CN110724768A - 一种用于检测猫传染性腹膜炎病毒的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测猫传染性腹膜炎病毒的组合物，其包括用于检测猫传染性腹膜炎病毒的引物和探针；其中，所述引物包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的序列，所述探针包括如SEQ ID NO.3所示的序列；或者，所述引物包括如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.5所示的序列，所述探针包括如SEQ ID NO.6所示的序列；其中，所述探针标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。本发明还涉及包括上述组合物的试剂盒及其应用。利用本发明的试剂盒、引物对、探针或者检测方法检测猫传染性腹膜炎病毒时，特异性高、重复性好的同时灵敏度更高，所得达到的最低检测限近乎接近现有技术中检测猫传染性腹膜炎病毒的最高水平，操作简单快速、准确，安全无污染。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的组合物、试剂盒及方法。
背景技术
猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)引起的猫科动物的一种慢性、渐进性、致死性传染病，以腹膜炎、大量腹水积聚及致死率较高为主要特征。该病不同年龄的猫均易感，多发于4岁以下年轻成猫，纯种猫发病率高于一般家猫。本病的潜伏期长短不一，各种应激条件以及感染猫的自身疾病和猫免疫缺陷病等都是促使FIP发病的重要因素。该病呈地方流行性，发病率低，但一旦出现临床症状，致死率几乎为100％。为及时发现，实现快速诊断，建立一种方便、快捷、灵敏的荧光定量PCR检测方法，用于感染动物的FIPV检测尤为重要，也为有效控制该病的传播提供了有力的技术支持。
FIP属于高感染率、低发病率的传染病，其临床症状无明显的特征，因此诊断有一定的难度，且国内相关研究报道较少。目前，对FIP既无有效的疫苗预防，也无有效的药物治疗。因此，对于FIPV的管理与控制，准确的诊断是至关重要的。鉴于此，建立快速、准确的检测FIPV的方法是有效诊断和防控猫科动物感染FIPV的基础。
目前，国内外学者针对病毒基因组保守区如Pol、7b基因及非编码区(UTR)设计引物进行RT-PCR检测，作为筛查猫群中该病毒有价值的工具。但该方法的敏感性较低，特异性不强，检测速度慢且国内目前尚未有检测FIPV的单通道荧光定量RT-PCR报道。因此，建立检测FIPV的荧光RT-PCR能够快速、准确的检测FIPV的感染，为FIPV感染的流行病学调查及监测提供切实可行的方法。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的对FIPV的检测采用普通RT-PCR所具有的敏感性低、特异性不强、反应时间长等缺陷，本发明提供一种检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的组合物、试剂盒及其应用，其在闭管状态下进行扩增产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染。因此，本发明所述的检测方法特异性强、敏感性高、快速、安全，对样品中含微量FIPV基因组的检测效果良好，可用于FIPV的实验室检测和分子流行病学调查。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面提供了一种用于检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的组合物，其包括用于检测猫传染性腹膜炎病毒的引物；所述引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，或者，所述引物包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列。
进一步地，所述组合物还包括用于检测猫传染性腹膜炎病毒的探针；所述探针包括如SEQ ID NO.3所示的序列，或者，所述探针包括如SEQ ID NO.6所示的序列，所述探针在5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
进一步地，所述荧光报告基团和荧光淬灭基团均可为本领域常规使用的基团，较佳地，所述荧光报告基团为HEX、FAM(5-羧基荧光素)、VIC或Cy5；所述荧光淬灭基团优选为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。
进一步地，所述检测为实时荧光定量RT-PCR检测。
本发明的第二个方面是提供一种用于检测FIPV的试剂盒，其包括实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitativereverse transcription-polymerasechain reaction，FQ RT-PCR，实时荧光定量反转录聚合酶链式反应)反应体系，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系包括任一上述的组合物；优选地，所述组合物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物和如SEQ ID NO.3所示序列的探针；或者，所述组合物包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列的引物和如SEQ ID NO.6所示序列的探针，所述探针在5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
