CN109593887B

CN109593887B - 一种丙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒

Info

Publication number: CN109593887B
Application number: CN201811633137.5A
Authority: CN
Inventors: 蒋析文; 夏乔; 杨鸿辉; 李汉荣; 廖丽丽; 唐康明; 许晓珊
Original assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109593887A

Abstract

本发明提供了一种丙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒，具体地，本发明利用实时荧光聚合酶链式反应技术对未知HCV RNA及其各种基因型病毒的核酸进行鉴别并且定量的检测试剂盒，可广泛应用于HCV病毒引起的丙型肝炎的窗口期检测、临床诊断、科学研究、疗效跟踪等多个领域。

Description

一种丙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种丙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是一种全球性传染的病原体，可引起急、慢性病毒性肝炎，慢性肝炎迁延不愈，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎的感染呈世界性分布，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，为单股正链RNA病毒,可分为6个基因型及不同亚型，中国的主要流行型是基因1b型和2a型。在HCV急性感染期，在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到10⁵～10⁷拷贝/ml。在HCV慢性感染者中，HCV RNA水平在不同个体之间存在很大差异，变化范围在5×10⁴～5×10⁶拷贝/ml之间，但同一名患者的血液中HCV RNA水平相对稳定。

检测抗-HCV抗体的各种试剂盒也相继问世,如放射免疫诊断(RIA)或酶联免疫试验(ELISA)检测血清中HCV病毒抗原。但是检测抗体只能反映HCV感染的免疫状态,间接提供HCV感染的证据,而且由于大多数丙型肝炎患者的HCV相对滴度低,抗原、抗体蛋白的变性、较长的“窗口期”等原因,仅仅依靠抗原或抗体血清学的检测已经不是最可靠的方法。通常,HCV感染12～14周后,血清中才能检出抗HCV,而HCV RNA在感染后1～3周即可检出。Schreiber等证明使用PCR检测技术可大大提高HCV感染的准确性,有利于疾病的早期诊断,可将“窗口期”缩短平均56～60d,对“窗口期”感染的筛选和提高输血安全也有重要意义。

此外,在抗病毒药物治疗中,HCV RNA是对其疗效评价的指标之一,检测HCV RNA的滴度和基因型可对用药和预后提供参考。以干扰素治疗为例,治疗前血清HCV RNA水平低者通常应答好于血清HCV RNA水平高者；基因1型的患者通常比基因2型的应答差。治疗过程中,HCV RNA的动态监测同时还可为临床上的用药剂量、时间等提供依据。

因此，本领域迫切需要开发能够高灵敏度，窗口期短，方便快捷的HCV检测方法以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏度、使用便捷的丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)核酸定量检测试剂盒。

本发明的第一方面，提供了一种用于检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的PCR引物对组，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对组还包括第二引物对，所述第二引物对为内参引物对，包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:5所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种用于检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的探针组，所述探针组包括：如SEQ ID NO.:3所示的丙型肝炎病毒特异性探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:6所示的内参探针。

本发明的第三方面，提供了一种用于检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的试剂盒，所述试剂盒包括HCV反应液A，所述HCV反应液A包括本发明第一方面所述的PCR引物对组。

在另一优选例中，所述HCV反应液A还包括本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括所述HCV反应液B，所述HCV反应液B包括选自下组的一种或多种组分：

热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs和RNasin。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括所述HCV反应液C，所述HCV反应液C包括选自下组的一种或多种组分：

Tris-HCl、MgCl₂、KCl、(NH₄)₂SO₄、和Tween-20。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括HCV定量参考品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括HCV强阳性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括HCV临界阳性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括内标质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括逆转录试剂。

本发明的第四方面，提供了一种检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测样本，所述样本中含有HCV RNA；

(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应，绘制扩增曲线，并计算阈值循环值从而获得样本核酸的定量检测结果：

其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、用于将待检测样本中HCV RNA逆转录为cDNA的逆转录试剂、本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述扩增反应体系包括所述HCV反应液C、所述反应液A、和所述反应液B。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于HCV核酸定量检测。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：灵敏度示意图。

