CN103710465A - 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反应液中包含用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列、用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列中的一种或多种。本发明提供了一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、特异性好的HBV基因分型PCR检测试剂盒。应用该试剂盒可以对患者血清中HBV的B、C、D基因型进行检测，能为患者的临床用药、治疗方案等提供参考，并为患者药物治疗前的风险评估、病情预后等提供分子生物学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙型肝炎病毒检测试剂盒，具体涉及一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒。
背景技术
乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病。乙型肝炎病毒是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。乙型病毒性肝炎分急性和慢性两种。急性乙型肝炎在成年人中90%可自愈，而慢性乙型肝炎表现不一，分为慢性乙肝携带者、慢性活动性乙型肝炎、乙肝肝硬化等。全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌（HCC）。我国是病毒性肝炎的高发地区，乙肝病毒携带率为总人数的10%左右，每年新发病人约900万人。目前，依据核苷酸序列异源性≥8%或S基因序列异质性≥4%可将HBV DNA分为A～I共9个基因型。HBV基因型的分布具有一定的地理流行病学特征，通过研究不同地区优势基因型可以反映出该地区HBV自然感染史发生的变异特点，这是由病毒变异后进化所导致的结果。在中国的HBV基因型是以B、C和D这3型为优势基因型，并以C型最多。
不同HBV基因型可以导致不同的临床表现及预后。有研究表明基因D型HBV感染者更易发生肝衰竭，且基因D型更易引起慢性乙型肝炎病情的复发；基因B型感染者较C型感染者较少发生肝损害，且基因B型感染者较C型不易发展至肝硬化、炎症程度较轻、HBeAg血清学转换更早。基因C型感染者其肝脏炎症坏死评分高于基因B型感染者。另有研究显示，基因C型HBV感染者较B型感染者更易发展为肝硬化和肝癌（HCC）。此外，C型较之B型更易发生核心启动子（BCP）区域的变异，可能导致临床上表现为HBeAg阴性的慢性乙型肝炎。
不同基因型HBV感染对抗病毒的反应不同。HBV感染对于扰素治疗的有效性在病毒分子学方面的因素仍有许多是未知的。干扰素治疗的费用昂贵，需注射，并且有较多不良反应以致患者较难耐受。因此在临床上预测干扰素治疗的有效性是非常重要的。目前普遍认为，在HBeAg阳性慢性乙肝患者中，基因B型患者对于干扰素的应答率高于基因C型患者，且在HBeAg清除方面基因B型高于基因C型。目前，在欧洲肝病协会最新版本的HBV防治指南里已经明确指出，在经干扰素治疗后，A型与B型有着比C型与D型更高的应答率。
因此，HBV基因分型检测可以在乙型肝炎患者的临床类型、预后判断及治疗方法的选择等方面发挥重要的作用。
目前HBV基因分型的主要实验诊断技术是基于核酸检测的分子生物方法。主要有全基因测序分析、线性探针反向杂交、限制性片段长度多态性分析（RFLP）、基因芯片、反向斑点杂交以及荧光PCR法等。测序技术虽然结果可靠准确，但是由于其技术复杂、实验流程长、实验条件要求高、耗时长和费用昂贵难以用作临床常规使用；RFLP技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异的影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果的判断；其它杂交、芯片类等需要对PCR产物进行分析的方法相对来说均存在较易污染的弊端。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，特异性好，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。
结合国内情况，在HBV基因分型的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性，目前已有多家荧光PCR诊断试剂盒在临床HBV基因分型诊断中常规使用，但是缺乏完善的质控体系，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。
运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。
目前国内临床上主要采用煮沸法对乙型肝炎病毒的核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。
临床上分型检测HBV-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术分型检测HBV-DNA的试剂盒应用于临床检测中。但这些试剂盒所提供的HBV-DNA提取方法主要是煮沸法，其核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。且这些试剂盒的检测灵敏度不高，约在1000IU/ml左右；且没有设置阳性内对照（即内标），无法监控假阴性；一般没有预防PCR产物污染的措施。另外，受限于其引物探针序列，本领域还需开发出一种包括乙型肝炎病毒基因分型特异性好的综合性能优良的PCR检测试剂盒。
发明内容
因此，本发明的目的在于解决现有乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、特异性好的乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，应用该试剂盒可以对患者血清中的HBV基因型（国内常见的B、C、D型）进行检测，能为患者的临床用药、治疗方案等提供参考，并为患者药物治疗前的风险评估、病情预后等提供分子生物学依据。
本发明提供一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反应液中包含用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列、用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列中的一种或多种；
其中，用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列为，