进一步地，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系中的各引物的浓度分别为200～400nM，优选为200nM；探针的浓度为200～400nM，优选为400nM。
进一步地，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系还包括PCR反应液和酶混合液，所述PCR反应液包括Mg2+、dNTP以及PCR反应缓冲液，所述酶混合液包括逆转录酶、热启动Taq酶以及RNA酶抑制剂。
进一步地，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系中，所述Mg2+的浓度为1～2.5mmol/L，优选为2.0mmol/L；所述dNTP的浓度为0.1～0.25mmol/L，优选为0.2mmol/L；所述PCR缓冲液为2×One Step RT-PCR缓冲液；所述逆转录酶的用量为0.5～2U/反应；所述热启动Taq酶的用量为0.1～0.5U/反应；所述RNA酶抑制剂的用量为1～3U/反应。
进一步地，在本发明一较佳实施例中，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系包括0.5μL 10μM的上游引物和0.5μL 10μM的下游引物、1μL 10μM的探针、RT-PCR反应液和酶混合液组成，所述RT-PCR反应液由10μL 2×One Step RT-PCR缓冲液(无Mg2+)(PCR Buffer(无Mg2 +))、2μL 25mM的MgCl2、1μL10 mM的dNTP和2μL DEPC-H2O组成，所述酶混合液由1μL 40U/μL的RNA酶抑制剂、1μL 25U/μL的逆转录酶和1μL 5U/μL的Taq酶组成。
进一步地，所述试剂盒为实时荧光定量RT-PCR试剂盒。
进一步地，为了更直观、准确地判定检测结果，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有FIPV目的基因序列的重组质粒，所述阴性对照为去离子水；优选地，所述阳性对照的浓度为7.6×106拷贝/μL，所述阴性对照为DEPC-H2O。
进一步地，所述试剂盒还包括RNA提取试剂；其中，所述RNA提取试剂可为本领域常规的提取动物病毒RNA的试剂；优选地，所述RNA提取试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H2O中的一种或多种；所述样品裂解液优选Trizol，所述DEPC-乙醇优选质量百分数为75％的DEPC-乙醇。
进一步地，在本发明一较佳实施例中，一种用于检测FIPV的试剂盒，其包括：
(1)RNA提取试剂，包括：
样品裂解液管：Trizol 750μL；氯仿管：氯仿200μL；75％乙醇管：75％DEPC-乙醇800μL；异丙醇管：异丙醇600μL；DEPC-H2O管：11μL；以上为适合提取1个样本的RNA的试剂用量；所述RNA提取试剂需要4℃保存；
(2)反应体系，包括：
引物探针混合液管：10μM FIPV上、下游引物各0.5μL，10μM探针1μL，合计2μL；PCR反应液管：2×One Step RT-PCR缓冲液(无Mg2+)(PCR Buffer(无Mg2+))10μL，25mM MgCl2 2μL，10mM dNTP 1μL，DEPC-H2O 2μL，合计15μL；酶混合液(Enzyme Mix)管：40U/μL RNA酶抑制剂1μL，25U/μL逆转录酶1μL，5U/μL Taq酶1μL，合计3μL；
以上为单次反应的试剂用量，所述的反应体系需要-20℃保存；
(3)阳性对照管：浓度为7.6×106拷贝/μL的FIPV阳性质粒5μL；
(4)阴性对照管：DEPC-H2O 5μL。
进一步地，在上述较佳实施例中，所述2×One Step RT-PCR缓冲液(无Mg2+)(PCRBuffer(无Mg2+))、25mM MgCl2、10mM dNTP混合物、逆转录酶和Taq酶也可以使用本领域常规的试剂盒产品，如可以使用荧光RT-PCR试剂盒(Real Time RT-PCR Kit)替代上述几种试剂，优选TaKaRa公司产品荧光PCR试剂盒(One Step PrimeScriptTM PCR Kit(Perfect RealTime))。
进一步地，当采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物和如SEQ IDNO.3所示序列的探针时，所述试剂盒对FIPV的最低检测限为7.6×100拷贝/μL；当采用如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列的引物和如SEQ ID NO.6所示序列的探针时，所述试剂盒对FIPV的最低检测限为7.6×101拷贝/μL。
