CN103773897B - 一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒及其应用。所述试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ、HCV反应液Ⅲ，优选的，还包括HCV分型阴性对照、HCV分型阳性对照及使用说明书。本发明对提取的HCV RNA，采用三管多重荧光PCR，通过一步法RT-PCR，快速检测样本中丙型肝炎病毒RNA及其亚型。本发明的试剂盒扩增方法简单、操作简便，检测结果灵敏度高、特异性好，可用于人血清或血浆中HCV RNA的检测和基因分型，有助于判断治疗的难易程度、制定个体化抗病毒治疗方案，具有临床推广应用价值。

Description

一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种疾病病原体基因检测试剂盒，尤其涉及一种采用多重荧光PCR检测方法，制备丙型肝炎病毒及其基因分型检测的试剂盒，用于快速准确检测临床血清或血浆样品中丙型肝炎病毒及国内主要流行亚型1b，2a，3a，3b，6a的感染。本发明属于生物技术领域。
背景技术
丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引起丙型肝炎的病原体，严重危害人类健康。它主要通过输血、静脉注射、母婴垂直等方式感染致病，可引起慢性肝炎，肝硬化，甚至肝癌。据世界卫生组织报道，目前全球约有2亿人感染HCV（至少包括130个国家），约占全球人口的3%，其中80%急性肝炎患者成为慢性肝炎，其中20%发展为肝硬化，1%-5%肝硬化患者可发展为肝癌。
HCV的基因组为单股正链RNA，长约9.6kb。根据其核苷酸序列的差异性，可将HCV分为6个主要的基因型，每个基因型又可分为多个亚型。HCV基因型的分布具有明显的地域差异，1-3型呈全球性流行，4-6型呈地方性流行。我国主要有1、2、3和6型4种HCV流行基因型，其中流行最广泛的亚型为1b和2a，其次为6a、3b和3a。HCV基因型与干扰素抗病毒治疗的应答密切相关，是决定丙型肝炎患者干扰素治疗效果的重要因素。不同基因型HCV感染者接受干扰素治疗后，持续病毒学应答（SVR）率有所不同,从而有助于预测治疗效果，为调整用药剂量及治疗时间，制定个体化抗病毒治疗方案提供指导。因此HCV基因型在临床上常作为药物疗效的预测指标。
HCV基因分型的方法主要有分子生物学和血清学两大类。在分子生物学分型法中，核苷酸测序法被认为是“金标准”，但由于测序设备的限制，广泛的临床应用存在一定困难。PCR-限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）法利用限制性内切酶可将6种基因型分开，但酶切位点易受到基因变异的影响。线性探针杂交（Line probe hybridization assay，LiPA）法操作较为繁琐，HCV RNA低载量患者的检测效果较差。实时荧光PCR法既可检测主要基因型，同时还能区分亚型。此外，还有型特异探针杂交、反向斑点杂交等分型方法。血清学基因分型主要是检测NS4区和核心区编码的抗原，常用的方法有重组免疫印迹试验（Recombinant Immunoblot Assay，RIBA）和酶免疫试验（Enzyme Immunoassay，EIA）。这两种方法对1、2、3基因型的辨别有96%的一致性，且操作简便。但用于检测HCV基因型特异性抗原的ELISA方法虽可以识别6种基因型，却不能识别亚型。而且一些研究表明，血清学分型可能在特异性和灵敏度方面有局限。近年国内外文献报道的HCV RNA基因分型的研究方法主要有HPLC酶切法、引物特异性电泳分型法、熔点曲线法、分管引物测序等方法，这几种方法均存在操作复杂、结果鉴定开放式或分管多步等缺陷，因此也没有成为临床常规开展的技术。本发明采用多重荧光PCR检测方法，可用于快速准确检测临床血清或血浆样品中丙型肝炎病毒及国内主要流行亚型1b，2a，3a，3b，6a的感染，具有操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点，在临床诊断、疾病治疗等领域有极大的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用多重荧光探针技术进行丙型肝炎病毒核酸及其基因型检测的试剂盒，通过该试剂盒的使用，能够快速、简便、敏感地检测HCVRNA及HCV基因型，从而为丙型肝炎的临床诊断和抗病毒治疗提供参考依据。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术手段为在HCV5’非编码区设计进行HCV通用型检测的引物和探针，同时分别针对HCV的各亚型（HCV1b、HCV2a，HCV6a、HCV3b和HCV3a）的NS5B基因区段设计用于HCV基因分型的引物和探针。在HCV核酸提取后，配制RT-PCR反应体系进行多重荧光PCR扩增，根据三个反应管的扩增结果判断HCV感染及其感染亚型。本发明扩增程序简单、操作简便、灵敏度高、特异性好、结果清晰，容易判断。
