CN117025846A

CN117025846A - 一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组及其应用

Info

Publication number: CN117025846A
Application number: CN202310991799.4A
Authority: CN
Inventors: 张婧; 郑巧; 林华; 安微; 杨苗; 谢礼; 郑晶; 陈瑛琪; 薛昌华; 余姓鸿; 唐亚玲
Original assignee: Chengdu Customs Technology Center
Current assignee: Chengdu Customs Technology Center
Priority date: 2023-08-07
Filing date: 2023-08-07
Publication date: 2023-11-10

Abstract

本发明公开了一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组及其应用，属于病毒检测技术领域。本发明通过筛选保守基因序列并设计特异性引物与探针，引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～12所示，通过优化反应体系和扩增程序，建立可同时鉴别SARS‑CoV‑2的ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因的检测体系。在多重ddPCR反应体系中，本发明所设计的引物探针对目的片段均能有效扩增，特异性强，检测结果复合率高并且灵敏度高，本发明设计的多重ddPCR检测新型冠状病毒引物组可用于临床样本中对微量新冠病毒准确快速检出，为病毒性传染疾病的快速诊断及传播风险监测提供技术支撑。

Description

一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组及其应用

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组及其应用。

背景技术

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2号(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2，简称新冠病毒)引发的新冠感染在全球范围内波及蔓延。SARS-CoV-2是迄今为止被发现的第7种可以引发机体感染的β属冠状病毒，有包膜，直径约60～140nm，基因组核酸类型为单股正链RNA，大小约为30kb。其中，非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(open reading frame，ORF)ORF1a和ORF1b基因，编码16个非结构蛋白，结构蛋白主要通过核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)、包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)和刺突蛋白(spike protein，S)维持病毒的转录和复制，促进病毒的遗传物质侵入宿主细胞干扰正常生命等活动。SARS-CoV-2可以跨越物种屏障感染人类和动物(果子狸、单峰骆驼、穿山甲、蝙蝠等)。研究表明，SARS-CoV-2在全基因组水平上与蝙蝠冠状病毒有96％的相同性，被认为是携带新冠病毒的天然宿主。SARS-CoV-2具有灵活的基因重组和快速适应突变能力，已不断进化演变出新的冠状变异株(包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron)，因此在SARS-CoV-2的核酸检测中，对病原毒株类型的鉴定具有更高要求。

从去年到今年本土病例SARS-CoV-2基因组有效序列均为Omicron变异株，该变异株携带大量突变，仅在S蛋白末端的受体结合域(receptor binding domain，RBD)上就存在15个突变位点，RBD与人体细胞表面的血管紧张素转换酶2(angiotensin convertingenzyme 2，ACE2)受体结合增加ACE2-RBD亲和力，病毒能够逃避免疫保护屏障，使Omicron变异株更具传播性和感染能力，Omicron变异株感染人数多但较早期致病力明显下降，感染症状已逐渐演化为一种常见的呼吸道传染病。目前，市面上SARS-CoV-2核酸检测试剂引物和探针靶标大多针对于ORF1ab基因、N基因和E基因设计，不能满足Omicron变异株检测需求。根据SARS-CoV-2各变异株之间S基因的序列差异，开发可以快速高效鉴定出Omicron突变株的检测方法，在全球范围内对这一新变异株的监测至关重要。

微滴式数字PCR技术在荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR，qPCR)的基础上将核酸的定量检测由相对定量提高到绝对定量，是分子生物学检测领域最为重大创新之一。在ddPCR中，通过微滴化处理将目的模板和反应混合物稀释分散成2万多个油包水的细小微滴，每个微滴只含有1个或0个待检核酸分子，微反应体系扩增后，对每个微滴的荧光信号进行采集并分析，使用泊松分布定律进行计算，无需绘制标准曲线就可推算出目标分子的原始拷贝数，实现复杂背景下对微量核酸样本的绝对定量检测。截止目前，有研究者建立的三重ddPCR方法用于检测生物与环境样本中SARS-CoV-2，与RT-qPCR相比其在检测低病毒载量的样本有更高的灵敏度和准确性(P<0.05)，有效降低了假阴性检出率；还有研究者开发出一种RT-ddPCR检测方法，用于同时检测SARS-CoV-2和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)，测试结果显示灵敏度分别比RT-PCR高4倍和10倍，该测试还表现出良好的特异性、可重复性和再现性等优点。

