CN103184296A - 一种丙型肝炎病毒一步法基因分型检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丙型肝炎病毒(HCV)一步法基因分型RT-PCR检测方法以及试剂盒组成。采用聚合酶链式反应(PCR)结合TaqMan荧光探针技术对HCV进行基因分型检测，FAM通道检测1型(或6型)丙型肝炎病毒，HEX通道检测2型丙型肝炎病毒。试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合物、阴性对照、1/6型阳性对照和2型阳性对照，在分型检测体系中直接加入RT-PCR反应液、混合酶和HCV RNA模板，cDNA的合成与PCR分型检测反应在同一管中进行，不用增加额外的步骤，具有灵敏度高、特异性好、精密度高等优点。

Description

一种丙型肝炎病毒一步法基因分型检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于检测丙型肝炎病毒的基因分型检测试剂盒。

背景技术

丙型病毒性肝炎(viral hepatitis type C)是由多种丙型肝炎病毒(HCV)引起的，以肝脏损害的一组全身性传染病。丙型肝炎主要是通过输血或血制品、血透析、单采血浆还输血球、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。丙肝分布较广泛，容易演变为慢性肝炎、肝硬化和肝癌。

丙型肝炎病毒(HCV)为黄病毒科丙型肝炎病毒属，通过血液、肾移植、静脉注射毒品、性和母婴等途径传播。HCV的主要复制部位是肝脏，慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)，严重危害患者的生命健康。在被特异性检测之前，HCV一直被称为输血后非甲非乙型肝炎因子，直到1989年才应用分子克隆技术首次得以确认。HCV为单股正链RNA病毒，大小为30～38nm，有脂质包膜，目前，其复制的分子机制尚不完全清楚，对HCV引起急性肝损伤的机制也知之甚少。由于HCV感染的严格宿主限制性，仅感染人和黑猩猩，的那个屋感染模型较难建立。在细胞培养是，变异快，病毒的产量非常低。同时HCV似乎具有很强的躲避免疫攻击的能力。因此，目前尚未开发出有效的疫苗和治疗方案。由HCV病毒引起的肝脏疾病，在全球分布广泛，慢性丙型肝炎患者超过1.7亿，接近全球人口3％，许多患者长期无症状直至严重肝损害后才出现临床表现，丙型肝炎已称为威胁人类身体健康的世界性医学难题。应引起社会各界的高度重视，必须加强预防，减少发病，控制流行。

在HCV治疗方面，临床上更多应用干扰素(interferon，INF)和利巴韦林(ribavirin，RBV)联合治疗HCV。研究表明，不同基因型HCV感染者在用α-干扰素联合利巴韦林治疗过程中所产生的持续病毒学应答(sustained virologicalresponse，SVR)比例有所不同：1型、4型、5型和6型持续病毒学应答比例为30％，2型和3型持续病毒性应答比例为65％。因此，HCV基因分型在HCV感染、传播、诊断、诊疗、预防等方面均有重要意义，可作为HCV感染的诊断和重要的预后指标，有助于针对不同HCV基因型感染患者用药剂量及相关疗程的监测。

中国流行的HCV主要基因型有1型、2型和6型等，结合HCV各基因型对干扰素治疗所产生的持续病毒学应答的差异及其在中国的流行态势，区分HCV1/6型和2型对丙型肝炎临床诊断治疗具有重要的现实意义。

目前常用的HCV检测方法主要有：

1.测序法：采用特异性PCR引物扩增部分病毒基因组区域，联合多部位的测序结果进而描绘系统进化树。直接测序法的优点是可提供被测区域的全部核苷酸序列/遗传信息，包括病毒基因组内部的多态性，并可以发现新的基因变异形式，缺点是操作繁琐，成本较高，对混合感染不易确定。

2.型特异性RT-PCR方法：通过对套式RT-PCR引物设计的优化，使扩增片断大小不同，达到分型目的。改良后的方法可将6个基因型完全分开，并可以区分混合感染。该方法的优点是成本较低，不需要特殊设备，缺点是偶尔会出现较弱的扩增条带，难以判别。

3.型特异性探针杂交法：通过将生物素或荧光素标记型特异性探针固相化在膜或芯片上，与RT-PCR扩增的病毒产物进行杂交后，经扫描判读出HCV基因型，代表性试剂为Inno-LiPA II。该方法准确性和灵敏性较高，在国外报道的HCV基因分型研究中常用，缺点是操作繁琐，成本较高。

4.基因芯片法：近来开发的新方法，与测序法的符合率在90％以上，适用于大量样本的检测，但需要专用仪器设备进行检测分析。

5.基于TaqMan水解探针实时荧光PCR技术是国内临床分子诊断中应用最为广泛的技术之一。TaqMan探针是一段与靶基因特异性结合的寡核苷酸序列，其5′-端标记一个荧光报告基团，如6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)和六氯-6-羧基荧光素(HEX)等，在探针的3′-端则标记一个淬灭基团，如6-羧基-四甲基罗丹明(TAMRA)等。在PCR反应过程中，该技术在利用热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)5′→3′聚合酶活性的同时，还利用其具有对PCR反应延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列5′→3′核酸外切酶活性；根据荧光共振能量传递(FRET)原理：完整探针因荧光报告基团和淬灭基团距离很接近，荧光报告基团发射的荧光被淬灭；当探针降解时，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光由于不能被淬灭而可以被仪器检测到。当PCR反应进行聚合后的链取代步骤，在链延伸同时Taq DNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性使得TaqMan水解探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射出来，并由实时荧光PCR仪实时检测，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系，扩增仪软件系统可以自动计算获得PCR扩增曲线。