本发明是一种用于丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、酶混合液、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ以及HCV反应液Ⅲ；
其中，HCV反应液Ⅰ用于检测HCV通用型和1b亚型，其包括以下引物序列和探针：
用于HCV通用型检测的引物序列是：
HCV-F：5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’（SEQ ID NO.1所示）；
HCV-R：5’-CRACCCAACRCTACTCGGCT-3’（SEQ ID NO.2所示）；
对应的探针序列是：
HCV-P：5’-AGTACACCGGAATYGCCRGGAHGAC-3’（SEQ ID NO.3所示）；及
用于HCV1b亚型检测的引物序列是：
HCV1b-F：5’-GCCCAGGAGCAACTTGAAAA-3’（SEQ ID NO.4所示）；
HCV1b-R：5’-GAGAGTAACTATGGAGTGAA-3’（SEQ ID NO.5所示）；
对应的探针序列是：
HCV1b-P：5’-CTCCATTGAGCCACTTGACCTACCT-3’（SEQ ID NO.6所示）；
其中，HCV反应液Ⅱ用于检测HCV2a和6a亚型，其包括以下引物序列和探针：
用于HCV2a亚型检测的引物序列是：
HCV2a-F：5’-CGGAGGCTATGACCAGGTATTC-3’（SEQ ID NO.7所示）；
HCV2a-R：5’-GGCATCACGGGTGAGGTAATAG-3’（SEQ ID NO.8所示）；
对应的探针序列是：
HCV2a-P：5’-ACCTCCTCCCCTTGTCGTCCCGT-3’（SEQ ID NO.9所示）；及
用于HCV6a亚型检测的引物序列是：
HCV6a-F：5’-CTTGCCTCAGGAAACTTGGG-3’（SEQ ID NO.10所示）；
HCV6a-R：5’-TAGCTTGGTCTTCACTGCCC-3’（SEQ ID NO.11所示）；
对应的探针序列是：
HCV6a-P：5’-TGCGAGCCTGGAGACATCGAGCCA-3’（SEQ ID NO.12所示）；
其中，HCV反应液Ⅲ用于检测HCV3a和3b亚型，其包括以下引物序列和探针：
用于HCV3a亚型检测的引物序列是：
HCV3a-F：5’-CCTTGACTTTGAAATGTACG-3’（SEQ ID NO.13所示）；
HCV3a-R：5’-GCTCTACTGGAGAGTAACTG-3’（SEQ ID NO.14所示）；
对应的探针序列是：
HCV3a-P：5’-ACTCTGTCACTCCGCTGGATTTACC-3’（SEQ ID NO.15所示）；及
用于HCV3b亚型检测的引物序列是：
HCV3b-F：5’-GCACCAAAACCAAACTCACT-3’（SEQ ID NO.16所示）；
HCV3b-R：5’-GAGTAGGCAAAGCAGCAAAT-3’（SEQ ID NO.17所示）；
对应的探针序列是：
HCV3b-P：5’-CTGCGGGCCAGCTAGATCTTTC-3’（SEQ ID NO.18所示）。
根据本发明所述的试剂盒，优选的，所述的试剂盒中还包括HCV分型阴性对照、HCV分型阳性对照及使用说明书，更优选的，所述的HCV分型阴性对照为无HCV RNA的正常人血清样本；所述的HCV分型阳性对照为含有HCV1b亚型基因片段的非转染性体外转录RNA的人血清样本。
根据本发明所述的试剂盒，优选的，所述的RT-PCR反应液中含有pH=8.0的Tris-HCl20mM、KCl100mM、dATP，dGTP，dCTP，dTTP各0.4mM、MgCl26mM。
根据本发明所述的试剂盒，优选的，所述的酶混合液中含有200U/μL逆转录酶、40U/μL RNA酶抑制剂和2U/μL Taq酶。
根据本发明所述的试剂盒，优选的，所述的HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ或HCV反应液Ⅲ中所含有的探针序列的5’端分别采用不同的荧光报告基团进行标记。
根据本发明所述的试剂盒，优选的，所述的PCR反应液中还包括内参系统，所述的内参系统为人GAPDH基因参照系统，包括：
用于扩增人GAPDH基因的引物序列：
GAPDH-F：5’-CCGTCTAGAAAAACCTGCCAAA-3’（SEQ ID NO.19所示）；
GAPDH-R：5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3’（SEQ ID NO.20所示）；及