综上所述，设计专门针对于Omicron变异株S基因的引物探针，采用定量分析检测方法—ddPCR技术，建立SARS-CoV-2Omicron变异株四重微滴式数字PCR检测方法，实现对SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因和E基因检测的同时，还能对Omicron变异株S基因进行鉴别的双重功能，在病毒将检测技术领域具有至关重要的意义。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组及其应用，采用本发明所设计的引物组以及本发明所建立的检测方法同时对SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因检测和Omicron变异株进行检测，特异性强，检测结果复合率高并且灵敏度高，本发明建立多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组可用于临床样本中对微量新冠病毒准确快速检出。

本发明采用以下技术方案：

一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组，引物组包括引物和探针，引物和探针的核苷酸序列如下：

ORF1ab-F：5’-TGTGCTAATGACCCTGT-3’(SEQ ID NO：1)；

ORF1ab-R：5’-GTTTAAAAACGATTGTGCATCAG-3’(SEQ ID NO：2)；

ORF1ab-P：5’-AACTCCGCGAACCCATGCTT-3’(SEQ ID NO：3)；

N-F：5’-GTCAAGCCTCTTCTCGTT-3’(SEQ ID NO：4)；

N-R：5’-ATTGCCAGCCATTCTAGCAG-3’(SEQ ID NO：5)；

N-P：5’-CCTCATCACGTAGTCGCAACAGT-3’(SEQ ID NO：6)；

E-F：5’-TTTCTTGCTTTCGTGGT-3’(SEQ ID NO：7)；

E-R：5’-TTTAACACGAGAGTAAACGTA-3’(SEQ ID NO：8)；

E-P：5’-CTTCGATTGTGTGCGTACTGCT-3’(SEQ ID NO：9)；

S-F：5’-GTTGCTGATTATTCTGTCCTA-3’(SEQ ID NO：10)；

S-R：5’-AGACATTAGTAAAGCAGAGAT-3’(SEQ ID NO：11)；

S-P：5’-ACACTTAAAAGCGAAAAATGGT-3’(SEQ ID NO：12)。

进一步地，上述ORF1ab-P的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1；所述N-P的5’端标记有HEX，3’端标记有BHQ1；所述E-P的5’端标记有ROX，3’端标记有BHQ2；所述S-P的5’端标记有CY5，3’端标记有MGB；所述标记后的探针分别为：

ORF1ab-P：5’-FAM-AACTCCGCGAACCCATGCTT-BHQ1-3’；

N-P：5’-HEX-CCTCATCACGTAGTCGCAACAGT-BHQ1-3’；

E-P：5’-ROX-CTTCGATTGTGTGCGTACTGCT-BHQ2-3’；

S-P：5’-CY5-ACACTTAAAAGCGAAAAATGGT-MGB-3’。

上述引物组在制备用于检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。

一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，包括上述的引物组。

进一步地，上述用于检测新型冠状病毒的试剂盒还包括5x One Step RT-PCRProbe Super Mix(cy5.5)，Enzyme Mix，EcoRI酶和dd H₂O。

采用上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明根据新冠病毒原型株及变异株基因组参考序列，设计出特异性引物探针，通过优化多重ddPCR反应体系和扩增条件，最终建立了SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因四重微滴数式数字PCR定量检测方法，该方法绝对定量检测下限分别为分别为ORF1ab基因0.59copies/μL；N基因0.68copies/μL；E基因1.44copies/μL；S基因1.03copies/μL，将本发明所设计的引物探针组合结合多重ddPCR方法用于临床能够对微量新冠病毒准确快速检出，有利于维护公共卫生安全。

本发明将Omicron变异株与alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株进行序列比对分析，发现Omicron变异株S基因的N末端结构域(N-terminal domain，NTD)上存在连续的突变位点，基于该段突变位点，固定TaqMan探针，从而筛选Omicron变异株S基因的特异性引物，而Omicron变异株新的进化分支XBB毒株发生了新的突变，与TaqMan探针的结合有一定影响，但BA.1、BA.4和BA.5毒株含有与本实验TaqMan探针相同的特征序列，本研究设计的多重ddPCR反应体系还可以对BA.1、BA.4和BA.5毒株进行检测。

