，可计算基因拷贝数/ml。
基因拷贝数/ml计算：将PCR荧光检测仪与电脑联机，输入扩增后的荧光度，扩增前的荧光度以0计，测定基因拷贝数/ml。
判断：无乙肝病毒血清标本和基因野生型血清标本检测为阴性。乙肝病毒(HBV)G1896A变异血清标本为阳性。
本发明方法实施例2，该方法为用PCR阻断联合荧光探针检测基因突变的方法检测血清标本，看被测血清标本Kras癌基因12密码子是否发生胰腺癌基因突变。
胰腺癌基因突变方式以Kras癌基因12密码子基因突变GGT→GTT为主。K-ras基因产物为三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白，称ras蛋白。它参与细胞分化、细胞周期演进等多种细胞功能的信号传递。正常情况下，体内GTP酶活化蛋白可解离ras蛋白与GTP的结合。当K-ras基因突变，降低了ras蛋白对GTP酶活化蛋白的敏感性，使ras蛋白持续与GTP结合，导致持续向细胞核传递生长信号。K-ras基因突变是发生于胰腺癌中最常见的基因事件。胰腺癌K-ras基因产物为三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白，称ras蛋白。它参与细胞分化、细胞周期演进等多种细胞功能的信号传递。正常情况下，体内GTP酶活化蛋白可解离ras蛋白与GTP的结合。当K-ras基因突变，降低了ras蛋白对GTP酶活化蛋白的敏感性，使ras蛋白持续与GTP结合，导致持续向细胞核传递生长信号。K-ras基因突变是发生于胰腺癌中最常见的基因事件。K-ras肿瘤基因基因的突变与胰腺癌发生、发展过程中具有非常重要的作用。
本发明方法实施例2的步骤依次为：
1、根据目标基因制备聚合酶链DNA扩增引物的步骤；
2、在具有上述引物的PCR反应液进行聚合酶链DNA扩增阻断的步骤；
3、荧光探针核酸杂交及荧光报告基团被酶解离、PCR荧光检测的步骤。
其具体步骤如下：
1、根据目标基因制备聚合酶链DNA扩增引物的步骤：
相关Kras癌基因野生型未突变核苷酸序列为：
5′-cttgt ggTag ttgga gctg g t-3′
相关Kras癌基因突变型含突变核苷酸序列为：
5′-Cttgt ggTag ttgga gctg t t-3′
相关Kras癌基因基因突变型检测突变核苷酸引物序列设计为：
5′-Cttgt ggTag ttgga gcaa t-3′
本发明方法实施例2中所使用的引物，它的序列3′端倒数第2、3位核苷酸硷基为原序列错配硷基，即：核苷酸引物序列3′端倒数第2-3位核苷酸硷基应为原序列错配硷基，由tg换为aa。
2、在具有上述引物的PCR反应液进行聚合酶链DNA扩增阻断的步骤，该步骤中只有标本DNA提取与本发明实施例1不同，其它步骤均相同。
标本DNA提取：将待测标本全血加抗凝剂，混匀，5000rpm离心10分钟，取沉淀细胞加入DNA提取液50μl混匀，100℃10分钟，12000rpm离心10分钟，取血清上清液备用。
3、荧光探针核酸杂交及荧光报告基团被酶解离、PCR荧光检测的步骤；同本发明实施例1。
检测结果与判断：同本发明实施例1。
判断：无胰腺癌外周血标本检测Kras癌基因12密码子基因突变为阴性，胰腺癌标本检测基因突变为阳性。
Claims (3)
1、PCR阻断联合荧光探针检测基因突变的方法，它包括：
(1)根据目标基因制备聚合酶链DNA扩增引物的步骤、
(2)在具有上述引物的PCR反应液进行聚合酶链DNA扩增阻断的步骤、
(3)荧光探针核酸杂交及荧光报告基团被酶解离、PCR荧光检测的步骤；
其特征在于：聚合酶链DNA扩增引物的序列3′端倒数第2、3位或第2、3、4位核苷酸硷基为原序列错配硷基。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：PCR反应液中还包括镁离子、苏糖醇；其中，镁离子的浓度在3.5-6.5mM/L之间，苏糖醇的浓度在1-5mM/L之间。
3、PCR阻断联合荧光探针检测基因突变的方法所用的引物，其特征在于：它的序列3′端倒数第2、3位或倒数第2、3、4位核苷酸硷基为原序列错配硷基。
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