CN114250325A - 快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法 - Google Patents

快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法，本发明的试剂盒包括：引物、探针、核酸释放试剂、PCR缓冲液、对照品、标准品和内标等物质。利用本试剂盒可以对乙型肝炎病毒9个基因型(A～I)进行荧光定量检测，使用本试剂盒不需要提取血清中乙型肝炎病毒核酸，整个反应在同一PCR管中即可完成，减少换管过程中待检标本受污染的机会。本发明还解决了
Figure DDA0003450646510000011
5G Polymerase酶不能直接进行血清乙型肝炎病毒核酸扩增的技术问题。本试剂盒的最低检出限为30IU/ml，具有灵敏、特异、准确、快速、操作简便等优势，可以大大提高对乙型肝炎病毒的检出效率。

Description

快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和 方法
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法。
【背景技术】
乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝病毒科，全世界三分之一人口(约20亿人)曾经感染过HBV，目前仍有约2.57亿慢性HBV携带者，我国至少还有9千万慢性HBV携带者。慢性HBV感染可导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌等各种肝脏疾病，每年约88万人死于与HBV感染有关的肝脏疾病。虽然大规模推广新生儿乙肝疫苗免疫接种效果显著，但仍然有约5％的免疫失败，而且，在乙肝疫苗长期免疫效果观察中已发现疫苗免疫成功、抗体滴度下降后慢性感染HBV现象。可见，慢性HBV感染仍然是全球性的公共卫生问题。
虽然HBsAg是HBV感染的重要血清标记物，但不能直接反映感染者体内病毒复制情况，不能说明感染者传染性大小，而血清HBV DNA浓度(病毒载量)具有这方面作用。病毒载量是影响母婴传播最重要的危险因素，对病毒载量≥106拷贝/ml、HBsAg和HBeAg双阳性孕妇发生母婴传播风险最高，因此，产前检测HBV病毒载量才能评估这类孕妇是否需要产前抗病毒治疗，降低病毒载量、减少母婴传播风险。过去认为，HBV感染者HBeAg阴转即表示病毒不复制、无传染性，但最近研究发现，HBV基因突变(nt1896 G→A,nt 1762A→T和1764G→A)可导致HBeAg阴性，这类感染者病毒仍在复制，仍具有传染性。病毒载量大于≥104拷贝/ml的慢性HBsAg无症状携带者肝癌风险增高，抗病毒治疗以降低病毒载量可降低肝癌风险，因此，这类感染者需要进行HBV病毒载量监测。很多抗肿瘤药物均可抑制人体免疫，因此，HBsAg阳性的肿瘤患者用抗肿瘤药物前，都要进行HBV病毒载量检测以评估是否需要先行抗HBV治疗，否则，抗肿瘤药物可能激发HBV大量复制、繁殖，威胁生命。可见，检测HBV病毒载量意义重大，应用广泛。
根据全基因组核苷酸序列差异≥8％原则，目前已发现HBV有9个基因型(A、B、C、D、E、F、G、H、I基因型)，根据型内S基因核苷酸序列差异≥4％，每个基因型还可细分多个亚型，目前已发现55个基因亚型。
HBV病毒载量检测基本步骤是核酸提取后扩增。提取核酸的目的是去除可能减少病毒DNA扩增能力和降低扩增效率的抑制物，然而，各种核酸提取方法复杂，繁琐，耗费人力、耗时、费用高、很容易导致待检标本污染。
目前已有多种国产乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR试剂盒用于临床检验、卫生检验和科研检测，但只能检测出HBV 8个基因型(A、B、C、D、E、F、G、H基因型)，因此，有必要研制能同时检测出包括最近发现的第九种基因型I的试剂盒。另外，申请人在研究过程中，应用目前我国自主研发、最好的DNA聚合酶之一
Figure BDA0003450646490000021
5G Polymerase进行血清HBV DNA直接扩增实验，发现使用该聚合酶及其配套的缓冲溶液进行血清直接扩增，效果差，结果不可靠，需要先提取病毒DNA再扩增，结果才准确，这使得该酶适用面窄，存在DNA检测技术操作复杂、有可能出现样本受到污染等缺陷，为提高对HBV DNA检测的广度、提高检测灵敏度、简化实验步骤，减少对标本的污染，有必要对该酶缓冲液进行改进。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供快速检测HBV 9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法，该方法能利用一个试剂盒即可实现对HBV的9种基因型的检测(A-I)，同时，检测过程中直接从血清进行检测，无需提取DNA，大大简化了实验步骤，提高检测灵敏度，减少对标本的污染。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