附图说明

图1为SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因和Omicron变异株S基因单重ddPCR检测一维图，其中，A代表ORF1ab基因，B代表N基因，C代表E基因，D代表S基因。

图2为SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因和Omicron变异株S基因在不同退火温度下多重ddPCR检测一维图，其中，A代表ORF1ab基因，B代表N基因，C代表E基因，D代表S基因。

图3为SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因和S基因四重ddPCR引物探针浓度优化检测一维图，其中，A1代表ORF1ab基因不同浓度引物配比优化，A2代表ORF1ab基因不同浓度探针配比优化，B1代表N基因不同浓度引物配比优化，B2代表N基因不同浓度探针配比优化，C1代表E基因不同浓度引物配比优化，C2代表E基因不同浓度探针配比优化，D1代表S基因不同浓度引物配比优化，D2代表S基因不同浓度探针配比优化。

图4为四重ddPCR特异性检测一维图其中，A代表ORF1ab基因，B代表N基因，C代表E基因，D代表S基因。

图5为四重ddPCR灵敏度检测一维图其中，A代表ORF1ab基因，B代表N基因，C代表E基因，D代表S基因。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1引物设计

在NCBI和GISAID数据库(https：//www.gisaid.org/)中下载新型冠状病毒原型株及变异株基因组参考序列，通过DNAMAN软件进行基因序列比对，筛选高度保守的目的片段，利用primer 6.0和oligo 7软件对选取的病毒片段进行引物探针设计，设计好的引物探针放入NCBI里的Primer-BLAST进行比对，选择最佳引物探针并交予生工生物工程(上海)有限公司合成，所设计的引物及探针如表1所示。

表1引物与探针核苷酸序列

表1中新型冠状病毒原型株在GenBank中的登陆号为为NC_045512.2，Omicron变异株登录号为OL672836.1。

在ORF1ab-P的5’端标记FAM，3’端标记BHQ1；在N-P的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1；在E-P的5’端标记ROX，3’端标记BHQ2；在S-P的5’端标记CY5，3’端标记MGB；标记后的探针分别为：

ORF1ab-P：5’-FAM-AACTCCGCGAACCCATGCTT-BHQ1-3’；

N-P：5’-HEX-CCTCATCACGTAGTCGCAACAGT-BHQ1-3’；

E-P：5’-ROX-CTTCGATTGTGTGCGTACTGCT-BHQ2-3’；

S-P：5’-CY5-ACACTTAAAAGCGAAAAATGGT-MGB-3’。

实施例2多重ddPCR的建立与优化

1、病毒RNA提取

非灭活型临床鼻咽拭子样品先置于56℃水浴锅内灭活30min，含胍盐类灭活型样品无需水浴可直接进行核酸提取，在生物安全柜内将样品管涡旋震荡20s，静置30s后，吸取200μL样品于裂解板中进行病毒裂解分离，提取详细步骤按照核酸提取纯化试剂盒说明书进行，最终，将100μL TE缓冲液洗脱的核酸产物置于-20℃保存。

2、阳性质粒制备与稀释

委托生工生物工程(上海)有限公司合成表1中的4对引物的目的片段序列，将目的基因扩增后并回收纯化，插入PUC57载体，使其与目的片段连接构建重组质粒标准品，随后PCR扩增并验证测序结果；将制备成功的阳性质粒标准品用超微量核酸蛋白仪测定质粒浓度，根据公式质粒拷贝数＝(M×6.02×10²³×10^-9)/(n×660)(注：M为质粒DNA浓度，n为重组质粒长度＝T载体长度+目的片段长度)，计算得到阳性质粒拷贝数，并将阳性质粒10倍稀释为10¹～10¹¹，将稀释后的阳性质粒标准品置于-80℃冰箱冻存。