本发明的第三个方面是提供一种任一上述的组合物在制备检测FIPV的产品中的应用；其中，所述产品优选为试剂盒形式。更进一步地，所述试剂盒为实时荧光定量RT-PCR试剂盒。
本发明的第四个方面是提供一种非诊断目的的检测FIPV的方法，其包括：
步骤(1)使用RNA提取试剂提取待检样品中的RNA；
步骤(2)以步骤(1)提取的RNA为模板，采用上述的试剂盒进行RT-PCR反应；
步骤(3)在步骤(2)所述的RT-PCR反应结束后，分析检测结果。
进一步地，步骤(1)中，所述提取待检样品的RNA的方法为本领域的常规方法，优选为采用Trizol法提取样品的RNA；步骤(1)中所述RNA提取试剂优选包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H2O中的一种或多种；所述样品裂解液优选为Trizol，所述DEPC-乙醇优选为质量百分数为75％的DEPC-乙醇。
进一步地，所述待检样品为猫鼻拭样品或猫肛拭样品。
进一步地，步骤(2)中，所述RT-PCR反应的反应过程为：分别取引物探针混合液1～3μL、PCR反应液14～16μL、酶混合液2～4μL配制成17～23μL反应体系，再加入2～8μL步骤(1)所得的RNA；将FIPV阳性质粒作为阳性对照样品，DEPC-H2O作为阴性对照样品，与待检样品RNA同时进行荧光RT-PCR反应；其中，步骤(2)中，所述RT-PCR反应的反应条件优选为：(1)42～50℃逆转录10～15min；(2)94～95℃10～15min；(3)94～95℃10～15s；(4)55～60℃35～60s；(3)-(4)循环40～45次(收集荧光信号)。
进一步地，步骤(3)中，所述分析检测结果的操作过程可为本领域的常规方法，优选所述分析检测结果的操作过程如下：反应结束后，当阳性对照呈典型的S型扩增曲线，且Ct值≤30；阴性对照无扩增曲线且无Ct值时，判定检测反应成立；若检测样品也出现S型扩增曲线或扩增曲线有明显指数增长期，且Ct值≤35，则判定为检测阳性，否则判定为阴性。若Ct值＞35，且出现典型的扩增曲线的样品建议重复试验，重复试验结果相同为阳性，否则为阴性。
进一步地，在本发明一较佳实施例中，一种非诊断目的的检测FIPV的方法，其是一种采用荧光定量RT-PCR检测FIPV的方法，其包括如下步骤：
(1)样品RNA的提取：于750μL Trizol裂解液中加入待测样品200μL，混匀，15～25℃静置5min后，再加入200μL氯仿，振荡混匀，于4℃、12000r/min离心15min；取水相上清，加入600μL于-20℃预冷的异丙醇，混匀后，12000r/min离心10min；弃上清后，加入800μL 75％DEPC-乙醇，12000r/min离心10min后弃上清并于15～25℃干燥后加入11μL DEPC-H2O溶解，备用。
(2)RT-PCR反应与结果分析：分别取引物探针混合液2μL、PCR反应液15μL、酶混合液3μL配制成反应体系；
取阴性对照、标本、阳性对照各5μL，分别加入反应体系中使用市售的荧光定量PCR仪(如ViiA 7)进行PCR扩增。PCR循环条件是：①42℃逆转录10min；②94℃15min；③95℃15s；④60℃45s，③-④循环45次(收集荧光信号)；
反应结束后保存检测数据文件；根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果；如扩增曲线有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
可理解的是，本领域技术人员对上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案，具有如下技术效果：
本发明提供的用于检测FIPV的方法具有特异性好，敏感性高(检测限可低至7.6×100、7.6×101拷贝/μL)，操作简单、快速，省时省力等优点；本发明试剂盒具有成本低、检测速度快、不易污染、结果易于判定等优点，适用于FIPV感染的快速诊断。本发明方法和试剂盒还适合大规模的流行病学调查研究。因此，本发明的检测方法和试剂盒具有很好的应用前景。
附图说明
图1为组合1检测FIPV的荧光RT-PCR的扩增曲线结果示意图；其中，用DEPC-H2O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×107、7.6×106、7.6×105、7.6×104、7.6×103拷贝/μL进行扩增后，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显。
图2为组合1检测FIPV的荧光RT-PCR的标准曲线结果示意图；其中，用DEPC-H2O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×107、7.6×106、7.6×105、7.6×104、7.6×103拷贝/μL进行扩增，3个重复，标准品起始模板浓度与Ct值均呈现良好的线性关系；斜率接近-3.335，相关系数R2为0.997。
图3为组合2检测FIPV的荧光RT-PCR的扩增曲线结果示意图；其中，用DEPC-H2O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×107、7.6×106、7.6×105、7.6×104、7.6×103拷贝/μL进行扩增后，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显。
