CN102146487B - 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针，属于生物技术领域。该方法涉及一种引起人类各种急慢性及重型肝炎的病毒基因检测技术，适用于乙型肝炎病毒定性定量检测。本试剂盒包括PCR反应液，其中包括DEPC处理水、Taq酶、dNTPs、10×PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物：5′-TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3′、乙型肝炎病毒反向引物：5′-TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3′、乙型肝炎病毒探针5′-CTGCGGCGTTTTAT-3′；试剂盒中还包括DNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒核酸，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。

Description

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，乙型肝炎病毒)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。乙型肝炎病毒复制的特点是：肝细胞核内有稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA)存在；有一个逆转录步骤。乙型肝炎病毒基因组中已确定的开放读框有4个，分别编码病毒的核壳(C)和包膜(S)蛋白，病毒复制酶(聚合酶)及一种似乎与病毒基因表达有关的蛋白质X。乙型肝炎病毒是目前发现最小的DNA病毒。乙型肝炎病毒是急慢性病毒性肝炎的主要致病因素，感染后可导致不同程度的肝脏损伤。由于乙肝病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、发病率高、治疗困难等特点，多为无黄疸性且许多人为无症状的乙肝病毒携带者，不易被人重视，人体感染后常可导致急、慢性乙型病毒性肝炎，长期的慢性感染可发展成肝硬化、甚至肝细胞癌，是一种潜在的严重威协人类健康的传染病。因此要求对乙型肝炎病毒感染尽快针对不同病情给以恰当的治疗。随着科技的进步，各种各样新的检测方法都应用到致病菌的检测。

现有技术中乙型肝炎病毒的快速检测方法如下：

1、电子显微镜技术

电子显微镜技术有常规电镜法和免疫电镜法。可用电子显微镜直接观察到乙型肝炎病毒颗粒或慢性肝炎患者的肝组织。免疫电镜还可观察到肝细胞胞浆和胞核中的HBcAg和HBeAg，常规电镜法样品用量小、制样速度快、观察比较直观，但观察灵敏度较低，要求样品的病毒量大[10]。而免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高，但样品制备过程较复杂，对操作者的技能要求较高。

2、免疫学技术

免疫学检测方法主要是检测乙型肝炎病毒感染过程中产生的抗原抗体免疫标志物。常规的乙型肝炎病毒免疫标志物的血清学检查为五项即：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb。免疫学检测法主要有酶免疫法(EIA)、固相放射免疫法(SPRIA)及微粒子酶免法(MEIA)。

EIA最常用的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，是将特异性抗原或抗体吸附于固相载体上，使其与待测样品中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅推算待测抗原或抗体的含量。ELISA特异性强。但ELISA检测HBsAg为阴性的样品也可能乙型肝炎病毒DNA为阳性。SPRIA法是利用放射性同位素标记已知的抗原或抗体。该方法灵敏度高，但由于同位素稳定性差、对环境造成污染等原因并不常用。MEIA是近年来发展起来的一种新的抗原抗体检测技术，采用最新的荧光技术，通过测定荧光强度来检测被测物的浓度，但如果被测物抗体呈弱阳性时，则不能轻易诊断出待测物。

3、基因芯片(又称DNA芯片)

基因芯片技术(gene chips)又称DNA芯片(DNA chips)或生物芯片(biological chips)。其原理是将大量特定的寡核苷酸或基因片段作为探针，有规律地和高密度地排列，固定在一块很小的支持物如硅片、玻片等，然后与待检的荧光标记样品核酸按碱基配对原则杂交，经洗涤后通过激光共聚焦荧光系统检测杂交信号强度，再经计算机分析处理数据从而获取样品的生物信息。将特异探针固定在载玻片上，在PCR扩增乙型肝炎病毒分型区域时，应用荧光标记的dNRP使PCR产物带有荧光，通过将PCR产物与乙型肝炎病毒芯片杂交后某型处的杂交点出现荧光而确定。