内参探针：
GAPDH-P：5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’（SEQ ID NO.21所示），内参探针5’端用CY5标记，3’端用BHQ1标记。
根据本发明所述的试剂盒，优选的，HCV反应液Ⅰ中含有的用于检测HCV通用型和1b亚型的引物序列和探针，其浓度分别为：0.3-0.5μM，用TE缓冲液溶解；HCV反应液Ⅱ中含有的用于检测2a和6a亚型的引物序列和探针，其浓度分别为：0.2-0.4μM，用TE缓冲液溶解；HCV反应液Ⅲ中含有的用于检测3a和3b亚型的引物序列和探针，其浓度分别为：0.3-0.5μM，用TE缓冲液溶解。
根据本发明所述的试剂盒，优选的，RT-PCR反应体系的配制和扩增程序如下：
RT-PCR反应体系的配制：
将RT-PCR反应液、酶混合液、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ或HCV反应液Ⅲ分别按照体积比15：10：5的比例混合，反应体系为50μL；
RT-PCR反应程序设置如下：
（1）50℃，30min，1个循环；
（2）95℃，5min，1个循环；
（3）95℃，10s；
（4）60℃，40s；
（5）重复步骤（3）和（4），共进行45次循环
步骤（4）中60℃时进行荧光检测，检测通道为FAM、VIC和CY5。
在本发明的一个具体实施例中，本发明试剂盒进行HCV基因分型的设计思路如下表1所示：
表1、三管多重荧光PCR检测HCV基因型方案
本发明的试剂保存于—20℃，尽量避免反复冻融。
本发明试剂盒每次检测需设立HCV分型阳性对照和阴性对照。
进一步的，本发明还提供了一种使用本发明的试剂盒检测临床待检者血清或血浆中的HCV RNA及其基因型的方法，检测方法如下：
a、制备待检者血清或血浆中的丙型肝炎病毒RNA，使用HCV RNA提取试剂得到丙型肝炎病毒RNA；同时制备阴性对照和阳性对照的HCV RNA。
b、按照反应样本数n（n=待检样本数与对照2个总和再加1）配制RT-PCR反应体系：取RT-PCR反应液n×15μL、酶混合液n×10μL、HCV反应液Ⅰ或HCV反应液Ⅱ或HCV反应液Ⅲn×5μL于三个离心管（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）中混合均匀，低速离心数秒，每个离心管分别按照20μL/管分装到反应管中。
c、取制备好的待检样本、阴性对照和阳性对照HCV RNA各5μL分别加入到反应管Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中，低速离心数秒，置于全自动荧光PCR仪上。
d、按照以下反应程序运行：
（1）50℃，30min，1个循环；
（2）95℃，5min，1个循环；
（3）95℃，10s；
（4）60℃，40s；
（5）重复步骤（3）和（4），共进行45次循环
步骤（4）中60℃时进行荧光检测，检测通道为FAM、VIC和CY5。
e、PCR程序运行完成后按照仪器及软件要求保存结果和分析数据。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值，分子软件自动计算各样本的阴阳性。
更进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测丙型肝炎病毒试剂中的应用。以及所述的试剂盒在制备对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂中的应用。
本发明的原理是基于TaqMan水解探针荧光PCR原理，在TaqMan探针法的实时荧光PCR反应体系中，探针的5’端标记有报告基团（Reporter,R），如FAM、VIC、CY5等，3’端标记有荧光淬灭基团（Quencher,Q），如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’→5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。
多重荧光PCR是在同一个反应体系中同时扩增两对或两对以上的目标基因序列，可同时检测多种HCV基因型/亚型。多重荧光PCR技术的快速、简便、准确、特异地检测方法是很理想的检测方法，在众多的基因诊断项目中该方法准确、灵敏、快速、经济，大大降低了假阳性率，工作效率高，结果重现性好，且不必使用对人体有害的染色剂。实验证明，本发明的建立的检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便，可重复度高，可对丙型肝炎病毒及主要流行亚型（1b，2a，3a，3b，6a）进行快速定型检测，检测结果可辅助临床诊断并为抗病毒个体化治疗方案的制定提供参考。
附图说明