图2：定量参考品检测结果。

图3：定量参考品标准曲线。

图4：强阳性质控品检测结果。

图5：临床阳性质控品检测结果。

图6：阴性质控品检测结果。

图7：对照引物1的灵敏度示意图。

图8：对照引物2的灵敏度示意图。

具体实施方式

本发明属于病原体分子检测领域，涉及一种高灵敏度的丙型肝炎病毒RNA的检测试剂盒，具体涉及一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术对未知HCV RNA及其各种基因型病毒的核酸进行鉴别并且定量的检测试剂盒，可广泛应用于HCV病毒引起的丙型肝炎的窗口期检测、临床诊断、科学研究、疗效跟踪等多个领域。

HCV病毒体呈球形，直径小于80nm(在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36-62nm)，为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。HCV仅有Huh7,Huh7.5,Huh7.5.1三种体外细胞培养系统，黑猩猩可感染HCV，但症状较轻。HCV－RNA大约有9500－10000bp组成，5′和3′非编码区(NCR)分别有319-341bp，和27-55bp，含有几个顺向和反向重复序列，可能与基因复制有关。在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框(ORF)，其中基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3',能编码一长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括三种结构蛋白，即分子量19KD的核衣壳蛋白(或称核心蛋白，Core)和两种糖蛋白(分子量为33KD的E1蛋白，分子量72Kd的E2蛋白)，p7编码一种膜内在蛋白，其功能可能是一种离子通道。非结构蛋白部分则包括NS2，NS3,NS4A，NS5A和NS5B，非结构蛋白对比病毒的生活周期非常重要。NS2和NS3具有蛋白酶活性，参与病毒多聚蛋白前体的切割。此外，NS3蛋白还具有螺旋酶活性，参与解旋HCV-RNA分子，以协助RNA复制，NS4的功能尚不清楚。NS5A是一种磷酸蛋白，可以与多种宿主细胞蛋白相互作用，对于病毒的复制起重要作用。而NS5B则具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，参与HCV基因组复制。

全世界HCV基因型已公认的有Ⅰ/1a、Ⅱ/1b、Ⅲ/2a、Ⅳ/2b、Ⅴ/3a及Ⅵ/3b型。但还没有统一。我国情况，除Ⅱ/1b和Ⅲ/2a占大多数外，极少数地区有Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型存在。整体上看南方约占80％为Ⅱ型，北方50％为Ⅲ型。

HCV具有显著异源性和高度可变性，对已知全部基因组序列的HCV株进行分析比较其核苷酸和氨基酸序列存在较大差异。并表现HCV基因组各部位的变异程度不相一致，如5′-CR最保守，同源性在92-100％，而3′NCR区变异程度较高，在HCV的编码基因中，C区最保守、非结构(NS)区次之，编码囊膜蛋白E2/NS1可变性最高称为高可变区。

本发明基于实时荧光PCR技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-PCR扩增，用于血清或血浆标本中HCV RNA的定量检测。利用荧光信号达到某一阈值时的循环次数与起始模板DNA量的对数之间的严格线性关系,进行起始模板定量,可真实反映HCV的复制情况。另外，本试剂盒还带有内参物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。

多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术，该方法具有快速、特异、灵敏、自动化程度高等特点，结合防污染技术处理，特别适合于大规模、快速诊断的需求。该技术采用不同荧光基团对特异性探针进行标记，配合多重PCR技术，可以在同一个PCR反应管中对多种类型的病毒同时进行扩增，荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病原体类型的目的。由于，荧光PCR技术具有扩增片段短，引物、探针具有双重特异等优点，因此，将多重实时荧光PCR技术应用于艾滋病病毒的快速检测，能提高检测鉴别效率，在短时间内判断疑似病例或可疑媒介是否感染艾滋病病毒及同时确诊所感染的型别，便于临床及时采取必要的防控和治疗措施，防止这些病毒继续传播，并提高诊疗效率，为快速诊断、有效监测和针对性治疗提供支持和依据。

