CN104450963B - 一种hbv dna数字pcr定量检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病毒体外检测技术领域，具体为一种HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用。本发明提供检测试剂盒，包括PCR反应引物：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3与探针SEQ ID No.2；SEQ ID No.4、SEQ ID No.6与探SEQ ID No.5；SEQ ID No.7、SEQ ID No.9与探针SEQ ID No.8；作为内参反应引物：SEQ ID No.10、SEQ ID No.12与探针SEQ ID No.11，以及竞争性探针：SEQ ID No.13～SEQ ID No.16。使用时提取人血浆样本DNA，采用复合荧光多重PCR技术在数字PCR芯片微孔中对靶DNA进行扩增；显示蓝色荧光的微孔数即为总反应体系中HBV DNA定量结果。本发明用于HBV定量检测，快速、简便、灵敏度高、特异性强，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属于病毒体外检测技术领域，具体涉及一种HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用。
技术背景
慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B, CHB）是由于乙型肝炎病毒（Hepatitis BVirus, HBV）在人肝细胞中慢性感染所致的一种肝脏炎症疾病，其持续进展可导致肝硬化、肝功能衰竭及肝癌。据估计，全世界目前有HBV携带者约3.5亿人，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或肝癌。2012年，由中华医学会肝病分会和中国医学会感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》指出，目前我国现有的慢性HBV感染者约9300万，其中CHB患者超过2000万。
对于CHB，无论是中国版的还是欧洲肝病协会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》均指出，抗病毒治疗是最重要的治疗措施。在CHB的抗病毒治疗中，核苷（酸）类似物（包括拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺夫韦酯等）以其口服方便、抗病毒疗效确切成为CHB患者中应用最为广泛的一类药物，其中恩替卡韦及替诺福韦酯为国内外指南推荐的一线用药。
无论是采用核苷（酸）类似物还是干扰素等进行抗HBV治疗，其抗病毒疗效监测均需要对CHB患者外周血中的病毒载量进行检测，即HBV DNA定量检测。在国内外相关的治疗指南中均指出，无论是采用何种抗HBV治疗方案，均需要采用HBV DNA定量检测的方法对抗HBV疗效进行评估，理想状态下，需将CHB患者外周血中的HBV DNA控制在现有检测手段检测不到的水平。当前，国内外进行HBV DNA定量检测采用的方法均为实时荧光PCR方法。国际公认的HBV DNA定量检测方法是罗氏公司生产的、在国际上具有参比价值的Roche COBASTaqMan HBV Test检测试剂盒。依据这一定量方法，美国肝病协会指出，在抗HBV治疗中，HBVDNA定量水平应尽可能小于或等于10 IU/ml，欧洲肝病研究协会则指出，将HBV DNA定量水平控制在10-15 IU/ml可有效防止疾病复发。在我国CFDA于2013年5月发布的《乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测试剂注册技术审查指导原则》中则建议HBV DNA定量检测试剂的最低检出限应小于或等于30 IU/ml。
然而，我国CFDA早期批准的HBV DNA定量检测试剂，其灵敏度均在500 IU/ml以上，难以达到慢性乙型肝炎临床诊疗和我国法规的最新要求。2009年有学者以Roche试剂盒为参照，对我国已批准上市的几种HBV DNA定量检测试剂进行了评估，结果表明，5种试剂盒在1×104 －1×108 IU/ml范围内，各种试剂盒的符合率较高。2013年中国食品药品检定研究院的学者以Roche HBV DNA定量检测试剂为参照，对一检测灵敏度为500 IU/ml的国产HBVDNA定量检测试剂的质量进行了评估，在193份HBsAg阳性的样本中，Roche试剂盒检出HBVDNA的样本占到了95%，而国产试剂则仅为70%；而在122份HBsAg阴性的样本中，Roche试剂检出约31%的样本HBV DNA呈阳性，其中包括6份“两对半”结果均呈阴性的样本，而国产试剂在这122份样本中未检出1例呈HBV DNA呈阳性。这样的结果显示国产试剂盒质量有待进一步提高，最为重要的是要提高国产试剂盒对HBV DNA的检测灵敏度。