C型上游引物：5’-GACTTCAACCCCAACAAGGATC-3’，
C型下游引物：5’-GCTGCTGGCACTGTTGTCAAT-3’，
C型探针：5’-CRGGGTTCACTCCACCACACGG-3’；
用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列为，
B型上游引物：5’-AACTTTACGGGGCTTTATTCTTCTAC-3’，
B型下游引物：5’-CTGTAAGGGGTCCCACAAATTG-3’，
B型探针：5’-TACATCTATCAACAATGTCCTCCTGCAAA-3’；
用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列为，
D型上游引物：5’-GTGGGTCACCATATTCTTGGGA-3’，
D型下游引物：5’-AACTGGTGGTCGGGAAAGAATC-3’，
D型探针：5’-CATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGC-3’。
本发明的试剂盒能特异性地检测出乙型肝炎病毒基因分型中的C型、B型和D型中的一种或多种，即判定临床HBV血清或血浆样本是否为HBV的C型、B型和D型感染。
优选地，本发明所述试剂盒中还包括内标，其序列为5’-CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3’。相应地，所述PCR反应液中还包含序列为如下所示的用于检测内标的引物探针序列；
内标上游引物：5’-CCTCTAGCGCTGCGAATAGAA-3’，
内标下游引物：5’-GTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGA-3’，
内标探针：5'-HEX-TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC–BHQ1-3'。
本发明中，内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.00E+05copies/ml～1.00E+06copies/ml，它作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。
根据本发明，例如可以配置四种PCR反应液，每种PCR反应液中均包括一套引物探针序列。但更优选的是，所述PCR反应液为一种，其中包括用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于内标扩增和检测的引物探针序列，或者包括用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于内标扩增和检测的引物探针序列。
在一种具体的实施方式中，所述PCR反应液包括两种，其中一种包括用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列，而另一种包括用于内标扩增和检测的引物探针序列。
在另一种具体的实施方式中，所述PCR反应液包括两种，其中一种包括用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于内标扩增和检测的引物探针序列，而另一种包括用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列；或者是其中一种包括用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于内标扩增和检测的引物探针序列，而另一种包括用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列。
在本发明另一种具体的实施方式中，所述PCR反应液中还包括PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸；所述试剂盒中还包括酶混合液、HBV分型阳性对照和HBV分型阴性对照。
本发明还提供一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含序列为如下所示的用于靶多核苷酸扩增的C型上游引物、C型下游引物和用于靶多核苷酸检测的C型探针；
C型上游引物：5’-GACTTCAACCCCAACAAGGATC-3’，
C型下游引物：5’-GCTGCTGGCACTGTTGTCAAT-3’，
C型探针：5’-FAM-CRGGGTTCACTCCACCACACGG-BHQ1-3’。
本发明还提供另一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含序列为如下所示的用于靶多核苷酸扩增的B型上游引物、B型下游引物和用于靶多核苷酸检测的B型探针；
B型上游引物：5’-AACTTTACGGGGCTTTATTCTTCTAC-3’，
B型下游引物：5’-CTGTAAGGGGTCCCACAAATTG-3’，
B型探针：5’-FAM-TACATCTATCAACAATGTCCTCCTGCAAA–BHQ1-3’。
本发明还提供另一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含序列为如下所示的用于靶多核苷酸扩增的D型上游引物、D型下游引物和用于靶多核苷酸检测的D型探针；
D型上游引物：5’-GTGGGTCACCATATTCTTGGGA-3’，
D型下游引物：5’-AACTGGTGGTCGGGAAAGAATC-3’，
D型探针：5’-HEX-CATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGC–BHQ1-3’。
本发明还提供一种核酸释放剂在HBV基因分型检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%。
具体实施方式
本发明将以如下具体实施方式对本发明作出进一步说明，但本发明的保护范围并不限定于此。本发明中，如果有未具体指明的百分比，则为质量百分含量。
实施例1
本发明的乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒包括如下组分：
①核酸释放剂：包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%。
②第一PCR反应液：为HBV-C型/内标PCR反应液（检测HBV C型及内标），主要成分为：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的引物：C型上游引物、C型下游引物，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针：C型探针，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标片段扩增的内标上游引物、内标下游引物，0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的内标探针。