3、单重ddPCR的扩增

为验证SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因的引物探针是否能对目的基因进行有效扩增，分别以ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因的阳性质粒标准品为检测模板进行单重ddPCR扩增，以RNase Free dH₂O为阴性对照，反应体系为：5x One Step RT-PCR Probe Super Mix(cy5.5)，3.5μL；Enzyme Mix，1μL；EcoRI酶，1μL；10μmol/L的上下游引物各1μL，10μmol/L的探针0.5μL；病毒RNA模板3μL，采用dd H₂O补足22μL；反应程序为：25℃5min；50℃25min；95℃酶激活5min；95℃15s，58℃30s，共计40个循环；单重ddPCR扩增结果如图1所示。

由图1可知，SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因的单重ddPCR扩增效果良好，阴阳性微滴区分明显且空白对照未出现阳性扩增，58℃退火温度下，4对引物均能与模板有效结合，适合构建多重ddPCR检测体系。

4、多重ddPCR的建立与优化

(1)多重ddPCR方法退火温度优化

配置SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因和S基因多重ddPCR反应体系，反应体系为：5x One Step RT-PCR Probe Super Mix(cy5.5)，3.5μL；Enzyme Mix，1μL；EcoRI酶，1μL；引物探针浓度均为20μmol/L的ORF1ab基因、N基因、E基因和S基因上下游引物各1μL；探针0.5μL；病毒RNA模板3μL；采用dd H₂O补足22μL。以qPCR退火温度优化结果及试剂盒推荐反应程序为参考，多重ddPCR反应退火温度分别设置为58℃和60℃，每组实验设置两个平行和一个空白对照，ddPCR结果如图2所示。

由图2可知，与单重ddPCR退火温度一致，当退火温度确定为58℃时，阴阳性微滴区分明显且空白对照未出现阳性扩增，并且58℃条件下阳性微滴拷贝数略高一些，因此仍然选择58℃为多重ddPCR的退火温度，根据优化出的退火温度确定出多重ddPCR的反应程序为：25℃5min；50℃25min；95℃酶激活5min；95℃15s，58℃30s，共计40个循环。

(2)多重ddPCR方法引物探针配比的优化

以同一浓度的SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因、E基因和S基因的质粒标准品作为扩增模板进行多重ddPCR反应，其中ddPCR的4对上下游引物浓度均为20μM，分别取每对上下游引物共0.1μL、0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL和1.2μL，上游引物与下游引物的体积比为1：1，探针浓度为20μmol/L，分别取0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL和0.7μL，退火温度为58℃，其它条件按照试剂盒推荐方法进行设置，每组实验重复2次，结果如图3所示。

由图3可知，设置ddPCR的SARS-CoV-2ORF1ab基因上下游引物共0.8μL，探针0.6μL；N基因上下游引物共1.0μL，探针0.6μL；E基因上下游引物共0.6μL，探针0.8μL；S基因上下游引物共1.2μL，探针0.5μL，各对引物探针互相干扰程度低，扩增后的一维散点图阴阳性能明显区分且中间弥散微滴数较少，扩增效率最好，最终确定多重ddPCR反应体系用于后续的实际样本检测。

最终确定的多重ddPCR反应体系为：5x One Step RT-PCR Probe Super Mix(cy5.5)，3.5μL；Enzyme Mix，1μL；EcoRI酶，1μL；20μmol/L的ORF1ab基因上下游引物各0.4μL，探针0.6μL；N基因上下游引物各0.5μL，探针0.6μL；E基因上下游引物各0.5μL，探针0.7μL；S基因上下游引物各0.6μL，探针0.5μL；用dd H₂O补足22μL。

反应程序为：25℃5min；50℃25min；95℃酶激活5min；95℃15s，58℃30s，共计40个循环。

5、多重ddPCR特异性

为确定SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因和E基因以及Omicron变异株S基因引物探针组合特异性是否良好，将猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、甲型流感病毒、诺如病毒、腺病毒、轮状病毒和新型冠状病毒变异株(Beta株、Gamma株、Delta株)作为扩增模板，以同一浓度的新冠阳性质粒标准品作为阳性对照，以RNase Free dH₂O为阴性对照，采用步骤4中的反应体系和扩增程序，对建立的四重ddPCR方法进行特异性实验验证，结果如图4所示。