研究表明，HBV虽然是一种DNA病毒，但由于HBV DNA聚合酶本身无3’到5’端校正功能，HBV DNA在复制过程中的自发突变率较高。依据HBV DNA序列的相似性，HBV至少可分为A、B、C、E、F、G、H等7种基因型。中国慢性乙型肝炎患者中，则以C型和B型为主。在传统的HBVDNA实时荧光PCR检测试剂中，虽然在进行引物设计时，会考虑到不同基因型HBV间的保守性，但考虑到HBV自身高自发突变率，一套引物与探针对不同的基因型的覆盖率是有限的，除检测试剂自身的灵敏度外，这可能也是国产HBV DNA实时荧光PCR检测试剂漏检率高的重要原因之一。要提高对不同基因型HBV的覆盖，一个可行的方案是通过多重PCR进行检测，即在HBV DNA多个保守区域同时进行检测。由此而带来的另一个问题是，荧光信号强度与HBVDNA的量间的关系将不可避免地出现异化。
发明内容
本发明的目的就是针对上述对HBV DNA检测灵敏度的更高需求（包括现实需求和法规要求），提供一种检测快速、简便，特异性强、灵敏度高的HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用。
根据HBV DNA数字PCR定量检测要求，本发明首先设计HBV DNA特异性引物、检测探针和竞争性探针，具体如下：
5´- CATATCAACACTTCCGGAAACTACTGTT-3´ SEQ ID No. 1
5´- FAM-CGAGGCGAGGGAGTTC-MGB -3´ SEQ ID No. 2
5´- ATTGAGATCTTCTGCGACGCG -3´ SEQ ID No. 3
5´- TGGCCAAAATTCGCAGTCC -3´ SEQ ID No. 4
5’-FAM-ACGCCGCAGACACA-MGB-3’ SEQ ID No. 5
5´- TCCAGAAGAACCAACAAGAAGATGAG -3´ SEQ ID No. 6
5´- ACATCAGGATTCCTAGGACCCCT -3´ SEQ ID No. 7
5´-FAM- CTCGTGTTACAGGCGG-MGB-3´ SEQ ID No. 8
5´- CGAGTCTAGACTCTGTGGTATTGTGAGG -3´ SEQ ID No. 9
5´- TCCCTCGCCTCGdd -3´ SEQ ID No. 13
5´- GTGTCTGCGGCGdd -3´ SEQ ID No. 14
5´- CCGCCTGTAACACGAGdd-3´ SEQ ID No. 15。
其中，检测探针P2（SEQ ID No. 2）、P5（SEQ ID No. 5）、P8（SEQ ID No. 8）的5’端采用FAM标记，3’端采用MGB标记，依次对应的竞争性探针P13（SEQ ID No.13）、P14（SEQ IDNo.14）、P15（SEQ ID No.15）的3’端最后一个碱基为双脱氧核苷酸。P1（SEQ ID No. 1）与P3（SEQ ID No. 3），P4（SEQ ID No. 4）与P6（SEQ ID No. 6），P7（SEQ ID No. 7）与P9（SEQ IDNo. 9）为对应的3对特异性引物对。
设计人内参基因RPP40特异性引物、检测探针和竞争性探针分别为：
5´- TGGCTGTGAACAAGGCTGGAT -3´ SEQ ID No. 10
5´- VIC-AGGAAGGGTAGGGAGAC-MGB -3´ SEQ ID No. 11
5´- CAACAGCCCTAGCATCGTGATGT -3´ SEQ ID No. 12
5´- CTCCCTACCCTTCdd-3´ SEQ ID No. 16。
其中，检测探针P11（SEQ ID No. 11）的5’端采用VIC标记，3’端采用MGB标记，对应的竞争性探针P16（SEQ ID No.16）的3’端最后一个碱基为双脱氧核苷酸。P10（SEQ ID No.10）、P12（SEQ ID No. 12）为一对特异性引物。
本发明涉及一种HBV DNA数字PCR检测探针组合物，用于多重PCR反应，包括第一、第二、第三和第四PCR反应引物对与相应探针；其中：
第一PCR引物对是SEQ ID No. 1（即P1）和SEQ ID No. 3（即P3）所示的核苷酸序列，相应的检测探针为SEQ ID No. 2（即P2）所示的核苷酸序列；
第二PCR引物对是SEQ ID No. 4（即P1）和SEQ ID No. 6（即P6）所示的核苷酸序列，相应的检测探针为SEQ ID No. 5（即P5）所示的核苷酸序列；
第三PCR引物对是SEQ ID No. 7（即P7）和SEQ ID No. 9（即P9）所示的核苷酸序列，相应的检测探针为SEQ ID No. 8（即P8）所示的核苷酸序列；
第四PCR引物对是SEQ ID No. 10（即P10）和SEQ ID No. 12（即P12）所示的核苷酸序列，相应的检测探针为SEQ ID No. 11（即P11）所示的核苷酸序列。
SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16所示核苷酸序列依次为P2、P5、P8和P11（竞争性探针）。其中用于HBV DNA检测的探针P2、P5和P8均采用荧光素FAM标记，用于内参基因RPP40检测的探针P11采用荧光素VIC标记。
本发明提出的HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，包括：第一引物容器、第二引物容器、第三引物容器、第四引物容器；这些容器中具有探针组合物中对应的引物对和探针，具体说来：
第一引物容器内具有第一PCR引物对SEQ ID No. 1（即P1）和SEQ ID No. 3（即P3）所示的核苷酸序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 2（即P2）所示的核苷酸序列；
第二引物容器内具有第二PCR引物对SEQ ID No. 4（即P1）和SEQ ID No. 6（即P6）所示的核苷酸序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 5（即P5）所示的核苷酸序列；
第三引物容器内具有第三PCR引物对SEQ ID No. 7（即P7）和SEQ ID No. 9（即P9）所示的核苷酸序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 8（即P8）所示的核苷酸序列；
第四引物容器内具有第四PCR引物对SEQ ID No. 10（即P10）和SEQ ID No. 12（即P12）所示的核苷酸序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 11（即P11）所示的核苷酸序列。
各引物容器内所述引物与探针为其贮存溶液，贮存溶液中各引物探针浓度为反应浓度的10倍。
本发明设计的HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒可方便地用于HBV DNA数字PCR定量检测，具体步骤为：
（1）提取人血浆样本中的DNA，包括HBV DNA与游离的人基因组DNA；
（2）采用试剂盒中的引物与探针，通过复合荧光多重PCR引物在数字PCR检测芯片微孔中对靶DNA进行PCR扩增；
（3）检测芯片微孔荧光情况：在检出绿色荧光微孔的情况下，计数蓝色荧光微孔数即为总反应体系中HBV DNA定量结果。
即以数字PCR检测芯片中HBV DNA特异性检测信号（FAM标记，蓝色荧光）微孔数为HBV DNA定量结果。本发明通过定性的检测方法得到定量的检测结果。同时，人内参基因RPP40特异性检测信号（VIC标记，绿色荧光）为每一检测微孔中PCR系统的内参。当蓝色荧光检测微孔数大于10 000时，应将上样模板稀释100倍后重新进行检测。
本发明中，PCR扩增的反应体系可为：
2× PCR反应缓冲液（包括了Taq酶、dNTP、镁离子） 7.25微升
10× HBV DNA检测用引物探针组合 1.45微升
去离子水 0.80微升
模板DNA 5.00微升
总反应体积 14.50微升。
PCR反应条件为：
96度变性10分钟，然后60度2分钟、98度变性30秒共39个循环，之后60度保温2分钟，反应结束后进行FAM和VIC荧光信号检测。
本发明中，所述多重PCR反应体系中，各引物探针的优选反应浓度依次为：
SEQ ID No. 1 300nmol/L
SEQ ID No. 2 100nmol/L
SEQ ID No. 3 300nmol/L
SEQ ID No. 4 300nmol/L
SEQ ID No. 5 100nmol/L
SEQ ID No. 6 300nmol/L
SEQ ID No. 7 300nmol/L
SEQ ID No. 8 100nmol/L
SEQ ID No. 9 300nmol/L
SEQ ID No. 10 350nmol/L
SEQ ID No. 11 100nmol/L
SEQ ID No. 12 350nmol/L
SEQ ID No. 13 80nmol/L
SEQ ID No. 14 80nmol/L
SEQ ID No. 15 80nmol/L
SEQ ID No. 16 80nmol/L 。
本发明的有益效果是：
（1）在本发明中，依据HBV DNA三个不同的高度保守区域设计了三个PCR反应对HBVDNA进行多重检测，任何一个PCR反应出现阳性信号均可提示HBV DNA的存在，显著提高了对不同基因型HBV的覆盖率；
（2）对HBV采用了三重PCR反应进行平行检测且三个PCR反应中HBV特异性的探针均采用FAM标记，理论上一个拷贝的HBV DNA在一轮PCR反应可出现三个单位的荧光信号，但由于采用了数字PCR而非传统的实时荧光PCR检测系统，而数字PCR检测芯片微孔数远大于HBVDNA拷贝数，可以保证每一个出现蓝色荧光的微孔对应一拷贝的HBV DNA，即将定量检测转换为每一检测微孔中的定性检测，这一转换有效避免了在针对HBV采用单色荧光多重PCR反应所带来的荧光信号强度与HBV DNA量间的异化，同时也提高了检测的灵敏度；