按简并引物方法及原则设计用于扩增靶多核苷酸的引物，以确保能扩增HBV所有9个基因型，快速检测HBV 9个基因型的引物对和探针，所述引物对的上游引物HBVWW1的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物HBVWW2的序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针HBVWWPR的序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述HBV 9个基因型为A、B、C、D、E、F、G、H和/或I基因型的一种或多种。
本发明还包括所述的快速检测HBV 9个基因型的引物对和探针在制备检测HBV 9个基因型试剂盒中的用途。
本发明还包括一种可检测9个基因型乙型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对(上游引物HBVWW1和下游引物HBVWW2)和探针(HBVWWPR)。
进一步的，所述试剂盒还包括内标巨细胞病毒的DNA及其扩增引物对和内标探针；所述扩增引物对的上游引物序列CVWW1如SEQ ID NO.4所示；下游引物序列CVWW2如SEQ IDNO.5所示；所述内标探针CVWWPR序列如SEQ ID NO.6。
进一步的，所述试剂盒还包括核酸释放试剂和PCR缓冲液。
进一步的，所述核酸释放剂由0.01～0.5mM地衣素、43～67mM KCl、体积百分比为0.05～1％的SDS(十二烷基硫酸钠)，5～100mM EDTA(乙二胺四乙酸)、体积百分比为1.5～3.0％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)组成。
进一步的，所述PCR缓冲液由3～10mM MgCl2、10～40mM的KCl、5～20mM pH值为7.8～8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液、0.15～0.25M的海藻糖、体积百分比为1～10％的DMSO(二甲基亚枫)、40～55U/ml的DNA聚合酶和2～8U/ml的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)组成。
本发明还包括非诊断目的用于HBV 9个基因型的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)在同一PCR反应管中加入核酸释放剂和待检血清样本，反复吹打混匀，置于普通PCR仪中进行裂解、终止核酸裂解并迅速降至4℃；
向步骤(1)降温后的溶液中加入PCR缓冲液、所述检测的引物对和探针和所述的内标引物对和内标探针进行荧光定量PCR反应。
本发明具有如下有益效果：
1、本申请的试剂盒包括：引物、探针、核酸释放试剂、PCR缓冲液、对照品、标准品和内标等物质，利用本申请的试剂盒对HBV DNA进行检测，无需提取血清HBV DNA，直接用血清在同一试管内完成实验，避免了DNA提取过程可能会产生的污染，最低检出限为30IU/ml。
2、本申请的引物按简并引物方法及原则进行设计，确保了能对HBV 9个不同基因型：A、B、C、D、E、F、G、H、I进行荧光定量检测；同时，本发明缓冲液解决了目前我国自主研发、最好的DNA聚合酶--
Figure BDA0003450646490000031
5G Polymerase酶不能直接进行血清扩增的技术问题。
3、整体来看，本申请试剂盒具有：灵敏度高、特异性强、扩增效率好、准确、操作简便、快速等优势，是一种可广泛应用于医疗、卫生单位的乙型肝炎病毒检测试剂盒。
【附图说明】
图1为采用本发明所述试剂盒检测浓度为104～107标准品的荧光定量PCR扩增曲线图；从左到右浓度依次为：4.00E+07IU/ml、4.00E+06IU/ml、4.00E+05IU/ml、4.00E+04IU/ml的血清样本；
图2为HBV DNA国家阴性参考品荧光定量PCR扩增结果图；
图3为HBV DNA国家阳性参考品荧光定量PCR扩增曲线图；
图4为HBV DNA灵敏度/定量国家参考品最低检出限曲线图；
图5为HBV DNA精密性国家参考品扩增曲线图；
图6为试剂盒对HBV 9个基因型的扩增效果图，图中，九条扩增曲线分别代表A、B、C、D、E、F、G、H、I基因型；
图7-图9为采用本发明缓冲液与酶公司缓冲液检测血清HBV DNA效果对比图，图6-图8分别代表3个不同样品；
图10为本发明缓冲液直接检测血清HBV DNA与该份血清提取HBV DNA后再用公司酶缓冲液检测的效果对比图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
本实施例为采用本发明的试剂盒检测HBV DNA国家标准品效果
具体实施过程如下：
配制试剂盒：本实施例的试剂盒包括如下成份：
①检测HBV DNA引物对和探针，其中，引物对的上游引物序列HBVWW1为：5’-TDTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’(其中D表示A或G或T)(参见SEQ ID NO.1)；下游引物序列HBVWW2为：5’-ACASACGGGCAACATACCTTG-3’(其中S表示C或G)(参见SEQ ID NO.2)；探针HBVWWPR序列为：5’-CTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCT-3’(参见SEQ ID NO.3)，探针标记5’FAM 3’TAMRA荧光基团。