可用于乙型肝炎病毒的基因变异、基因分型的检测。该技术具有自动化程度高、灵敏度高、检测目的分子量少、效率高等优点，但也存在成本高、假阳性率偏高、重复性差等缺陷。

4、分子生物学方法

错误！未找到引用源。核酸探针法

带有标记物的DNA或RNA片段即核酸探针能与互补的核酸序列特异结合。核酸探针的标记可用核素P32、S35、I131等，以及非放射性物质如生物素、地高辛等。乙型肝炎病毒的核酸探针有DNA探针和RNA探针两种。核酸探针法的主要特点是敏感性、特异性都较强。

错误！未找到引用源。普通PCR法

PCR法通过两段特异性寡核甘酸引物，在体外经DNA聚合酶催化，扩增与两引物互补的DNA序列之间的区段，检测样品中是否有该序列。PCR较血清学方法更敏感，但特异性和重复性较低，若结合斑点杂交、微孔板杂交、滤膜核酸探针杂交等核酸杂交方法和酶联免疫等方法对PCR产物进行分析，灵敏度和特异性均可大大提高。

随着现代核酸技术的发展，建立在基因水平上的核酸扩增技术-PCR及相关技术，由于其高敏感性和高特异性，在乙型肝炎病毒的临床检测中得到广泛应用，成为实验室诊断的主要方法。这些以PCR为基础的检测方法，都需要花费时间对PCR扩增产物进行后处理，PCR扩增产物中高浓度的目标DNA分子会以气溶胶的形式污染整个实验空间，由于PCR的高度灵敏性，甚至可以检测出反应体系中10个拷贝的模板浓度，从而可能给今后的PCR实验带来严重的假阳性；常规PCR方法是终点检测法，由于PCR反应具有平台期，无法依据终产物对起始模板进行精确定量检测。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种克服PCR扩增产物终点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响，具有高度的特异性、灵敏度与准确性，且技术操作简便、自动化程度高的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，该试剂盒含有：

(1)PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙型肝炎病毒探针；

乙型肝炎病毒正向引物序列如序列表中SEQ ID NO.1所示：

5′-TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3′；

乙型肝炎病毒反向引物序列如序列表中SEQ ID NO.2所示：

5′-TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3′；

乙型肝炎病毒探针序列如序列表中SEQ ID NO.3所示：5′-CTGCGGCGTTTTAT-3′；

所述探针5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ或Eclipse荧光淬灭基团；

(2)溶液A，为聚乙二醇6000；

(3)溶液B，其中包括EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris-HCl、NP-40(乙基苯基聚乙二醇)；

(4)阴性质控品，为不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的pUCm-T载体质粒DNA片段；

(5)阳性质控品，为1.0×10⁶copy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；

(6)临界阳性质控品，为1.0×10⁴copy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；

(7)工作标准品，为含有乙型肝炎病毒的高度保守基因-Pre-S基因的71个碱基对的核苷酸片段的pUCm-T重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖；具体包括：

a、工作标准品1，含有约1.0×10⁷copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

b、工作标准品2，含有约1.0×10⁶copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

c、工作标准品3，含有约1.0×10⁵copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

d、工作标准品4，含有约1.0×10⁴copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段。

所述具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。

所述PCR反应液各组分含量的配比为：DEPC处理水用量27.5μL；浓度为5U/μL的热启动Taq酶用量0.3μL；浓度为10mmol/L的dNTPs用量1μL；10×PCR Buffer用量5μL；浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液用量7μL、浓度为10μmol/L的乙型肝炎病毒正向引物用量1.6μL、浓度为10μmol/L的乙型肝炎病毒反向引物用量1.6μL、浓度为10μmol/L的乙型肝炎病毒探针用量1μL。

所述聚乙二醇6000的浓度为15％；所述SDS浓度为0.5％；所述Tris-HCl的pH值为8.0；所述乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.1％。

本发明实施例还提供利用所述的试剂盒检测乙型肝炎病毒核酸的检测方法，包括下列步骤：

(1)采集样品：采集人血浆样品，离心分离，上清即为血清样品；

(2)样品处理：取待测血清100μL，加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，再次13000rpm离心10min，取上清液待测；

(3)加样：向装有45μL PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品，阴性质控品，阳性质控品，临界阳性质控品，工作标准品5μL，盖好管盖，5,000rpm离心10秒；