发明内容

结合HCV在中国的流行态势及HCV检测技术存在的优缺点，利用PCR-荧光探针法，以病毒RNA为模板，采用特异性引物探针，辅以逆转录酶和TaqDNA聚合酶，经一步法荧光RT-PCR实验，快速、准确地对国内常见的1/6型和2型丙型肝炎病毒进行基因分型检测，使丙型病毒性肝炎的基因分型有更为科学、便捷的检测诊断手段，可为医院、病人普遍接受。

本发明的技术方案为：提供一种丙型肝炎病毒基因分型检测方法及试剂盒，采用一步基因分型RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增：反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短，无需多次重复循环。本发明方法操作简便、敏感度高、结果明晰。

本发明提供的试剂盒包括：RT-PCR反应液、酶混合物、阴性对照、1/6型阳性对照和2型阳性对照。与其他试剂盒(如，上海之江生物科技有限公司生产的丙型肝炎病毒(HCV)基因分型测定试剂盒(荧光PCR法)区分HCV基因型为1型和非1型)不同，本发明试剂盒中RT-PCR反应液包含引物探针，省去了探针单独加样的操作，并加入保护剂以稳定RT-PCR反应液，且本试剂盒对HCV基因分型为1/6型和2型。

本发明通过提取HCV RNA，其中所述的RT-PCR反应液为Tris·HCl(pH8.3)20mM，KCl 100mM，明胶0.2mg/mL，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.4mM，MgCl₂ 6mM及一对HCV特异性扩增引物、HCV 1/6型特异性荧光探针和HCV 2型特异性荧光探针的混合液；所述的酶混合物为逆转录酶(5U/μL)和Taq DNA聚合酶(3U/μL)的混合物；所述的阴性对照为无HCV RNA的正常人血清；所述的1/6型阳性对照为含有HCV 1型和6型基因片段的非传染性体外转录RNA的正常人血清；所述的2型阳性对照为含有HCV 2型基因片段的非传染性体外转录RNA的正常人血清。检测用的HCV片段特异性引物分上游引物和下游引物：

上游引物序列<SEQ ID No.3>为：5′-CCGGTGAGTACACCGGAAT-3′；

下游引物序列<SEQ ID No.4>为：5′-ACTCGGCTAGCAGTCTCG-3′；

HCV 1/6型特异性探针序列<SEQ ID No.5>为：

5′-FAM-GCTCAATGCCTGGAGATTTGG-TAMRA-3′；

HCV 2型特异性探针序列<SEQ ID No.6>为：

5′-HEX-ACTCTRTGCCCGGTCATTTGG-TAMRA-3′。

本发明提供的试剂应于-20℃冷冻保存，并尽量减少冻融次数(5次以内)。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立HCV 1/6型阳性对照、HCV 2型阳性对照和阴性对照。

扩增检测：

1.按反应样本数n(n＝待检样品数+对照品3个)配制反应液：取RT-PCR反应液n×29μL、酶混合物n×1μL于一离心管中混匀；低速离心数秒，按每管30μL分装到反应管中。

2.取样本提取物、对照品提取物各20μL分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置于全自动荧光定量PCR仪反应板中。

3.50℃反应15min，然后95℃保温2min，再按94℃10s→60℃45s，循环45次，并于60℃，45s时分别采集FAM和HEX荧光通道内的信号。

4.仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值，在双通道(FAM和HEX)下检测反应始终扩增产物的荧光强度：Ct值为0或空白：丙型肝炎病毒呈阴性；FAM通道检测Ct值小于等于40：呈阳性，病人丙型肝炎病毒1/6型感染；HEX通道检测Ct值小于等于40：呈阳性，病人丙型肝炎病毒2型感染。

本发明方法原理是基于TaqMan水解探针荧光PCR原理，以病毒RNA为模板，采用病毒基因组特异性引物探针，辅以逆转录酶和Taq DNA聚合酶，经一步法荧光RT-PCR实验，可对丙型肝炎病毒RNA模板进行快速、准确分型检测分析；从逆转录到荧光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。所以，本发明的检测方法及试剂盒分型特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰，可用于血清或血浆中丙型肝炎病毒的基因分型检测，非常适合医院检验科室、传染病防治中心以及各级丙型肝炎检测单位使用。