由图4可知，通过多重ddPCR反应扩增，4种目标基因的质粒标准品均有效检出阳性微滴数，并且猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、甲型流感病毒、诺如病毒、腺病毒、轮状病毒和新型冠状病毒变异株(Beta株、Gamma株、Delta株)作为特异性实验验证均未发生非特异性扩增，表明4组引物探针组合特异性良好，未与其它感染症状与新冠病毒类似的病原体发生交叉反应。

6、多重ddPCR灵敏度及稳定性

将制备的4种阳性质粒标准品混合后，进行连续10倍梯度稀释，选取6个梯度样本，分别为10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10和10^-11进行多重ddPCR扩增，直至检测到阳性微滴数的最低拷贝数即为该方法的检测下限，并对每个浓度重复3次实验以确定该方法的稳定，四重ddPCR灵敏度与重复性检测结果如表3和图5所示。

表3四重ddPCR灵敏度与稳定性检测结果

由表3和图5可知，四重微滴式数字PCR检测SARS-CoV-2的绝对定量检测下限分别为ORF1ab基因0.59copies/μL，RSD为20.89％；N基因0.68copies/μL，RSD为25.07％；E基因1.44copies/μL，RSD为12.08％；S基因1.03copies/μL，RSD为20.20％，采用本发明设计的引物探针组合结合本发明建立的ddPCR检测新型冠状病毒具有灵敏度高的特点。

实验例1临床鼻咽拭子样本的检测

采用口岸疫病疫情监测四川省重点实验室提供的鼻咽拭子样本20份，按照核酸提取纯化试剂盒(磁珠法)提取RNA，随后用本研究建立的多重ddPCR方法和新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)对临床鼻咽拭子样本的分别进行检测，得到数字PCR定量拷贝数结果和荧光定量PCR结果，比较分析阳性检出率，采用多重ddPCR方法的检测结果如表4所示，采用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)的检测结果如表5所示，试剂盒结果判定标准只需满足在同一份标本中SARS-CoV-2的ORF1ab基因为阳性，N基因及E基因任一靶标为阳性即为该样本SARS-CoV-2阳性。

表4 20份样本多重微滴数字PCR拷贝数检测结果

表5 20份样本荧光定量PCR检测结果

由表4和表5可知，在20份临床样本中，ddPCR方法检出阳性样本16个，阳性率达80％(16/20)，经荧光定量PCR方法进行复检验证结果一致，表明该多重ddPCR方法能够在临床中应用。

Claims

1.一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括引物和探针，引物和探针的核苷酸序列如下：

ORF1ab-F：5’-TGTGCTAATGACCCTGT-3’；

ORF1ab-R：5’-GTTTAAAAACGATTGTGCATCAG-3’；

ORF1ab-P：5’-AACTCCGCGAACCCATGCTT-3’；

N-F：5’-GTCAAGCCTCTTCTCGTT-3’；

N-R：5’-ATTGCCAGCCATTCTAGCAG-3’；

N-P：5’-CCTCATCACGTAGTCGCAACAGT-3’；

E-F：5’-TTTCTTGCTTTCGTGGT-3’；

E-R：5’-TTTAACACGAGAGTAAACGTA-3’；

E-P：5’-CTTCGATTGTGTGCGTACTGCT-3’；

S-F：5’-GTTGCTGATTATTCTGTCCTA-3’；

S-R：5’-AGACATTAGTAAAGCAGAGAT-3’；

S-P：5’-ACACTTAAAAGCGAAAAATGGT-3’。

2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述ORF1ab-P的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1；所述N-P的5’端标记有HEX，3’端标记有BHQ1；所述E-P的5’端标记有ROX，3’端标记有BHQ2；所述S-P的5’端标记有CY5，3’端标记有MGB；所述标记后的探针分别为：

ORF1ab-P：5’-FAM-AACTCCGCGAACCCATGCTT-BHQ1-3’；

N-P：5’-HEX-CCTCATCACGTAGTCGCAACAGT-BHQ1-3’；

E-P：5’-ROX-CTTCGATTGTGTGCGTACTGCT-BHQ2-3’；

S-P：5’-CY5-ACACTTAAAAGCGAAAAATGGT-MGB-3’。

3.权利要求1或2所述的引物组在制备用于检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。

4.一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于还包括5x OneStep RT-PCR Probe Super Mix(cy5.5)，Enzyme Mix，EcoRI酶和dd H₂O。