(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；

94℃5分钟；

94℃30秒、58℃45秒，5个循环；

94℃30秒、58℃45秒，35个循环，收集荧光信号，在反应程序的第三步的终了读取荧光值；

(5)分析判断：Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于等于28且小于等于32的为临界阳性。

进一步地，当需要绘制标准曲线时，另取4个反应管，直接加入不同浓度梯度的工作标准品5μL，5,000rpm离心10秒，放入荧光定量PCR仪器的反应槽内。

本发明还提供：一种乙型肝炎病毒核酸定量检测引物和探针，包括如下序列组：

包括下述正向引物，反向引物和荧光探针的一组序列：正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示：5′-TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3′，

反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示：5′-TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3′，

荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3所示：5′-CTGCGGCGTTTTAT-3′；

或者在上述序列的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的一组序列；

或者与上述序列的同源性大于85％的一组序列；

或者与上述序列的碱基互补的一组序列；

上述的任意一组序列可单独使用，或以所有序列组之间的任意组合形式而使用；

其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光染料修饰。

其中荧光探针的，5’端修饰的荧光染料可选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明试剂盒利用特异性的TaqMan探针来检测乙型肝炎病毒，检测完成后无需开盖电泳，避免了产物污染及对实验室人员的伤害。

本发明可用LNA探针，MGB探针，AllGlo^TM探针来实现。

本发明实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时检测克服了扩增产物终点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响，它具有高度的特异性、灵敏度与准确性，且技术操作简便、自动化程度高，由于采用闭管操作，不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题等特点，结果可靠。

附图说明

图1是本发明实施例1中提供的实验结果图；

图2是本发明实施例2中提供的实验结果图；

图3是本发明实施例3中提供的实验结果图；

图4是本发明实施例4中提供的实验结果图；

图5是本发明实施例5中提供的实验结果图；

图6是本发明实施例5中提供的标准曲线。

图中：图1、图2、图3、图4和图5的横坐标表示：表示循环数(Cycle number)，纵坐标表示：荧光值(Delta Rn)；

图6的横坐标表示：LogC(乙肝病毒起始浓度的对数值)，纵坐标表示：Ct值。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明提供了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，该试剂盒含有：PCR反应液，其中包括DEPC处理水、Taq酶、dNTPs、10×PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙型肝炎病毒探针；溶液A，为聚乙二醇6000；溶液B，其中包括EDTA、SDS、Tris-HCl、NP-40；阴性质控品，为不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的质粒DNA片段；阳性质控品，为高浓度乙型肝炎病毒基因组DNA片段；临界阳性质控品，为低浓度乙型肝炎病毒基因DNA片段；工作标准品，为含有乙型肝炎病毒的高度保守基因-Pre-S基因的71个碱基对的核苷酸片段的pUCm-T重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖；

试剂盒的制造：

1.试剂

本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。

2.PCR反应液制备

(1)引物及探针设计与合成：

选择乙型肝炎病毒特异性保守基因Pre-S基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得乙型肝炎病毒目前已有的8个基因型的乙型肝炎病毒Pre-S基因序列，并在www.ebi.ac.uk/在线分别对8个基因型的Pre-S基因序列进行序列比对，在基因区选择一段保守序列，序列如序列表中SEQ ID NO.4所示：TTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCA，利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件BeaconDesigner 7.0设计引物、探针序列，引物、探针序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保乙型肝炎病毒引物、探针序列能检测全部8个基因型序列。在本发明中，乙型肝炎病毒探针的5’端修饰的荧光染料可选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。本实施例中荧光报告基团设计为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm，淬灭集团设计为Eclipse。

设计结果如下表所示：

引物名称	碱基	纯化方式	引物序列(5’-3’)
				乙型肝炎病毒-F	21bp	PAGE	TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT
乙型肝炎病毒-R	21bp	PAGE	TGAGGCATAGCAGCAGGATGA
				探针名称	报告基团	淬灭基团	合成序列
乙型肝炎病毒-P	FAM	Eclipse	CTGCGGCGTTTTAT