图1为20例临床HCV RNA阴性样本的扩增曲线；
图2为对丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒、E-B病毒、人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人类疱疹病毒6型、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、甲型流感病毒、乙型流感病毒、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等样本进行检测的扩增曲线；
图3为分别对HCV1b，2a，3a，3b，6a的样本进行检测的扩增曲线；
图4为HCV国家参考品稀释至浓度为50IU/ml的样本，使用本试剂盒进行重复检测的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒的制备
本发明的一种用于丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒，包括以下成分：RT-PCR反应液、酶混合液、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ、HCV反应液Ⅲ、HCV分型阴性对照以及HCV分型阳性对照。
1、引物、探针的设计与合成：
本发明在HCV5’非编码区设计进行HCV通用型检测的引物和探针，同时分别针对HCV的各亚型（HCV1b、HCV2a，HCV6a、HCV3b和HCV3a）的NS5B基因区段设计用于HCV基因分型的引物和探针。
①用于检测HCV通用型和1b亚型的引物序列和探针为：
HCV-F：5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’（SEQ ID NO.1所示）；
HCV-R：5’-CRACCCAACRCTACTCGGCT-3’（SEQ ID NO.2所示）；
HCV-P：5’-AGTACACCGGAATYGCCRGGAHGAC-3’（SEQ ID NO.3所示）；
HCV1b-F：5’-GCCCAGGAGCAACTTGAAAA-3’（SEQ ID NO.4所示）；
HCV1b-R：5’-GAGAGTAACTATGGAGTGAA-3’（SEQ ID NO.5所示）；
HCV1b-P：5’-CTCCATTGAGCCACTTGACCTACCT-3’（SEQ ID NO.6所示）；
其中通用型探针的5’端用FAM标记，3’端用BHQ1标记，1b亚型探针的5’端用VIC标记，3’端用BHQ1标记。R=A/G，Y=C/T，H=A/C/T。
②用于检测2a和6a亚型的引物序列和探针为：
HCV2a-F：5’-CGGAGGCTATGACCAGGTATTC-3’（SEQ ID NO.7所示）；
HCV2a-R：5’-GGCATCACGGGTGAGGTAATAG-3’（SEQ ID NO.8所示）；
HCV2a-P：5’-ACCTCCTCCCCTTGTCGTCCCGT-3’（SEQ ID NO.9所示）；
HCV6a-F：5’-CTTGCCTCAGGAAACTTGGG-3’（SEQ ID NO.10所示）；
HCV6a-R：5’-TAGCTTGGTCTTCACTGCCC-3’（SEQ ID NO.11所示）；
HCV6a-P：5’-TGCGAGCCTGGAGACATCGAGCCA-3’（SEQ ID NO.12所示）；
其中2a亚型探针的5’端用FAM标记，3’端用BHQ1标记，6a亚型探针的5’端用VIC标记，3’端用BHQ1标记。
③用于检测3a和3b亚型的引物序列和探针为：
HCV3a-F：5’-CCTTGACTTTGAAATGTACG-3’（SEQ ID NO.13所示）；
HCV3a-R：5’-GCTCTACTGGAGAGTAACTG-3’（SEQ ID NO.14所示）；
HCV3a-P：5’-ACTCTGTCACTCCGCTGGATTTACC-3’（SEQ ID NO.15所示）；
HCV3b-F：5’-GCACCAAAACCAAACTCACT-3’（SEQ ID NO.16所示）；
HCV3b-R：5’-GAGTAGGCAAAGCAGCAAAT-3’（SEQ ID NO.17所示）；
HCV3b-P：5’-CTGCGGGCCAGCTAGATCTTTC-3’（SEQ ID NO.18所示）。
其中3a亚型探针的5’端用FAM标记，3’端用BHQ1标记，3b亚型探针的5’端用VIC标记，3’端用BHQ1标记。
④内参系统为人GAPDH基因参照系统，其引物序列和探针为：
GAPDH-F：5’-CCGTCTAGAAAAACCTGCCAAA-3’（SEQ ID NO.19所示）；
GAPDH-R：5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3’（SEQ ID NO.20所示）；