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响多重PCR反应的因素有很多，比如：

(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

在本发明的一个优选地实施方式中，提供了一种荧光定量PCR方法定量检测HCVRNA的方案，具体涉及一种利用实时荧光PCR技术对HCV RNA核酸检测并且进行定量的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：

(1)针对HCV基因组高度保守区设计了特异性的引物和探针；

(2)通过一步法逆转录样本RNA得到cDNA；

(3)通过仪器自动绘制扩增曲线和计算阈值循环值，得到样本核酸的定量检测结果；

(4)通过强阳控质控品、临界阳性质控品、定量参考品、阴性质控品和内标质控品的质量控制，确保检测结果的有效性。

本发明的具体实施方式如下：

对GENBANK上所有已知的丙型肝炎病毒各致病性型别的核酸序列进行比对的基础上，分别寻找各型别核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶、逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、RNA酶抑制剂的RT-PCR反应酶系以及含有Mg²⁺等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。

根据本发明的实施方案，本发明所涉及的试剂盒主要包括：(1)RT-PCR反应液(HCV反应液C)、引物探针混合液(HCV反应液A)、RT-PCR反应酶系(HCV反应液B)，阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、定量参考品和内标质控品；(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的实施方案，引物探针混合液由2条HCV特异性的正、反向引物，2条内参正、反向引物，1条特异性的HCV探针和1条特异性的内参探针组成。

根据本发明的实施方案，丙型肝炎病毒特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-CGTCAAGTTCCCGGGTGGCGGT-3’(SEQ ID NO.:1)和5’-GCCAACCTGCCCACCCACAGCC-3’(SEQID NO.:2)，丙型肝炎病毒特异性探针的序列是5’-CCATAAAGAGGCCAAGGG-3’(SEQ ID NO.:3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团Eclipse；

内参的正向和反向引物的序列分别是5’-CGAGGGACTTCTGATTTGAT-3’(SEQ IDNO.:4)和5’-ATTGAAGAAGAGAGTGGCATT-3’(SEQ ID NO.:5)，内参探针的序列是5’-ATCATCACCAGGCACAACCCGAAGC-3’(SEQ ID NO.:6)，探针的两端分别结合有荧光发生基团YELLOW和荧光淬灭基团BHQ1；

本发明的一种优选实施方案中，HCV反应液A中引物浓度均为0.01～0.02mmol/L，探针浓度均为0.0015～0.005mmol/L。

本发明的另一种优选实施方案中，HCV反应液B由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs和RNasin组成，热启动酶和逆转录酶可选择达安基因生产的产品，dNTPs和RNasin可采用市售产品，优选地，每人份HCV反应液B中热启动Taq酶的用量为3～6U；逆转录酶用量为2～5U；dNTPs用量为10～15mmol、RNasin用量为15～30U。

本发明的另一种优选实施方案中HCV反应液C由pH值为8.8～9.0的50mmol/LTris-HCl、8～10mmol/L MgCl₂、200～300mmol/L KCl、10～20mmol/L(NH₄)₂SO₄、0.1％Tween-20组成。

根据本发明的实施方案，本发明试剂盒提供了质控品，分别为阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、定量参考品和内标质控品。阴性质控品为HCV-RNA阴性的健康人血浆，内标质控品为浓度1.0×10⁵IU/mL的人工合成含内标片段的病毒样颗粒。强阳性质控品，临界阳性质控品和定量参考品为人工合成的病毒样颗粒，病毒样颗粒内含有本发明设计的HCV目的片段，选择浓度为1.0×10⁵-5.0×10⁶IU/ml的RNA病毒样颗粒制备成强阳性质控品和1.0×10²-1.0×10⁴IU/ml的RNA病毒样颗粒制备成临界阳性质控品；定量参考品选择浓度为：定量参考品1(1.0×10⁶IU/mL)，定量参考品2(1.0×10⁵IU/mL)，定量参考品3(1.0×10⁴IU/mL)，定量参考品4(1.0×10³IU/mL)的RNA病毒样颗粒制备而成。试剂盒中进行待检标本检测时，必须同时提取两种质控品和定量参考品，提取时加入内标质控品，用于对核酸提取和PCR扩增整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现，结果仅当阳性质控品检测时FAM通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测荧光信号均呈阴性时，且在VIC检测通道有对数增长期，待检标本的检测结果才有效。