注：“Y”为兼并碱基。

Y＝(C/T)。

表中：F：forward，正向；乙型肝炎病毒-F表示乙型肝炎病毒正向引物。

R：reverse，反向；乙型肝炎病毒-R表示乙型肝炎病毒反向引物。

P：probe，探针；乙型肝炎病毒-P表示乙型肝炎病毒探针，探针既可为TaqMan-MGB探针也可为LNA探针。

FAM：荧光报告基团。

BHQ或Eclipse：荧光淬灭基团。

按照上表的设计结果，委托宝生物工程(大连)有限公司合成引物和探针。

(2)PCR反应液配制：DEPC处理水27.5μL；5U/μL的热启动Taq酶0.3μL；10mmol/L(每种NTP浓度)的dNTPs 1μL；10×PCR Buffer 5μL；25mmol/L的MgCl₂溶液7μL、10μmol/L的乙型肝炎病毒正向引物1.6μL、10μmol/L的乙型肝炎病毒反向引物1.6μL和10μmol/L的乙型肝炎病毒探针1μL，配制成PCR反应液。

3.阴性质控品制备：不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的pUCm-T质粒DNA片段

取不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的pUCm-T质粒溶液于样本准备区预处理，定量稀释至浓度为1×10⁷copy/ml(比浊法)，吸取质粒溶液于离心管中，混匀，直接吸取5μL作模板。

4.阳性质控品制备：高浓度乙型肝炎病毒基因组DNA片段

取含乙型肝炎病毒的菌液，菌株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供)经培养后，取含乙型肝炎病毒的菌液100μL加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁶copy/ml，即可作为阳性质控品模板。

5.临界阳性质控品制备：低浓度乙型肝炎病毒基因组DNA溶液

取含乙型肝炎病毒的菌液，菌株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供)经培养后，取含乙型肝炎病毒的菌液100μL加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁴copy/ml，即可作为阳性质控品模板。

6.溶液A，浓度为15％的聚乙二醇6000(PEG6000)；

7.溶液B，其中包括乙二胺四乙酸(EDTA)(1mM)、SDS(0.5％)、Tris-HCl(10mM，pH8.0)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)(0.1％)；

8.工作标准品1，含有约1.0×10⁷copy/ml的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

9.工作标准品2，含有约1.0×10⁶copy/ml的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

10.工作标准品3，含有约1.0×10⁵copy/ml的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

11.工作标准品4，含有约1.0×10⁴copy/ml的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

工作标准品，为含有乙型肝炎病毒的高度保守基因-Pre-S基因的71个碱基对的核苷酸片段的pUCm-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁹copy/ml，-20℃保存。贮存浓度为1.0×10⁹copy/ml，使用前用无菌生理盐水或0.01mol/L PBS进行10倍梯度的系列稀释。工作浓度依次为1.0×10⁷copy/ml，1.0×10⁶copy/ml，1.0×10⁵copy/ml和1.0×10⁴copy/ml，使用前，12000rmp离心1分钟，取上清液作模板。

本发明的试剂盒可以按照下表进行配置(24人份/盒)：

本发明的试剂盒在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融；有效期6个月适用仪器(ABI7500，ABI7300，Bio-RadiQ5^TM，Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P，达安7000)等。

实施例1

用本发明的试剂盒在ABI 7300荧光定量PCR仪上检测乙型肝炎病毒核酸的方法

(1)采集样品：采集人血清样品；

a、用无菌注射器抽取受检者1ml静脉血，注入无菌1.5ml离心管中，于室温静置2小时，转入4℃静置1小时，8000rpm离心5分钟，吸取200μL上清(注意勿吸入红细胞)，转入另一无菌1.5ml离心管中，即为血清标本。

b、标本保存和运输：如果标本不立即测试，应储存于-20℃，避免反复冻融。标本长途运送应采用0℃冰壶。

(2)样品处理：取待测血清各100μL，加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液待测；

(3)加样：向装有45μL PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品5μL，盖好管盖，5,000rpm离心10秒；