②内标引物和探针：其中，内标引物对的上游引物序列CVWW1为：5’-ACCCGGCAAGATTTCTAACGG-3’(参见SEQ ID NO.4)；下游引物序列CVWW2为：5’-CATTCTGTGGGTCTGCGACTC-3’(参见SEQ ID NO.5)；所述内标探针CVWWPR序列为：5’-TAGTCATCGACGGTGCACATCGGCC-3’(参见SEQ ID NO.6)，探针标记5’VIC 3’TAMRA荧光基团。
③核酸释放剂：由0.01～0.5mM地衣素、43～67mM KCl、体积百分比为0.05～1％的SDS，5～100mM EDTA、体积百分比为1.5～3.0％的TritonX-100组成；
④PCR缓冲液：由3～10mM MgCl2、10～40mM的KCl、5～20mM pH值为7.8～8.0的Tris-HCl缓冲液、0.15～0.25M的海藻糖、体积百分比为1～10％的DMSO、40～55U/ml的DNA聚合酶和2～8U/ml的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)组成，其中，DNA聚合酶为：
Figure BDA0003450646490000051
5GPolymerase。
具体的实验步骤如下：
(1)用HBV DNA阴性血清将HBV DNA标准品稀释成浓度为4.00E+07IU/ml、4.00E+06IU/ml、4.00E+05IU/4.00E+04IU/ml四个浓度梯度。
(2)在干净的200μl PCR反应管，加入核酸释放剂8μl和7μl步骤(1)不同浓度的血清标准品，用移液器吹打混匀，盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：
第一步：60℃，10分钟；第二步：97℃，10分钟；第三步：4℃冷却后将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，瞬时离心，小心打开管盖，每管加入35μl PCR缓冲液，缓冲液中含检测HBV DNA扩增引物对和探针(其中，引物浓度为0.05～0.4μM，探针浓度为0.1～0.2μM)、内标扩增引物对和探针(其中，引物浓度为0.02～0.12μM，探针浓度为0.1～0.2μM)，用移液器吹打混匀；瞬时离心，置于荧光定量PCR仪，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现HBV DNA定量检测，扩增循环条件设置为：
第一步：UNG酶反应，50℃2分钟，1个循环；
第二步：DNA聚合酶活化，预变性95℃10分钟，1个循环；
第三步：变性：95℃10秒，退火、延伸及荧光采集：60℃20秒，45个循环。
得到的结果如图1所示，图1为不同浓度下HBV血清标准品的荧光定量PCR扩增曲线图，曲线中：从左到右的曲线分别对应浓度为4.00E+07IU/ml、4.00E+06IU/ml、4.00E+05IU/ml、4.00E+04IU/ml的血清样本；根据曲线可知，标准曲线相关系数R2＝0.991、扩增效率100.041，符合行业标准R2＝0.98，扩增效率在90％-110％之间。由此可见，采用实施例1的扩增方法，扩增效率良好。
实施例2：
本发明试剂盒的敏感性和特异性
实验采用的参考品如下：血清HBV DNA阴性8份及阳性9份国家参考品、1份灵敏度/定量国家参考品(HBV DNA含量为1×103IU/mL)和1份精密性国家参考品(HBV DNA含量为6.9×106IU/mL)均购自中国食品药品生物制品检定研究院。
(一)检测阴、阳性参考品符合率：
以HBV国家标准品中的8份阴性、9份阳性参考品作为待检样本，采用上述实施例1步骤进行检测(目的基因和内标的扩增引物和探针及其浓度与实施例1引物和探针及其浓度相同)，检测结果表明，8个阴性样本都没有检出信号，内标全都有信号，并且内标的重复性非常好，能够真正的起到监测假阴性的目的(具体见图2)；9个阳性样本均有明显的S型扩增曲线，均有Ct值，均可判为阳性(具体见图3)。阴、阳性符合率均为100％，可见，本发明试剂盒敏感性高、特异性强。
(二)最低检出限：
用HBV DNA阴性血清将1份灵敏度/定量国家参考品(HBV DNA含量为1×103IU/mL)稀释至50IU/mL和30IU/mL作为待检样本，采用上述实施例1步骤进行检测(目的基因和内标扩增引物和探针及其浓度与实施例1引物和探针及其浓度相同)，每个浓度梯度完成8个重复检测。检测结果见图4，可以看出最低检出限30IU/mL 8次提取扩增均有明显的S型扩增曲线，Ct值在34～37左右，均可判定为阳性。可见，本试剂盒最低检出限为≤30IU/mL。
(三)精密性：
取精密性国家参考品(HBV DNA含量为6.9×106IU/mL)，采用上述实施例1步骤进行检测，完成10个重复检测，结果取对数后求变异系数(CV)值。检测结果见图5，结果显示：本试剂盒的精密度较为理想，精密度变异系数为1.9％，符合行业标准≤5％的要求。
实施例3：