图4为组合2检测FIPV的荧光RT-PCR的标准曲线结果示意图；其中，用DEPC-H2O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×107、7.6×106、7.6×105、7.6×104、7.6×103拷贝/μL进行扩增，3个重复，标准品起始模板浓度与Ct值均呈现较好的线性关系；斜率接近-3.265，相关系数R2为0.991。
图5为组合1检测FIPV的荧光RT-PCR的特异性试验结果示意图；其中，7份特异性参考品中，FIPV样品的扩增曲线为S型扩增曲线，其他6份特异性参考品的扩增曲线为平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；6份特异性参考品分别为FCV疫苗株、RV疫苗株、FHV疫苗株、FPV疫苗株、CIV、CDV疫苗株等猫的常见病原体。
图6为组合2检测FIPV的荧光RT-PCR的特异性试验结果示意图，7份特异性参考品中，FIPV样品的扩增曲线为S型扩增曲线，其他6份特异性参考品的扩增曲线为平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性；6份特异性参考品分别为FCV疫苗株、RV疫苗株、FHV疫苗株、FPV疫苗株、CIV、CDV疫苗株等猫的常见病原体。
图7为组合1检测FIPV的荧光RT-PCR的敏感性试验结果示意图，7份敏感性参考品中浓度为7.6×100拷贝/μL的样本有S型扩增曲线可明确判定为阳性，最低检测限为7.6×100拷贝/μL。
图8为组合2检测FIPV的荧光RT-PCR的敏感性试验结果，7份敏感性参考品中浓度为7.6×100拷贝/μL的样本没有扩增曲线且Ct值为none，可判断为阴性，其余样本均有S型扩增曲线可明确判定为阳性，最低检测限为7.6×101拷贝/μL。
图9为某宠物医院疑似发病猫检测FIPV的荧光PCR的检测图；其中，P为FIPV阳性对照；N为FIPV阴性对照；S1～S3为3份猫肛拭样品。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中所用引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。
下述实施例中部分试剂和仪器的来源如下：
2×One Step RT-PCR缓冲液(PCR Buffer)(无Mg2+)、25mM MgCl2、10mM dNTP混合物、逆转录酶、5U/μL Taq酶以及荧光RT-PCR试剂盒[One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)]均购自宝生物工程(大连)有限公司；
ViiA 7为赛默菲产品；
狂犬病毒疫苗株(RV)、猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、杯状病毒疫苗株(FCV)、猫细小病毒疫苗株(FPV)、犬瘟热病毒疫苗株(CDV)均为荷兰英特威产品；FIPV(猫传染性腹膜炎病毒)购于ATCC(WSU 79-1146)。
犬流感病毒(CIV)为上海市动物疫病预防控制中心实验室保存。
实施例1
本实施例为一较佳的用于检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的特异性引物和探针的设计。
根据FIPV 7b基因的保守序列设计引物和探针，如下表1所示，按照以下序列，合成特异性荧光RT-PCR引物和探针。以DEPC-H2O稀释引物至10μM，-20℃保存备用。
表1引物和探针组合
其中FIPV-F1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，FIPV-R1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，FIPV-P1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
实施例2
本实施例为一较佳的含有实施例1中组合1的用于检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的反应体系的建立和优化。
1、样品的准备：合成目的扩增区域FIPV 7b，连接到PET30a载体，转化到BL21(B)受体菌，挑选阳性克隆，构建成含有FIPV目的扩增区域的阳性质粒作为FIPV检测的阳性对照；以狂犬病毒疫苗株(RV)、猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、犬流感病毒(CIV)、犬瘟热病毒疫苗株(CDV)作为特异性参考品；以去离子水作为阴性对照，分别用TRIZOL提取上述阳性对照与特异性参考品的RNA，阴性对照待用。
2、引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从100nM/反应至400nM/反应梯度的引物和探针进行PCR反应，经多次重复试验发现引物和探针浓度在200～400nM/反应之间均可，其中最佳的引物浓度为200nM/反应、探针浓度为400nM/反应。