乙型肝炎病毒FQ-PCR反应体系如下表：

试剂名称及浓度	加入量/人份(ul)	终浓度
			10×PCR buffer	5.0	1×PCR buffer
MgCl2(25mmol/L)	7.0	3.5mmol/L
			dNTPs(10mmol/L)	1	0.2mmol/L
乙型肝炎病毒FP(10μmol/L)	1.6	0.32μmol/L
			乙型肝炎病毒RP(10μmol/L)	1.6	0.32μmol/L
乙型肝炎病Probe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
			Taq酶(5U/ul)	0.3	2.0U/份
模板	5
			加水	27.5
总体积	50

(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的Taqman探针(本产品荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为Eclipse)，定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品选及临界阳性质控品Unknown。

按下表进行PCR扩增；

在反应程序的第三步的终了读取荧光值；

(5)分析判断：

Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于和等于28且小于和等于32的为临界阳性。本发明实施例1的试验结果如图1所示，具体检测结果见下表：

序号	Ct
		1	28.94
2	Undet
		3	21.18
4	22.37
		5	27.98
6	28.55
		7	28.97
8	27.40
		9	Undet
10	24.23

其中，样本3，4，5，8，10在阳性范围内，为阳性样本；样本1，6，7在临界阳性范围内，为临界阳性样本；样本2，9在阴性范围内，为阴性样本。

实施例2

用本发明的试剂盒按照实施例1的方法检测未知样本的乙型肝炎病毒核酸。未知样本来源××医院病人待测定的样品，本发明实施例2的试验结果如图2所示，检测结果见下表：

序号	Ct
		1	26.90
2	21.62
		3	20.94
4	10.99
		5	13.56
6	17.07
		7	17.15
8	18.54

其中，样本均在阳性范围内，为阳性样本。

实施例3

用本发明的试剂盒检测未知样本的乙型肝炎病毒核酸，除样本处理方法以外，其余与实施例1的方法基本相同，本实施例的样本处理方法如下：

样品处理：50μL血清中加入50μL 0.4M NaOH，80℃保温10min。15000r离心30s，取上清，加入25μL0.4M Tris.HCl pH7.5，-4℃贮存备用。

本发明实施例3的试验结果如图3所示，检测结果见下表：

序号	Ct
		1	21.40
2	23.84
		3	27.12
4	15.91
		5	16.16
6	21.73
		7	23.03
8	26.89

其中，样本均在阳性范围内，为阳性样本。

实施例4

用本发明的试剂盒检测未知样本的乙型肝炎病毒核酸，除样本处理方法以外，其余与实施例1的方法基本相同，本实施例的样本处理方法如下：

样品处理：NP-40加热裂解法：取待检血清25ul加入等量0.4％NP-40，充分混匀，100℃加热10min、13000rpm离心10min，取上清液待测。

本发明实施例4的试验结果如图4所示，检测结果见下表：

序号	Ct
		1	22.04
2	23.12
		3	26.37
4	19.15
		5	21.41
6	23.09
		7	24.12
8	26.61

其中，样本均在阳性范围内，为阳性样本。

分析：

实施例2、3、4分别检测了同样的乙肝病毒阳性样品，其实验方法中除DNA提取方法外其他相同，作为比较：

结合图2、3、4和实施例2、3、4的实验结果可以看出，实施例2的结果中Ct值更小，检出阳性率高，曲线呈S型并高于实施例3、4的实验结果，且更加平滑。实施例2采用实施例1的实验方法，故上述实施例1为本发明的优选方案，实施例3、4为备选。

实施例5

利用本发明的试剂盒进行定量检测时，需绘制标准曲线，除8个样本反应管外，另取3个反应管分别为阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品，还有4个反应管，给每个反应管中对应加入试剂盒中不同浓度梯度的工作标准品5ul，5000rpm离心10秒，以工作标准品为模板，按照实施例1的方法配制反应体系，然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。工作标准品选Standard。对于Standard，需要在Quantity栏中分别输入1.0×10⁷copy/mL、1.0×10⁶copy/mL、1.0×10⁵copy/mL、1.0×10⁴copy/mL。