本实施例为本发明试剂盒对9个不同HBV基因型的检测结果：
用本发明所述试剂盒检测HBV 9个基因型(A、B、C、D、E、F、G、H、I)标准品。检测步骤：取核酸释放剂8μl加入7μl的血清样本(标准品)，用移液器吹打混匀，盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：
第一步：60℃，10分钟；第二步：97℃，10分钟；第三步：4℃冷却后将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，瞬时离心，小心打开管盖，每管加入35μl PCR缓冲液，缓冲液含与实施例1相同的扩增引物和探针及其浓度，用移液器吹打混匀；瞬时离心，置于荧光定量PCR仪，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现HBV DNA定量检测，扩增循环条件设置为：
第一步：UNG酶反应，50℃2分钟，1个循环；
第二步：DNA聚合酶活化，预变性95℃10分钟，1个循环；
第三步：变性：95℃10秒，退火、延伸及荧光采集：60℃20秒，45个循环。
实验结果参见图6，图中的9个基因型(A～I)均被扩增出来，说明本申请的试剂盒能对HBV的9个基因型(A～I)实现荧光定量检测分析。
Ct值详见表1。结果可见，HBV 9个基因型(A～I)均有明显的S型扩增曲线及相应Ct值，均可判为阳性标本，说明本试剂盒敏感性高，可检测HBV 9个基因型。
表1本发明试剂盒检测九个基因型的检测结果
样本名称 检测结果Ct值
HBV A基因型标准品 29.576
HBV B基因型标准品 29.774
HBV C基因型标准品 29.753
HBV D基因型标准品 29.622
HBV E基因型标准品 30.129
HBV F基因型标准品 29.856
HBV G基因型标准品 30.203
HBV H基因型标准品 30.163
HBV I基因型标准品 30.896
HBV DNA阴性血清 Undetermined
HBV DNA阳性血清 26.043
实施例4：
本实施例为本发明缓冲液与其它公司酶缓冲液的扩增效果对比：
实验组：采用实施例1的缓冲液(包括核酸释放剂和PCR缓冲液，简称本发明缓冲液)及扩增步骤。
对照组：采用
Figure BDA0003450646490000071
5G Polymerase DNA聚合酶及其缓冲液(简称公司酶缓冲液)和扩增步骤。
上述两组中，使用的DNA聚合酶一致，不同仅在于实验组采用申请人自己配制的核酸释放剂和PCR缓冲液，而对照组采用该
Figure BDA0003450646490000072
5G PolymeraseDNA聚合酶配套的缓冲液。
(一)采用上述两组试剂对比检测中检院HBV DNA国家阳性参考品血清3份。
对照组参考该公司说明书进行扩增，其步骤如下：在1个干净的200μl PCR反应管，加入2x5G qPCR Buffer GB 25μl，
Figure BDA0003450646490000073
5G Polymerase 0.625μl，上游引物HBVWW1和下游引物HBVWW2各1.25μl，探针HBVWWPR 0.5μl，H2O 14.375μl，国家阳性参考品血清7μl。用移液器吹打混匀，瞬时离心。
用本发明所述缓冲液的检测步骤与实施例1一致，具体如下：在1个干净的200μlPCR反应管，加入8μl核酸释放剂和国家阳性参考品血清7μl，用移液器吹打混匀，盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：第一步：60℃，10分钟；第二步：97℃，10分钟；第三步：4℃冷却后将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，瞬时离心，小心打开管盖，每管加入35μl PCR缓冲液(含
Figure BDA0003450646490000082
5G Polymerase 0.675μl)，缓冲液含与对照组相同的扩增引物和探针，引物和探针浓度与实施例1相同，用移液器吹打混匀，瞬时离心。
将以上2个PCR反应管置于荧光定量PCR仪，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现HBV DNA定量检测，扩增循环条件设置：
第一步：UNG酶反应，50℃2分钟，1个循环；
第二步：DNA聚合酶活化，预变性95℃10分钟，1个循环；
第三步：变性：95℃10秒，退火、延伸及荧光采集：60℃20秒，45个循环。
结果分析：结果如图7-9所示，由图可见，用本发明所述缓冲液进行扩增，平均Ct值仅为21.644，而用公司酶缓冲液扩增，平均Ct值为27.532，比本发明所述缓冲液大5.9个Ct值(详见表2)。
表2本发明酶缓冲液和酶研发公司酶缓冲液扩增效果对比
Figure BDA0003450646490000081
(二)本发明缓冲液直接检测血清HBV DNA与该份血清提取HBV DNA后再用公司酶缓冲液检测的效果比较
这两组检测方法的步骤和试剂与本实施例的第(一)步完全相同，但本发明缓冲液直接检测血清HBV DNA，而公司酶缓冲液检测的是从同一份血清标本提取的HBV DNA。