3、镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1mmol/L至2.5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2.0mmol/L。
4、dNTP浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTP浓度为0.2mmol/L。
5、热启动Taq酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1U(酶单位)至0.8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的热启动Taq酶用量为0.1～0.5U/反应。
6、逆转录酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的逆转录酶用量为0.5～2U/反应。
7、RNA酶抑制剂用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.5U(酶单位)至4U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNA酶抑制剂用量为1～3U/反应。
8、反应温度的优化：根据酶的活性和靶核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：42℃逆转录10min；94℃15min，1个循环；95℃15s，60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。
实施例3
本实施例为一较佳的采用实施例1中组合1的标准曲线的建立。
将FIPV阳性质粒DNA用分光光度计测定浓度后，用DEPC-H2O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×107、7.6×106、7.6×105、7.6×104、7.6×103拷贝/μL，设置3个重复，进行扩增，反应结束后，利用Vii荧光定量PCR分析软件自动得到标准曲线。结果显示以引物(FIPV-F1和FIPV-R1)和探针FIPV-P1组合的组合1建立的荧光RT-PCR，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与Ct值呈现具有良好的线性范围，斜率接近-3.335，相关系数R2为0.997(见图1和图2)。根据Ct值和标准曲线即可对样品进行准确定量。
实施例4
本实施例采用采用实施例3中所述优化的体系及扩增条件进行特异性和敏感性试验。
取7份特异性参考品分别为狂犬病毒疫苗株(RV)、猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、杯状病毒疫苗株(FCV)、猫细小病毒疫苗株(FPV)、犬流感病毒(CIV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、犬瘟热病毒疫苗株(CDV)等7个样本，提取核酸，采用荧光PCR进行试剂盒的特异性试验。其中，(1)样品RNA的提取：于750μL Trizol裂解液中加入待测样品200μL，混匀，15～25℃静置5min后，再加入200μL氯仿，振荡混匀，于4℃、12000r/min离心15min；取水相上清，加入600μL于-20℃预冷的异丙醇，混匀后，12000r/min离心10min；弃上清后，加入800μL75％DEPC-乙醇，12000r/min离心10min后弃上清并于15～25℃干燥后加入11μL DEPC-H2O溶解，备用。(2)PCR反应：分别取引物探针混合液2μL、PCR反应液15μL、酶混合液3μL配制成反应体系。荧光PCR的条件如下：42℃逆转录10min；94℃15min，1个循环；95℃15s，60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。
以引物(FIPV-F1和FIPV-R1)和探针FIPV-P1组合的组合1建立的荧光RT-PCR方法，FIPV出现S型扩增曲线。而狂犬病毒疫苗株(RV)、猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、杯状病毒疫苗株(FCV)、猫细小病毒疫苗株(FPV)、犬流感病毒(CIV)、犬瘟热病毒疫苗株(CDV)均没有出现特异性扩增曲线(见图5)，说明所建立的双通道荧光PCR的特异性好。
将含FIPV目的基因的阳性质粒DNA用分光光度计测定浓度后，用DEPC-H2O对质粒标准品做10倍系列稀释，使每5μL检测用量中的拷贝数分别为7.6×106、7.6×105、7.6×104、7.6×103、7.6×102、7.6×101、7.6×100拷贝/μL进行荧光PCR扩增，结果表明以引物(FIPV-F1和FIPV-R1)和探针FIPV-P1组合的组合1建立的检测FIPV的荧光RT-PCR方法的最低检测限约为7.6×100拷贝/μL(见图7)。现有文献并没有报道FIPV所建立的荧光RT-PCR方法的最低检测限。由此可见，本发明的敏感性远远高于普通RT-PCR的敏感性。此外，本发明的反应体系为一步法反应体系和反应程序设置时间比现有技术报道的普通RT-PCR的反应体系更简单、试剂配制更方便，反应时间更短，约节省60min。
实施例5
本实施例为一较佳的含有实施例2中反应体系的试剂盒的组装。