本发明的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为：步骤①逆转录50℃，15分钟，1个循环；步骤②预变性95℃，15分钟，1个循环；步骤③变性-退火94℃，15秒随后55℃45秒，45个循环；在每一次步骤③循环的55℃45秒完成后，进行收集荧光信号。

根据本发明的实施方案，检测单人份的PCR反应液由HCV反应液C、反应液A、反应液B按15μl、2μl、3μl的体积混合成总体积20uL的反应液混合物，加入40uL待测样本的核酸，然后进行实时荧光定量PCR反应。

本发明的另一个优选实施方案是试剂盒扩增待检标本由适用仪器ABI Prism7300，ABI Prism 7500，LightCycler480，Abbott m2000system进行，检测操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生，检测结果可用于临床参考。

本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于HCV病毒快速诊断、辅助临床研究及常规监测等多个领域研究。

本发明的主要优点在于：

(1)可对HCV病毒不同亚型的核酸进行扩增检测，可反映出样本中HCV病毒感染的状态，相对于抗体反应检测，大大缩短了检测的“窗口期”，有助于HCV病毒的早期诊断和治疗,对于HCV病毒的监测和防控及丙型肝炎的临床诊断有重大意义；

(2)一份样本一次检测过程只需1.5～2h，相对于已有的核酸杂交法检测技术，检测所需时间缩短了一半以上；

(3)试剂采用人工体外合成的包含HCV RNA的病毒样颗粒作为阳性质控品，即可以对试剂进行质控，比质粒作为质控更具有效性和科学性，同时对操作者的安全性大大提高；

(4)试剂盒中带有阴性质控品，阳性质控品和内标物质，可用于对样本核酸提取和PCR扩增的全过程进行监控，减少假阴性的出现；

(5)试剂采用RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系的大包装设置，适合多种荧光检测设备，具有适用性更广的特点；

(6)本发明的方法所需样本少、性能稳定高效、准确性高。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1丙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒(PCR-荧光探针法)

应用一步法实时荧光PCR反应模式，使用荧光定量PCR仪进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号对血清或血浆样本中丙型肝炎病毒(HCV)RNA进行定量检测，适用于丙型肝炎病毒(HCV)感染的辅助诊断和感染者药物治疗的疗效监测。检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。

试剂盒包含的试剂：

表1

检验方案：

1.样本处理和核酸提取(样本处理区)

本试剂盒中的阴性质控品、强阳性质控品和临界阳性质控品均参与提取，用于对环境进行监控和PCR检测试剂的质控。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，所以须配套提取试剂使用，建议使用量是向每一个待提取样本加入4μl内标溶液，用于提取过程的质控。强阳性质控品、临界阳性质控品和阴性质控品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求。

2.PCR试剂准备(试剂准备区)

大包装规格试剂适用：

从试剂盒中取出HCV反应液A、HCV反应液B、HCV反应液C，室温融化后振荡混匀，8,000rpm离心数秒后使用。

取N个(N＝待测样本个数+1个阴性质控品+1个强阳性质控品+1个临界阳性质控品+4个阳性定量参考品)PCR反应管，HCV单人份扩增体系配制如下表：

表2

将各组分充分混合，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将20μl扩增体系分装到PCR管中。

3.加样(样本制备区)

往上述HCV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品以及阳性定量参考品(1、2、3、4)核酸40μl。盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。

4.PCR扩增(扩增和产物分析区)