③第二PCR反应液：包含HBV-B/D型PCR反应液（检测HBV B型及D型），主要成分为：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的引物：B型上游引物、B型下游引物，D型上游引物、D型下游引物，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针：B型探针、D型探针。
④内标，其为如上所示的100个核苷酸序列。
⑤酶混合液：耐热DNA聚合酶（Taq酶）1U/μl～5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）0.05U/μl～0.2U/μl；其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。
⑥HBV分型阳性对照：来源于临床医院收集的HBV阳性血清，其浓度为1.00～4.00E+05IU/ml。
⑦HBV分型阴性对照：来源于临床医院收集的HBV阴性血清。
实施例2
本实施例提供上述实施例1的乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒用于检测临床HBV血清或血浆样本的操作步骤：
一、试剂准备
根据待测样本、HBV分型阴性对照、HBV分型阳性对照的数量，按比例取相应量的第一PCR反应液（38μl/人份）、酶混合液（2μl/人份）充分混匀成第一PCR-mix，第二PCR反应液（38μl/人份）、酶混合液（2μl/人份）充分混匀成第二PCR-mix；瞬时离心后备用。
二、样本处理
每个PCR反应管中加入核酸释放剂5μl（建议深吸浅打，避免出现气泡），各管依次加入待测样本、HBV分型阴性对照、HBV分型阳性对照各5μl，吸打3～5次混匀（轻轻吸打，避免出现气泡）；所有样本均重复2个反应管，其中一个用于加第一PCR-mix，而另一管用于加第二PCR-mix。间隔10分钟以上，每管加入相应的第一或第二PCR-mix40μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖。
三、荧光PCR反应与结果分析（在荧光定量PCR扩增仪上进行）
1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
2）荧光检测通道选择：以ABI7500仪器为例，使用FAM（Reporter:FAM,Quencher:none）通道检测HBV的B型及C型，而使用HEX或VIC通道（Reporter:HEX/VIC,Quencher:none）检测HBV的D型及内标。参比荧光（Passive Reference）设置为ROX。
3）荧光定量PCR反应条件见表1：
表1
4）结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值进行分析，然后记录样本Ct值。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）。并按表2进行结果判定。
表2
对于目的基因测定Ct值≤39（Ct值＞0）的样本，报告为相应HBV基因型阳性，此时待测样本的扩增曲线呈S型；对于测定Ct值>39或无显示的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤39），此时待测样本扩增曲线平直，报告为HBV B、C、D型分型检测低于试剂盒检测下限；若内标Ct值>39或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
本发明提供的试剂盒仅能检测出相应型别的HBV DNA，不能检测出其他型别HBVDNA及非HBV病原体DNA，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。
在本发明的HBV-DNA的提取方法中，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取。另外，在优选的实施方式中，对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；在反应体系中增加了内标，利用内标监控PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本因抑制而检测为假阴性。
准确性及特异性实验表明：本试剂盒与HAV、HCV、HIV、TP、CMV、EBV、HSV等病原体感染样本无交叉反应。检测WHO HBV分型参考品无交叉反应（A～G型），阴、阳性符合率均为100%。本试剂盒检测企业工作参考品，阴、阳性符合率均为100%。
精密度实验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的CV%均小于5%。
DNA不同提取方法对HBV-DNA检测的影响试验表明：通过同时检测梯度稀释样本发现，本发明的核酸快速释放法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明方法操作更为简便快速，无需加热。同时，煮沸法试剂没有内标监测，如提取的DNA中有PCR抑制物存在时，会导致HBV样本检测为B、C、D型阴性，即出现假阴性，不能准确分型，本发明的快速检测试剂盒中加入内标，可以有效监控假阴性的存在。
PCR产物污染的预防试验表明：PCR反应体系中加入适量的UNG酶可以预防PCR产物污染。
临床样本的检测试验表明：本发明的快速检测试剂盒的检测范围对于HBV B、C、D基因型均为100IU/ml～5.00E+09IU/ml，检测下限即灵敏度均为100IU/ml。
荧光定量PCR扩增结束后，通过两种反应管的不同荧光通道信号分型检测HBV DNA，检测结果可为乙型肝炎的治疗提供辅助参考。
Claims (10)
1.一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反应液中包含用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列、用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列中的一种或多种；
其中，用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列为，
C型上游引物：5’-GACTTCAACCCCAACAAGGATC-3’，
C型下游引物：5’-GCTGCTGGCACTGTTGTCAAT-3’，
C型探针：5’-CRGGGTTCACTCCACCACACGG-3’；
用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列为，