具体实施方式

实施例1一种丙型肝炎病毒一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒

1.丙型肝炎病毒核酸RNA的提取

使用QIAGEN RNA纯化试剂盒提取丙型肝炎病毒RNA。

2.逆转录及实时基因分型PCR扩增(每人份50μL体系)

a、一步基因分型RT-PCR反应液的配制(见下表)：

RT-PCR反应液	29μL
		酶混合物	1μL
模板RNA	20μL
		反应液体积	50μL

b、一步基因分型RT-PCR反应程序：

[1]50℃              15min

[2]95℃              2min

[3]94℃              10s

[4]60℃              45s

[5]Go to[3]，45 cycles

于第四步60℃，45s时采集荧光

[6]End。

3.检测：

本发明使用ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行检测。

4.结果判断：

荧光PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。

实施例2临床检测

用上述方法对200例丙型肝炎病毒临床样品进行荧光分型检测，其中丙肝患者56例，检出阳性率28％，其中，1/6型检出阳性率为92％，2型检出阳性率为8％。本发明的检测方法及试剂盒基因分型特异性强、敏感度高、操作简便、可重复度高，可对丙型肝炎病毒进行快速定性及分型检测，并可替代一直沿用的传统ELISA诊断方法。采用硅胶提取柱提取RNA，保证了模板的纯度。同时，利用一步荧光RT-PCR技术。在核酸提取结束后直接加入到反应体系中，cDNA的合成和PCR反应在一管，无需增加额外操作步骤。该操作既确保了扩增结果的准确性和灵敏度，又缩短了时间、减少了污染、提高了荧光PCR基因分型检测方法的简便性，不仅可用于HCV分型检测，也可作为临床实验室对HCV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段。

Claims (5)

1.一种丙型肝炎病毒一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：本发明通过考察人体丙型肝炎病毒基因组全序列，并对检索所得HCV各基因型序列之间的特异性位点进行差异比对分析，设计出一对特异性扩增引物、一条HCV1/6型特异性荧光探针和一条HCV 2型特异性荧光探针，采用实时荧光定量RT-PCR方法扩增并分型检测目的基因。

2.权利要求1所述的丙型肝炎病毒一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：丙型肝炎病毒特异性PCR扩增的基因序列为：

<SEQ ID No.1>

5′-CCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGT-3′，

<SEQ ID No.2>

5′-CCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATAAACCCACTCTRTGCCCGGTCATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGT-3′，

丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒扩增序列全长104bp，属5′-端非编码区，为单拷贝序列。

3.如权利要求1所述的丙型肝炎病毒一步法基因分型PCR检测试剂盒，一对HCV特异性扩增引物序列中一条序列与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的部分序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的部分序列互补；HCV 1/6型特异性探针与SEQ ID No.1中所示的部分序列相同或互补；HCV 2型特异性探针与SEQ ID No.2中所示的部分序列相同或互补，其中，所述的一对HCV特异性引物，其序列可以选自SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，

<SEQ ID No.3>为：5′-CCGGTGAGTACACCGGAAT-3′，

<SEQ ID No.4>为：5′-ACTCGGCTAGCAGTCTCG-3′；

一对HCV特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上；所述的HCV 1/6型特异性探针，可以选自SEQ ID No.5的序列，

<SEQ ID No.5>为：5′-FAM-GCTCAATGCCTGGAGATTTGG-TAMRA-3′，

其中探针5′-端标记FAM荧光基团，探针3′-端均标记淬灭基团(如，TAMRA)，HCV片段特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上；所述的HCV 2型特异性探针，可以选自SEQ ID No.6的序列，

<SEQ ID No.6>为：5′-HEX-ACTCTRTGCCCGGTCATTTGG-TAMRA-3′，

其中探针5′-端标记HEX荧光基团，探针3′-端均标记淬灭基团(如，TAMRA)，HCV片段特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。

4.如权利要求1所述的丙型肝炎病毒一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液(含有引物探针)、酶混合物、阴性对照、1/6型阳性对照和2型阳性对照，其中，RT-PCR反应液为Tris·HCl(pH8.3)20mM，KCl 100mM，明胶0.2mg/mL，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.4mM，MgCl₂6mM及一对HCV特异性扩增引物、HCV 1/6型特异性荧光探针和HCV 2型特异性荧光探针的混合液；所述的酶混合物为逆转录酶(5U/μL)和Taq DNA聚合酶(3U/μL)的混合物；所述的阴性对照为无HCV RNA的正常人血清；所述的1/6型阳性对照为含有HCV 1型和6型基因片段的非传染性体外转录RNA的正常人血清；所述的2型阳性对照为含有HCV 2型基因片段的非传染性体外转录RNA的正常人血清。

5.如权利要求1中所述的丙型肝炎病毒一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒的RT-PCR反应液的配制和扩增程序如下：

a、一步基因分型RT-PCR反应液的配制：

将RT-PCR反应液、酶混合物按照29μL∶1μL的比例混合，并加入20μL RNA模板，反应液体积为50μL；

b、一步基因分型RT-PCR反应程序：

[1]50℃        15min

[2]95℃        2min

[3]94℃        10s

[4]60℃        45s

[5]Go to[3]，45cycles

于第四步60℃，45s时采集荧光

[6]End。