按照RNA提取和荧光RT-PCR两个部分完成试剂盒组分的配制，以下提供的数据及试剂组成为单次荧光PCR检测所需试剂：
(1)RNA提取(4℃保存)
样品裂解液管：Trizol 750μL；
氯仿管：氯仿200μL；
75％乙醇管：75％DEPC-乙醇800μL；
异丙醇管：异丙醇600μL；
DEPC-H2O管：11μL；
(2)荧光RT-PCR(-20℃保存)
引物探针混合液管：10μM FIPV上、下游引物各0.5μL，10μM探针(FIPV-P)1μL，合计2μL；
PCR反应液管：2×One Step RT-PCR缓冲液(无Mg2+)(PCR Buffer(无Mg2+))10μL，25mM MgCl2 2μL，10mM dNTP 1μL，DEPC-H2O 2μL，合计15μL；
酶混合液(Enzyme Mix)管：40U/μL RNA酶抑制剂1μL，25U/μL逆转录酶1μL，5U/μLTaq酶1μL；
阳性对照管：浓度为7.6×106拷贝/μL的含FIPV目的基因的阳性质粒5μL；
阴性对照管：DEPC-H2O 5μL。
按照48份检测剂量为一个包装，将上述配制好的试剂分别装入10个无RNase酶的瓶或管中，并按照相应的储存温度保存运送。
实施例6
本实施例为实施例5所述的试剂盒的应用。
采用实施例5所述的检测FIPV荧光定量RT-PCR检测试剂盒对上海某宠物医院送检的临床疑似FIPV感染的3份猫肛拭子样品进行检测。
(1)RNA的提取
于750μL Trizol裂解液中加入待测样品200μL，混匀，室温静置5min后，再加入200μL氯仿，振荡混匀，于4℃12000r/min离心15min；取水相上清，加入600μL异丙醇(-20℃预冷)，混匀后，12000r/min离心10min；弃上清后，加入800μL 75％DEPC-乙醇，12000r/min离心10min后弃上清并于室温干燥后加入11μL DEPC-H2O溶解，备用。
(2)荧光RT-PCR反应与结果分析
分别取引物探针混合液2μL、PCR反应液15μL、酶混合液3μL配制成反应体系。
取阴性对照(N)、标本(S1、S2、S3)、含FIPV目的基因的阳性对照(P)各5μL，分别加入反应体系中使用市售的荧光定量PCR仪(如Vii7)进行PCR扩增。PCR循环条件是：42℃逆转录10min；94℃15min，1个循环；95℃15s，60℃45s，45个循环(收集荧光信号)。
整个反应共需60min，反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果，结果如图9所示。检测结果表明，设定的对照全部成立；S1、S2、S3 3份样品的Ct值分别为25.18、none、none，只有S1样品的Ct值小于35，且出现典型的S型扩增曲线，表明S1样品中有FIPV核酸阳性。
替换实施例
(1)特异性引物和探针的设计
针对GenBank中FIPV的保守基因序列分别设计不同于上述实施例的特异性引物和探针，如下表2所示，按照以下序列，合成特异性荧光RT-PCR引物和探针。以DEPC-H2O稀释引物至10μM，-20℃保存备用。
表2引物和探针组合
上述FIPV-F2～FIPV-P2的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.4～6所示。
(2)标准曲线的建立
采用组合2使用实施例2建立和优化的体系进行标准曲线的建立，建立方法同实施例3。结果显示：
以组合2建立的双通道荧光RT-PCR方法，出现典型的S型扩增曲线，指数区较明显，标准品起始模板浓度与Ct值呈现具有较好的线性范围，斜率接近-3.265，相关系数R2为0.991(见图3和图4)。
根据Ct值和标准曲线即可对样品进行准确定量。
(3)特异性和敏感性试验
①特异性试验
具体操作步骤同实施例4，结果显示：
组合2的荧光RT-PCR FIPV样品出现S型扩增曲线。而狂犬病毒疫苗株(RV)、猫疱疹病毒疫苗株(FHV)、杯状病毒疫苗株(FCV)、猫细小病毒疫苗株(FPV)、犬流感病毒(CIV)、犬瘟热病毒疫苗株(CDV)样品均没有出现特异性扩增曲线(见图6)，说明所建立的双通道荧光PCR的特异性良好。
②敏感性试验
具体操作步骤同实施例4，结果显示：
组合2的荧光RT-PCR方法，以引物(FIPV-F2和FIPV-R2)和探针FIPV-P2组合的组合2建立的检测FIPV的荧光RT-PCR方法的最低检测限约为7.6×101拷贝/μL(见图8)。由此可见，组合2的荧光RT-PCR方法的检测限高于组合1。
由上述实施例和对比例可知，本发明所述的试剂盒和方法在闭管状态下进行扩增反应及产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强、敏感性更高；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染；可实现FIPV的快速检测。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海市动物疫病预防控制中心（上海市兽药饲料检测所、上海市畜牧技术推广中心）
<120> 一种用于检测猫传染性腹膜炎病毒的组合物、试剂盒及方法
<130> 2019112006-zf-cpp
<141> 2019-11-20
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列-引物FIPV-F1(Artificial Sequence)