GAPDH-P：5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’（SEQ ID NO.21所示），内参探针5’端用CY5标记，3’端用BHQ1标记。
2、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ、HCV反应液Ⅲ的制备
HCV反应液Ⅰ中含有用于检测HCV通用型和1b亚型的引物序列和探针，其浓度分别为：0.3-0.5μM，用TE缓冲液溶解。
HCV反应液Ⅱ中含有用于检测2a和6a亚型的引物序列和探针，其浓度分别为：0.2-0.4μM，用TE缓冲液溶解。
HCV反应液Ⅲ中含有用于检测3a和3b亚型的引物序列和探针，其浓度分别为：0.3-0.5μM，用TE缓冲液溶解。
3、RT-PCR反应液：含有Tris-HCl（pH=8.0）20mM、KCl100mM、dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP各0.4mM）、MgCl26mM。
4、酶混合液：含有200U/μL逆转录酶、40U/μL RNA酶抑制剂和2U/μL Taq酶。
5、HCV分型阴性对照：无HCV RNA的正常人血清样本；
6、HCV分型阳性对照：含有HCV1b亚型基因片段的非转染性体外转录RNA的人血清样本。
7、内参探针和引物的浓度为0.2-0.3μM。
实施例2本发明的一种丙型肝炎病毒及其基因分型多重荧光PCR检测试剂盒在检测丙型肝炎病毒核酸及其基因分型中的应用
1、检测样本：300例HCV RNA阳性临床样本，其中HCV1b患者132例，HCV2a患者69例，HCV3a患者43例，HCV3b患者32例，HCV6a患者16例，HCV其他亚型患者8例（通过测序确定），包含180例血浆样本和120例血清样本。
2、检测方法
本发明试剂盒（实施例1制备）进行HCV基因分型的设计思路如下表1所示：
表1、三管多重荧光PCR检测HCV基因型方案
本发明的试剂保存于—20℃，尽量避免反复冻融。
本发明试剂盒每次检测需设立HCV分型阳性对照和阴性对照。
检测方法如下：
a、采用硅胶柱离心法制备待检品血清或血浆中的丙型肝炎病毒RNA，使用病毒RNA提取试剂盒（江苏硕世生物科技有限公司）得到丙型肝炎病毒RNA；同时制备阴性对照和阳性对照的HCV RNA。
b、按照反应样本数303（待检样本数与对照2个总和再加1）配制RT-PCR反应体系：取RT-PCR反应液303×15μL、酶混合液303×10μL、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ或HCV反应液Ⅲ303×5μL于三个离心管（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）中混合均匀，低速离心数秒，每个离心管分别按照30μL/管分装到反应管中。
c、取制备好的待检样本、阴性对照和阳性对照HCV RNA各20μL分别加入到反应管Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中，低速离心数秒，置于ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测。
d、按照以下反应程序运行：
（1）50℃，30min，1个循环；
（2）95℃，5min，1个循环；
（3）95℃，10s；
（4）60℃，40s；
（5）重复步骤（3）和（4），共进行45次循环
步骤（4）中60℃时进行荧光检测，检测通道为FAM、VIC和CY5。
e、PCR程序运行完成后按照仪器及软件要求保存结果和分析数据，以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值，分子软件自动计算各样本的阴阳性。
3、结果
（1）准确率分析
本发明对通过测序已确诊的300例HCV RNA阳性临床样本（包含1b，2a，3a，3b和6a）进行检测，其中HCV通用检出率为100%，HCV1b患者132例，HCV2a患者69例，HCV3a患者43例，HCV3b患者32例，HCV6a患者16例，HCV其他亚型患者8例（表2），检测准确率为100%。
表2、检测准确率分析数据
感染亚型 感染亚型例数 检测亚型 测定亚型例数 准确率%
1b 132 1b 132 100
2a 69 2a 69 100
3a 43 3a 43 100
3b 32 3b 32 100
6a 16 6a 16 100
其他亚型 8 8 100
HCV通用型 300 300 100
（2）特异性分析
①临床特异性：采用20例临床HCV RNA阴性样本进行验证，结果20例临床HCV RNA阴性样本均无扩增曲线（图1），表明本试剂盒具有很好的临床特异性。
②交叉反应：采用与HCV易产生交叉反应的其它病原体核酸的验证其特异性，交叉反应验证的病原体信息见表3。