使用仪器ABI 7300参照结果：

a.如果扩增曲线不呈S型或Ct值＞32，判定样品乙型肝炎病毒DNA含量小于检测下限；

b.如果扩增曲线S型不明显或28≤Ct值≤32，则样品乙型肝炎病毒DNA含量处于临界阳性范围；

c.如果扩增曲线呈S型且Ct值＜28，则按以下方法进行定量：

若样品的C(“C”表示样本浓度或含量)＜5.0000E+01，则该样品的乙型肝炎病毒DNA总含量＜50基因拷贝；

若样品的5.0000E+01≤C≤5.0000E+07，则该样品的乙型肝炎病毒DNA总含量＝C基因拷贝；

若样品的C＞5.0000E+07，则该样品的乙型肝炎病毒DNA总含量＞5.0000E+07基因拷贝，将样品稀释至线性范围内再检测；

根据下表绘制的标准曲线如图6所示，■是标准品，×是样本。

工作标准品	Ct	C(初始浓度)
			1.0e+007	14.40	1.0e+007
1.0e+006	17.37	1.0e+006
			1.0e+005	20.78	1.0e+005
1.0e+004	24.29	1.0e+004
			slope	-3.37	-
mtercept	37.71	-
			R2	0.99	-
标准方程	y＝-3.37x+37.71	-

本发明实施例5的扩增曲线如图5所示，本实施例工作标准品和8个样本在一起检测，根据扩增后得到的Ct值，查图6的标准曲线，再经换算，最终得到8个样本的的初始浓度如下表。

检测结果见下表：本发明的数据精确到0.01。

序号	Ct	C(初始浓度)
			阳性质控品	17.08	1.33e+006
临界阳性质控品	28.90	0.94e+004
			阴性质控品	Undet	-
1	17.15	1.26e+006
			2	Undet	-
3	22.01	3.46e+004
			4	Undet	-
5	18.54	4.87e+005
			6	21.61	5.97e+004
7	20.94	9.48e+004
			8	Undet	-

扩增曲线均呈光滑″S″型，标准曲线为一条直线，Ct值在14-28之间，每个浓度梯度的Ct值差约为3.3。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：

（1）PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙型肝炎病毒探针；

乙型肝炎病毒正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示：5′-TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3′，

乙型肝炎病毒反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示：5′-TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3′，

乙型肝炎病毒探针如序列表中SEQ ID NO.3所示：5′-CTGCGGCGTTTTAT-3′；

其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中,Y=(C/T)；

（2）DNA提取液；

（3）阴性质控品，为不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的pUCm-T载体质粒DNA片段；

（4）阳性质控品，为1.0×10⁶copy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；

（5）临界阳性质控品，为1.0×10⁴copy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；

（6）工作标准品，为含有乙型肝炎病毒的高度保守基因—Pre-S基因的71个碱基对的核苷酸片段的pUCm-T重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖。

2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液由溶液A和溶液B组成；

所述溶液A，为聚乙二醇6000；

所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。

4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：

a、工作标准品1，含有1.0×10⁷copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

b、工作标准品2，含有1.0×10⁶copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

c、工作标准品3，含有1.0×10⁵copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

d、工作标准品4，含有1.0×10⁴copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段。

5.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。

6.根据权利要求5所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，

所述PCR反应液各组分含量的配比为：DEPC处理水用量27.5μL；浓度为5U/μL的热启动Taq酶用量0.3μL；浓度为10mmol/L的dNTPs用量1μL；10×PCR Buffer用量5μL；浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液用量7μL、浓度为10μmol/L的乙型肝炎病毒正向引物用量1.6μL、浓度为10μmol/L的乙型肝炎病毒反向引物用量1.6μL、浓度为10μmol/L的乙型肝炎病毒探针用量1μL。

7.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，

所述聚乙二醇6000的浓度为15%；所述SDS浓度为0.5%；所述Tris-HCl的pH值为8.0;所述乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.1%。

8.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测引物，其特征在于，

正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示：5′-TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3′，

反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示：5′-TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3′，

或者与上述序列的碱基互补的一组序列；

其中，所述引物序列中Y=(C/T)。

9.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测探针，其特征在于，

荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3所示：5′-CTGCGGCGTTTTAT-3′；

或者与上述序列的碱基互补的一组序列；

其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰。

10.根据权利要求9所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测探针，其特征在于，其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

Images