（3）为进一步提高检测反应的特异性，反应体系中加了针对检测探针相应的在3’端经终止修饰的竞争性探针。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，下列具体实施例仅仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1：人血浆DNA提取
按医疗常规采人外周静脉血2ml，EDTA抗凝，800rpm离心5分钟，分离得到人血浆，取人血浆600微升、采用QIAGEN公司的DNA病毒抽提试剂盒抽提基因组DNA，洗脱体积为30微升。
实施例2：HBV DNA与RPP40特异性引物探针的设计与合成
根据不同基因型HBV的三个不同的保守区序列设计HBV DNA特异性引物和检测探针，三个不同的PCR反应中的HBV特异性检测探针均在5’端采用FAM荧光素标记，3’端采用MGB标记。在人基因组RPP40基因保守区域设计RPP40特异性引物和检测探针，RPP40特异性检测探针5’端采用VIC标记，3’端采用MGB标记。依据所设计的三条HBV特异性探针和1条RPP40特异性探针，分别设计相应的竞争性探针。竞争性探针的5’端不做修饰，3’端为双脱氧核苷酸。HBV和RPP40特异性引物与检测探针及相应的竞争性探针的序列与修饰特征见表1。
表1：HBV DNA数字PCR定量检测引物探针组合物
。
实施例3：HBV DNA数字PCR定量检测
（1）PCR反应体系：
按表2配制数字PCR反应体系。
表2 肝脏穿刺组织中HBV DNA定量检测数字PCR反应体系
（2）检测芯片上样：
按数字PCR用户手册要求将配制好的PCR反应液通过芯片上样孔加载至检测芯片，随后采用5.50 μL封闭液封闭反应芯片。
（3）PCR反应条件：
按表3的反应条件进行PCR扩增。
表3 HBV DNA数字PCR定量检测反应条件
（4）数字PCR结果的解读：
反应体系中总HBV定量＝蓝色荧光微孔数
上述定量结果的95%可信区间采用Possion分布进行估计。
蓝色微孔数大于10 000时，应将模板DNA稀释100倍后重新进行检测。
本发明以人血浆为检测样本，采用QIAGEN公司DNA病毒抽提试剂盒对检测样本中的HBV DNA和人基因组DNA片段进行共提取，并使用针对不同基因型HBV三个不同保守区域的三个PCR反应对HBV DNA进行检测，在提高针对不同HBV基因型覆盖率的情形下进一步提高灵敏度，同时采用人基因组单拷贝基因RPP40特异性引物与探针对PCR体系进行质控。由于采用了数字PCR检测芯片作为反应容器，将传统的实时荧光定量检测转换为每个芯片微孔中的定性检测，这一方面提高了检测的灵敏度，同时也避免了单色荧光多重PCR反应检测HBV所带来的荧光信号强度与HBV量间的异化问题。
本发明提出的HBV DNA数字PCR定量检测引物探针组合物，不同PCR引物与探针按一定配比进行反应，引物探针组合物以10倍反应浓度配制成贮存液。
本发明提供的试剂可以在具有数字PCR的实验室完成，检测需要采用数字PCR的检测芯片完成，检测时间仅需要3到5个小时；结果判读直观可靠；该发明可以稳定实施，具备在大规模推广的技术条件。
因此，本发明提供的试剂可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备产业化推广的条件。
综上所述，本发明的HBV DNA数字PCR定量检测方法设计巧妙，且检测快速、准确、简便，从而可作为HBV DNA的定量工具，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书被认为是说明性的而非限制性的。
<110> 申请人 上海五色石医学研究有限公司
<120> 一种HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用
<160> 16
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> HBV第一PCR反应上游引物
<400> 1
CATATCAACA CTTCCGGAAA CTACTGTT 28
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(16)
<223> HBV第一PCR反应检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记
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CGAGGCGAGG GAGTTC 16
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> HBV第一PCR反应下游引物
<400> 3
ATTGAGATCT TCTGCGACGC G 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(19)
<223> HBV第二PCR反应上游引物