结果分析：结果如图10所示，由图可见，本发明缓冲液检测的Ct值为30.325，而公司酶缓冲液检测的Ct值是30.350，两者几乎没有差异。
可见，用公司酶缓冲液直接检测血清HBV DNA所得的病毒载量比用本发明所述缓冲液检测所得的病毒载量少17倍，而用本发明缓冲液直接检测血清HBV DNA与该份血清提取HBV DNA后再用公司酶缓冲液检测，两者检测所得的病毒载量基本相同。可见，公司酶缓冲液不适合于直接检测血清HBV DNA。
综上所述，本申请的引物、探针和试剂盒能检测乙型肝炎病毒(HBV)9个基因型(A～I)，应用比市面上的其它试剂盒更广泛，同时解决了
Figure BDA0003450646490000083
5G Polymerase酶不能直接进行血清扩增的技术问题。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区疾病预防控制中心
<120> 快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2 )..(2)
<223> d is a or g or t
<400> 1
tdtctgcggc gttttatcat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4 )..(4)
<223> s is c or g
<400> 2
acasacgggc aacatacctt g 21
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcttcatcc tgctgctatg cctcatct 28
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acccggcaag atttctaacg g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cattctgtgg gtctgcgact c 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tagtcatcga cggtgcacat cggcc 25

Claims (9)

1.快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物对和探针，其特征在于，所述引物对的上游引物HBVWW1的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物HBVWW2的序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针HBVWWPR的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的引物对和探针，其特征在于，所述乙型肝炎病毒9个基因型为A、B、C、D、E、F、G、H和/或I基因型的一种或多种。
3.权利要求1或2所述的快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物对和探针在制备检测乙型肝炎病毒9个基因型试剂盒中的用途。
4.一种可检测乙型肝炎病毒9个基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物对和探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内标为巨细胞病毒DNA及其扩增引物对和内标探针；所述扩增引物对的上游引物CVWW1的序列如SEQ ID NO.4所示；下游引物CVWW2的序列如SEQ ID NO.5所示；所述内标探针CVWWPR的序列如SEQ ID NO.6所示。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸释放试剂和PCR缓冲液。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂由0.01～0.5mM地衣素、43～67mM KCl、体积百分比为0.05～1％的SDS，5～100mM EDTA、体积百分比为1.5～3.0％的TritonX-100组成。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由3～10mM MgCl2、10～40mM的KCl、5～20mM pH值为7.8～8.0的Tris-HCl缓冲液、0.15～0.25M的海藻糖、体积百分比为1～10％的DMSO、40～55U/ml的DNA聚合酶和2～8U/ml的尿嘧啶-N-糖基化酶组成。
9.非诊断目的用于乙型肝炎病毒9个基因型的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)在同一PCR反应管中加入核酸释放剂和待检血清样本，反复吹打混匀，置于普通PCR仪中进行核酸裂解、终止核酸裂解并迅速降至4℃；
(2)向步骤(1)降温后的溶液中加入PCR缓冲液、权利要求1所述引物对和探针和权利要求5所述的内标引物对和内标探针进行荧光定量PCR反应。
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