将反应管放入仪器样品槽内。ABI Prism 7500仪器设置(ABI Prism 7300仪器参照此操作，具体操作见说明书)。打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控(NTC)、阳性质控以及未知样本(Unknow)、阳性定量参考品(Standard)，并在“Sample Name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：TAMRA，ReporterDye2：VIC，Quencher Dye2：none，Passive Reference：NONE。打开instrument窗口，设置循环条件如下：

50℃15分钟，1个循环；

95℃15分钟，1个循环；

94℃15秒→55℃45秒(收集荧光)，45个循环。

设置完成后，保存文件，运行程序。

5.结果分析

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使基线位于扩增曲线指数期,调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果，记录未知样本数值(C)。

6.质量控制

阴性质控品：FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为对数增长期；HCV阳性质控品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型扩增曲线，以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

7.结果判断

7.1如果FAM检测通道无对数增长期，且在VIC检测通道有对数增长期，则判样品的HCV RNA浓度小于检测灵敏度。

7.2如果FAM荧光信号增幅明显，扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，且Ct值<45，则按以下方法判断：

若样品的浓度50IU/ml≤C≤1.00E+008IU/ml，则该样品的HCV RNA浓度＝C IU/ml；

若样品的浓度C>1.00E+008IU/ml，则该样品的HCV RNA浓度>1.0×10⁸IU/ml。如果需要精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的HCV RNA浓度＝(C×稀释倍数)IU/ml；

若样品的20IU/ml≤C＜50IU/ml，同时VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，则该样品的HCV RNA浓度仅作参考；

若样品的浓度C＜20.0IU/ml，同时VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，则该样品的HCV RNA浓度低于试剂盒检测下限。

8.结果解释

8.1.每次实验均需检测阴性质控品，HCV强阳性质控品，HCV临界阳性质控品，质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定。

8.2.阳性结果判定标准：扩增曲线在FAM,VIC检测通道均有对数增长期；或扩增曲线在FAM检测通道有对数增长期，在VIC检测通道无对数增长期。

8.3.阴性结果判定标准：扩增曲线在FAM检测通道无明显对数增长期，在VIC检测通道有对数增长期。

8.4.报告建议采用以下格式：

阴性结果报告：样本未检测到丙型肝炎病毒RNA，浓度低于试剂盒的灵敏度；

阳性结果报告：

1)当样本试验结果HCV RNA浓度在50IU/ml≤C≤1.00E+008IU/ml时，报告格式为：样本检测到丙型肝炎病毒RNA，其浓度为C IU/ml；

2)当样本的试验结果HCV RNA浓度C>1.00E+008IU/ml时，报告格式为：样本检测到丙型肝炎病毒RNA浓度大于1.0×10⁹IU/ml，如经稀释后检测，则报告格式为：样本检测到丙型肝炎病毒RNA，浓度为(C×稀释倍数)IU/ml。

3)当样品的试验结果20IU/ml≤C＜50IU/ml，同时VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，报告格式为：样本的则该样品的丙型肝炎病毒RNA载量较低，测量值仅供参考；

4)当样本的试验结果HCV RNA浓度C＜20IU/ml，同时VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，报告格式为：丙型肝炎病毒RNA含量低于试剂盒的检测下限；若内标检测通道扩增曲线无对数增长期或无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复检测。

8.5.本检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段。

实施例2：核酸灵敏度检测实验

核酸检测限样本为含有HCV病毒的国家标准物质，稀释到50IU/mL、20IU/mL、10IU/mL，作为核酸检测限参考品，每个参考品重复20次测试；阴性对照为阴性血浆；

取提取后的阴性对照和灵敏度参考品核酸40μL，加样至步骤二配制的RT-PCR反应体系的八连管中，使每管RT-PCR反应液总体积为60μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒；用于RT-PCR扩增；

RT-PCR的扩增条件：第一阶段，50℃逆转录15分钟；第二阶段95℃15分钟预变性，第三阶段，(94℃15秒→55℃45秒，收集荧光)×45个循环扩增，得到结果如下表。