表3、用于交叉反应验证的病原体信息
病原体名称 浓度 来源
人巨细胞病毒 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
E-B病毒 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
人类免疫缺陷病毒 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
甲型肝炎病毒 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
乙型肝炎病毒 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
人类疱疹病毒6型 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
单纯疱疹病毒1型 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
单纯疱疹病毒2型 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
甲型流感病毒 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
乙型流感病毒 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
腺病毒41型 1×105TCID50/ml 泰州市疾病预防控制中心
痤疮丙酸杆菌 1×108CFU50/ml 泰州市疾病预防控制中心
金黄色葡萄球菌 1×108CFU50/ml 泰州市疾病预防控制中心
白色念珠菌 1×108CFU50/ml 泰州市疾病预防控制中心
结果分析发现人巨细胞病毒、E-B病毒、人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人类疱疹病毒6型、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、甲型流感病毒、乙型流感病毒、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等样本核酸均没有扩增（图2），表明以上在医学相关水平浓度的病毒和细菌对丙型肝炎病毒的检测均不存在交叉反应，说明本试剂盒具有很好的交叉反应特异性。
②亚型特异性：按照本试剂盒的操作说明，分别对HCV1b，2a，3a，3b，6a的样本进行检测，结果表明，各个亚型均能得到有效扩增，且不存在亚型间的交叉反应（图3）。
（3）最低检出限分析
将HCV国家参考品进行梯度稀释，形成浓度为106、105、104、103、102、50IU/ml系列样本，使用本试剂盒进行检测，每个浓度重复检测20次，将具有95%阳性检出率对应的浓度确定为本试剂盒的最低检出限。实验结果表明本试剂盒的最低检出限为50IU/ml（图4）。
综上结果表明，采用本发明的试剂盒能对丙型肝炎病毒及其基因型进行准确检测和分型分析，远远优于酶联免疫检测方法。本发明的检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便，可重复度高，可对丙型肝炎病毒及主要流行亚型（1b，2a，3a，3b，6a）进行快速定型检测，检测结果可辅助临床诊断并为抗病毒个体化治疗方案的制定提供参考。

Claims (11)

1.一种用于丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、酶混合液、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ以及HCV反应液Ⅲ；
其中，HCV反应液Ⅰ用于检测HCV通用型和1b亚型，其包括以下引物序列和探针：
用于HCV通用型检测的引物序列是：
HCV-F：5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’；
HCV-R：5’-CRACCCAACRCTACTCGGCT-3’；
对应的探针序列是：
HCV-P：5’-AGTACACCGGAATYGCCRGGAHGAC-3’；及
用于HCV 1b亚型检测的引物序列是：
HCV1b-F：5’-GCCCAGGAGCAACTTGAAAA-3’；
HCV1b-R：5’-GAGAGTAACTATGGAGTGAA-3’；
对应的探针序列是：
HCV1b-P：5’-CTCCATTGAGCCACTTGACCTACCT-3’；
其中，HCV反应液Ⅱ用于检测HCV 2a和6a亚型，其包括以下引物序列和探针：
用于HCV 2a亚型检测的引物序列是：
HCV2a-F：5’-CGGAGGCTATGACCAGGTATTC-3’；
HCV2a-R：5’-GGCATCACGGGTGAGGTAATAG-3’；