<400> 1
gggaaagccc gaaacaca 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列-引物FIPV-R1(Artificial Sequence)
<400> 2
actgcctcca cactccacaa t 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列-探针FIPV-P1(Artificial Sequence)
<400> 3
tacgataaac aactggaccc cgaccga 27
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列-引物FIPV-F2(Artificial Sequence)
<400> 4
agcaactact gcyacrggat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列-引物FIPV-R2(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaagdttca tctccccagt 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列-探针FIPV-P2(Artificial Sequence)
<400> 6
aatggccaca cagggacaac gc 22
Claims (10)
1.一种用于检测猫传染性腹膜炎病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测猫传染性腹膜炎病毒的引物；所述引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，或者，所述引物包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测猫传染性腹膜炎病毒的组合物，其特征在于，所述组合物还包括用于检测猫传染性腹膜炎病毒的探针；所述探针包括如SEQ ID NO.3所示的序列，或者，所述探针包括如SEQ ID NO.6所示的序列，所述探针在5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的用于检测猫传染性腹膜炎病毒的组合物，其特征在于，所述荧光报告基团为HEX、FAM、VIC或Cy5；所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。
4.一种用于检测猫传染性腹膜炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括实时荧光定量RT-PCR反应体系，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系包括如权利要求1～3中任一项所述的用于检测猫传染性腹膜炎病毒的组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系中的各引物的浓度分别为200～400nM；探针的浓度为200～400nM。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系还包括PCR反应液和酶混合液，所述PCR反应液包括Mg2+、dNTP以及PCR反应缓冲液，所述酶混合液包括逆转录酶、热启动Taq酶以及RNA酶抑制剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR反应体系中，所述Mg2+的浓度为1～2.5mmol/L；所述dNTP的浓度为0.1～0.25mmol/L；所述PCR缓冲液为2×One Step RT-PCR缓冲液；所述逆转录酶的用量为0.5～2U/反应；所述热启动Taq酶的用量为0.1～0.5U/反应；所述RNA酶抑制剂的用量为1～3U/反应。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，各引物的用量为0.5μL、浓度为10μM，探针的量为1μL、浓度为10μM；所述PCR反应液由10μL 2×One Step RT-PCR缓冲液、2μL 25mM的MgCl2、1μL10 mM的dNTP以及2μL DEPC-H2O组成，所述酶混合液由1μL 40U/μL的RNA酶抑制剂、1μL 25U/μL的逆转录酶和1μL 5U/μL的Taq酶组成。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有猫传染性腹膜炎病毒目的基因序列的重组质粒，所述阴性对照为去离子水。
10.一种非诊断目的的检测猫传染性腹膜炎病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤(1)使用RNA提取试剂提取待检样品中的RNA；
步骤(2)以步骤(1)提取的RNA为模板，采用如权利要求1～3中任一项所述的组合物或采用如权利要求4～9中任一项所述的试剂盒进行RT-PCR反应；
步骤(3)在步骤(2)所述的RT-PCR反应结束后，分析检测结果。
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