B型上游引物：5’-AACTTTACGGGGCTTTATTCTTCTAC-3’，
B型下游引物：5’-CTGTAAGGGGTCCCACAAATTG-3’，
B型探针：5’-TACATCTATCAACAATGTCCTCCTGCAAA-3’；
用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列为，
D型上游引物：5’-GTGGGTCACCATATTCTTGGGA-3’，
D型下游引物：5’-AACTGGTGGTCGGGAAAGAATC-3’，
D型探针：5’-CATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGC–3’。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括内标，其序列为5’-CCTCTAGCGCTGCGAATAGAACTTCCTCTGTTCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGCTGGTTCTTCTTCAAGGTTCAAGCAATAGAAACGGAGATCTAC-3’，且所述PCR反应液中还包括用于检测内标的引物探针序列为，
内标上游引物：5’-CCTCTAGCGCTGCGAATAGAA-3’，
内标下游引物：5’-GTAGATCTCCGTTTCTATTGCTTGA-3’，
内标探针：5'-TCAAGCCTTCCCTTTATACGCTCAAGC-3'。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为一种，其中包括用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于内标扩增和检测的引物探针序列，或者包括用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于内标扩增和检测的引物探针序列。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括两种，其中一种包括用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列，而另一种包括用于内标扩增和检测的引物探针序列。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括两种，其中一种包括用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于内标扩增和检测的引物探针序列，而另一种包括用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列；或者是其中一种包括用于B型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于内标扩增和检测的引物探针序列，而另一种包括用于C型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列和用于D型靶多核苷酸扩增和检测的引物探针序列。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还包括PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸；所述试剂盒中还包括酶混合液、HBV分型阳性对照和HBV分型阴性对照。
7.一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含序列为如下所示的用于靶多核苷酸扩增的C型上游引物、C型下游引物和用于靶多核苷酸检测的C型探针；
C型上游引物：5’-GACTTCAACCCCAACAAGGATC-3’，
C型下游引物：5’-GCTGCTGGCACTGTTGTCAAT-3’，
C型探针：5’-FAM-CRGGGTTCACTCCACCACACGG-BHQ1-3’。
8.一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含序列为如下所示的用于靶多核苷酸扩增的B型上游引物、B型下游引物和用于靶多核苷酸检测的B型探针；
B型上游引物：5’-AACTTTACGGGGCTTTATTCTTCTAC-3’，
B型下游引物：5’-CTGTAAGGGGTCCCACAAATTG-3’，
B型探针：5’-FAM-TACATCTATCAACAATGTCCTCCTGCAAA–BHQ1-3’。
9.一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含序列为如下所示的用于靶多核苷酸扩增的D型上游引物、D型下游引物和用于靶多核苷酸检测的D型探针；
D型上游引物：5’-GTGGGTCACCATATTCTTGGGA-3’，
D型下游引物：5’-AACTGGTGGTCGGGAAAGAATC-3’，
D型探针：5’-HEX-CATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGC–BHQ1-3’。
10.一种核酸释放剂在HBV基因分型检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%。
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Denomination of invention: Hepatitis B virus genotyping PCR (polymerase chain reaction) test kit Effective date of registration: 20170711 Granted publication date: 20150204 Pledgee: Ningbo free trade zone Terry with equity investment partnership (limited partnership)|Suzhou equity equity investment center (limited partnership)|Ningbo Meishan Bonded Port District, Jun and equity investment partnership (limited partnership)|Chen Bang Pledgor: Hunan Gene Technology Co.|Hunan San Xiang Biological Technology Co. Ltd. Registration number: 2017430000042 |
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