表3灵敏度检测结果

图1表示试剂盒的核酸灵敏度和突变灵敏度检测结果与理论值相符，表明引物探针具有较好的特异性，灵敏度检测良好。

实施例3：准确性检测

准确性参考品共7份，编号分别为L1-L7，含有HCV病毒的国家标准物质。

取提取后的阴性对照和准确性参考品核酸40μL，加样至步骤二配制的RT-PCR反应体系的八连管中，使每管RT-PCR反应液总体积为60μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒；用于RT-PCR扩增；

RT-PCR的扩增条件：第一阶段，50℃逆转录15分钟；第二阶段95℃15分钟预变性，第三阶段，(94℃15秒→55℃45秒，收集荧光)×45个循环扩增，得到结果如下表：

表4

理论值与实测值的对数值偏差在±0.5的范围，且线性相关系数r≥0.980，表明试剂盒在50IU/mL-1E7IU/mL范围内定值准确。

实施例4临床样本检测

实验步骤：同实施例1。

使用本试剂盒进行检测，上机图及定量结果见图2、图3。图2、图3为阳性定量参考品1-4和标准曲线，图4为强阳性质控品，图5为临床阳性质控品，图6为阴性质控品。

从以上图表可知，标准曲线的斜率为-3.374，相关系数为0.999，HCV强阳性质控品、HCV临界强阳性质控品和阴性质控品均满足试剂盒要求，可以用作结果判定。

对比例1

本发明人针对HCV保守基因设计了十数对PCR扩增引物，其中绝大部分引物的灵敏度较低、特异性较差，存在漏检，无法满足检测需要，典型的普通PCR引物序列和检测效果数据如下：

对照引物对1

上游引物:(SEQ ID NO.:11)；5’-GACGTCGTTGTCGTGGCAAC-3’

下游引物:(SEQ ID NO.:12)；5’-CGTCACCCAGACAGTCGATT-3’

对照引物对2：

上游引物:(SEQ ID NO.:13)；5’-TAATGTTTCTGTCACCCAG-3’

下游引物:(SEQ ID NO.:14)5’-CGTATGACACAGGCTGTGC-3’

具体检测步骤、检测条件、同以上实施例，使用对照引物对1的检测结果如图7所示，检测结果表明对照引物对1在部分样本中无法检测出靶基因，灵敏度差检出率仅为1/20。

使用对照引物对2的检测结果如图8所示，检测结果表明对照引物对2的特异性同样极差，且漏检情况严重，灵敏度检出率为0/20。综上所述，对照引物对1和对照引物对2均不能满足HCV核酸定量的检测的要求。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中山大学达安基因股份有限公司

<120> 一种丙型肝炎病毒核酸定量检测的试剂盒

<130> 00017

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

cgtcaagttc ccgggtggcg gt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gccaacctgc ccacccacag cc 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

ccataaagag gccaaggg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

cgagggactt ctgatttgat 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

attgaagaag agagtggcat t 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

atcatcacca ggcacaaccc gaagc 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

gacgtcgttg tcgtggcaac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

cgtcacccag acagtcgatt 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

taatgtttct gtcacccag 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

cgtatgacac aggctgtgc 19

Claims

1.一种用于检测丙型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括HCV反应液A，所述HCV反应液A包括PCR引物对组，所述引物对组包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物；

所述HCV反应液A还包括探针组，所述探针组包括如SEQ ID NO.3所示的丙型肝炎病毒特异性探针和如SEQ ID NO.6所示的内参探针；

所述试剂盒还包括所述HCV反应液B，所述HCV反应液B包括选自下组的一种或多种组分：

热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs和RNasin；

所述试剂盒还包括内标质控品。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述试剂盒还包括HCV定量参考品。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括HCV强阳性质控品。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HCV临界阳性质控品。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录试剂。

7.引物对组和探针组在用于制备HCV核酸定量检测试剂盒中的用途，其中：

所述引物对组包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物；

所述探针组包括如SEQ ID NO.3所示的丙型肝炎病毒特异性探针和如SEQ ID NO.6所示的内参探针；

所述试剂盒还包括内标质控品。