<400> 4
TGGCCAAAAT TCGCAGTCC 19
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(14)
<223> HBV第二PCR反应检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记
<400> 5
ACGCCGCAGA CACA 14
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> HBV第二PCR反应下游引物
<400> 6
TCCAGAAGAA CCAACAAGAA GATGAG 26
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> HBV第三PCR反应上游引物
<400> 7
ACATCAGGAT TCCTAGGACC CCT 23
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(16)
<223> HBV第三PCR反应检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记
<400> 8
CTCGTGTTAC AGGCGG 16
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(28)
<223> HBV第三PCR反应下游引物
<400> 9
CGAGTCTAGA CTCTGTGGTA TTGTGAGG 28
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 人RPP40基因上游引物
<400> 10
TGGCTGTGAA CAAGGCTGGA T 21
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(17)
<223> 人RPP40基因检测探针，5’端VIC标记，3’端MGB标记
<400> 11
AGGAAGGGTA GGGAGAC 17
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 人RPP40基因下游引物
<400> 12
CAACAGCCCT AGCATCGTGA TGT 23
<210> 13
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(12)
<223> HBV第一PCR反应检测探针的竞争性探针，3’为双脱氧核苷酸
<400> 13
TCCCTCGCCT CG 12
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(12)
<223> HBV第二PCR反应检测探针的竞争性探针，3’为双脱氧核苷酸
<400> 14
GTGTCTGCGG CG 12
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(16)
<223> HBV第三PCR反应检测探针的竞争性探针，3’为双脱氧核苷酸
<400> 15
CCGCCTGTAA CACGAG 16
<210> 16
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(13)
<223> HBV第三PCR反应检测探针的竞争性探针，3’为双脱氧核苷酸
<400> 16
CTCCCTACCC TTC 13
Claims (1)
1. 一种HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，其特征在于包括：第一引物容器、第二引物容器、第三引物容器、第四引物容器；这些容器中具有探针组合物中对应的引物对和探针：
第一引物容器内具有第一PCR引物对SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；
第二引物容器内具有第二PCR引物对SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；
第三引物容器内具有第三PCR引物对SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列；
第四引物容器内具有第四PCR引物对SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列，以及相应的检测探针SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列；
其中，SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 8荧光素标记为 FAM，SEQ ID No. 11荧光素标记为VIC。
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