对应的探针序列是：
HCV2a-P：5’-ACCTCCTCCCCTTGTCGTCCCGT-3’；及
用于HCV 6a亚型检测的引物序列是：
HCV6a-F：5’-CTTGCCTCAGGAAACTTGGG-3’；
HCV6a-R：5’-TAGCTTGGTCTTCACTGCCC-3’；
对应的探针序列是：
HCV6a-P：5’-TGCGAGCCTGGAGACATCGAGCCA-3’；
其中，HCV反应液Ⅲ用于检测HCV 3a和3b亚型，其包括以下引物序列和探针：
用于HCV 3a亚型检测的引物序列是：
HCV3a-F：5’-CCTTGACTTTGAAATGTACG-3’；
HCV3a-R：5’-GCTCTACTGGAGAGTAACTG-3’；
对应的探针序列是：
HCV3a-P：5’-ACTCTGTCACTCCGCTGGATTTACC-3’；及
用于HCV 3b亚型检测的引物序列是：
HCV3b-F：5’-GCACCAAAACCAAACTCACT-3’；
HCV3b-R：5’-GAGTAGGCAAAGCAGCAAAT-3’；
对应的探针序列是：
HCV3b-P：5’-CTGCGGGCCAGCTAGATCTTTC-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括HCV分型阴性对照、HCV分型阳性对照及使用说明书。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的HCV分型阴性对照为无HCV RNA的正常人血清样本；所述的HCV分型阳性对照为含有HCV 1b亚型基因片段的非转染性体外转录RNA的人血清样本。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液中含有pH＝8.0的Tris-HCl 20mM、KCl 100mM、dATP，dGTP，dCTP，dTTP各0.4mM、MgCl26mM。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液中含有200U/μL逆转录酶、40U/μL RNA酶抑制剂和2U/μL Taq酶。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ或HCV反应液Ⅲ中所含有的探针序列的5’端分别采用不同的荧光报告基团进行标记。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，PCR反应液中还包括内参系统，所述的内参系统为人GAPDH基因参照系统，包括：
用于扩增人GAPDH基因的引物序列：
GAPDH-F：5’-CCGTCTAGAAAAACCTGCCAAA-3’；
GAPDH-R：5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3’；及
内参探针：
GAPDH-P：5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’，内参探针5’端用CY5标记，3’端用BHQ1标记。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，HCV反应液Ⅰ中含有的用于检测HCV通用型和1b亚型的引物序列和探针，其浓度分别为：0.3-0.5μM，用TE缓冲液溶解；HCV反应液Ⅱ中含有的用于检测2a和6a亚型的引物序列和探针，其浓度分别为：0.2-0.4μM，用TE缓冲液溶解；HCV反应液Ⅲ中含有的用于检测3a和3b亚型的引物序列和探针，其浓度分别为：0.3-0.5μM，用TE缓冲液溶解。
9.根据权利要求1-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，RT-PCR反应体系的配制和扩增程序如下：
RT-PCR反应体系的配制：
将RT-PCR反应液、酶混合液、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ或HCV反应液Ⅲ分别按照体积比15：10：5的比例混合，反应体系为50μL；
RT-PCR反应程序设置如下：
(1)50℃，30min，1个循环；
(2)95℃，5min，1个循环；
(3)95℃，10s；
(4)60℃，40s；
(5)重复步骤(3)和(4)，共进行45次循环
步骤(4)中60℃时进行荧光检测，检测通道为FAM、VIC和CY5。
10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒在制备检测丙型肝炎病毒试剂中的应用。
11.权利要求1-9任一项所述的试剂盒在制备对丙型肝炎病毒进行基因分型的试剂中的应用。
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