CN116555495A - 用于鉴别检测非洲猪瘟i177l基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体公开了用于鉴别检测非洲猪瘟I177L基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法。本发明用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR的引物探针组合，其含有两对特异性引物和两条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑2和SEQ ID NO.13‑14所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15所示。该引物和探针组合可实现对I177L基因缺失的新型非洲猪瘟减毒活疫苗的特异性检测。本发明同时提供用于鉴别非洲猪瘟病毒和I177L基因缺失株双重荧光PCR检测试剂盒，其操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可实现定性和定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地说，涉及用于鉴别检测非洲猪瘟I177L基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是引起猪的一种急性、高度接触性传染病病原。该病传播迅速，病死率达100％，给养猪业造成巨大经济损失。因尚无预防ASF的疫苗和治疗措施，所以及时诊断成为预防疫病的关键。
随着非洲猪瘟疫病流行态势的变化，当前非洲猪瘟病毒流行毒株仍以基因Ⅱ型病毒为主，但与原非洲猪瘟毒株相比，出现了非洲猪瘟病毒变异株，包括基因缺失株、自然变异株、自然弱毒株等，在已经报道的自然弱毒株和构建的基因缺失株当中，研究较多的有CD2v、MGF、I177L等基因缺失株。例如，哈尔滨兽医研究所在研的ASFV 7基因缺失减毒活疫苗(ASFV-7GD)有I177L基因的缺失；中国农业科学院兰州兽医研究所发明专利“缺失十个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用”中，敲除了I177L基因的334～422位片段；宋庆庆等人构建的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒毒株，I177L基因缺失了第337-447位片段；美国D·P·格拉德等人(基于基因I177L缺失的新型非洲猪瘟减毒活疫苗的开发:CN202080073072.2[P].2022-05-27)提供了关于构建用于预防由重组ASFV的各种病毒株引起ASF的重组非洲猪瘟病毒(ASFV)减毒活疫苗的细节，示例性疫苗包含ASFV-GΔI177l修饰的病毒，其中I177L基因第334～450位缺失。为此，建立针对非洲猪瘟I177L基因缺失毒株特异性的鉴别检测方法，为非洲猪瘟疫苗研发和疫病防控提供技术支撑，具有十分必要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可实现定性和定量检测鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的引物探针组合、试剂盒与方法。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR的引物探针组合，其含有两对特异性引物和两条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.13-14所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.15所示。
具体地，该引物探针组合包括：用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的上游引物(p72-F1)和下游引物(p72-R1)，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列如SED ID NO.1～2所示；用于对非洲猪瘟病毒p72基因检测的TaqMan探针(p72-P1)，所述TaqMan探针的核苷酸序列如SED ID NO.3所示；
用于特异性检测非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株缺失的334～450位核苷酸的上游引物(I177L-F2)和下游引物(I177L-R2)，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列如SED IDNO.13～14所示；用于对非洲猪瘟病毒I177L基因缺失区域检测的TaqMan探针(I177L-P2)，所述TaqMan探针的核苷酸序列如SED ID NO.15所示。
本发明的I177L-F2和I177L-R2所针对的检测靶标为I177L基因特定缺失的片段，该特定片段短小，本发明经不断摸索变化引物探针所针对的位置(以检测目标为中心，向前或向后移动几个或十几个碱基位置进行摸索设计)，经多次筛选后才获得了具理想检测效果的引物探针组合。
本发明的引物探针组合中，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团并在3’端经磷酸化处理，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；
所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL中的任一种。
优选，所述特异性探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。进一步优选，序列如SEQ ID NO.3所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.15所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。
第二方面，本发明提供上述引物探针组合在制备用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR检测试剂或试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其包含上述的引物探针组合。
本发明的双重荧光定量PCR检测试剂盒中，所述双重荧光定量PCR检测试剂盒在进行检测时，每25μL荧光定量PCR检测体系中包括：0.5μL浓度为10μM的p72-F1，0.5μL浓度为10μM的p72-R1，0.5μL浓度为10μM的p72-P1，0.75μL浓度为10μM的I177L-F2，0.75μL浓度为10μM的I177L-R2，0.75μL浓度为10μM的I177L-P2；p72-F1、p72-R1和p72-P1的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，I177L-F2、I177L-R2、I177L-P2的序列分别如SEQ ID NO.13-15所示。
本发明的双重荧光定量PCR检测试剂盒中，每25μL荧光定量PCR检测体系中还包括：12.5μL的预混液HieffUniversal TaqMan multiplex qPCR master mix；
和/或，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的重组质粒，所述阴性对照为不含非洲猪瘟病毒及基因组的组分，如DEPC处理水(双蒸水、去离子水等)；
和/或，还包括标准品，所述标准品为含相同拷贝数的p72和I177L基因重组质粒混合液，浓度选自1×1010、1×109、1×108、1×107或1×106copies/μL。
第四方面，本发明提供一种非疾病诊断目的利用双重荧光定量PCR技术鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的方法，其以待测样品的DNA为检测模板，利用如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.13-14所示的特异性引物和如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15所示的特异性探针进行双重荧光定量PCR检测，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有相应病毒，和/或根据标准曲线得出待测样品中相应病毒的含量。
本发明的方法包括以下步骤：
1)建立标准曲线：将计算拷贝数的重组质粒pMD19-T-p72和pMD19-T-I177L等浓度混合，按照10倍梯度稀释获得1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL的标准品；以不同浓度的标准品作为模板，在权利要求1或2所述的引物探针组合的引导下进行双重荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；
2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在权利要求1或2所述的引物探针组合的引导下进行双重荧光定量PCR检测；
3)用得到的Ct值和出现的典型扩增曲线实现对非洲猪瘟病毒的p72、I177L基因的定性检测，再根据步骤1)中的检测生成的标准曲线，得出待测样品中所含非洲猪瘟病毒的p72和I177L基因的拷贝数，实现定量检测。
步骤1)和步骤2)中的双重荧光定量PCR检测的每25μL体系包括：荧光PCR预混液HieffUniversal TaqMan multiplex qPCR master mix 12.5μL，10μM的p72-F10.5μL，10μM的p72-R1 0.5μL，10μM的p72-P1 0.5μL，10μM的I177L-F2 0.75μL，10μM的I177L-R2 0.75μL，10μM的I177L-P2 0.75μL，模板5μL，DEPC处理水补齐；p72-F1、p72-R1和p72-P1的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，I177L-F2、I177L-R2、I177L-P2的序列分别如SEQID NO.13-15所示；
和/或，步骤1)和步骤2)中的双重荧光定量PCR检测的条件为：95℃预变性5分钟；PCR扩增95℃变性15秒，60℃延伸30秒，45个循环；
和/或，步骤3)中的定性检测的判定方法为：
阳性对照双通道(p72基因通道和I177L基因通道)均有典型扩增曲线，且Ct值≤35，阴性对照双通道均无典型扩增曲线或Ct值，则判定试验成立；否则试验不成立；
若待检样品的双通道均有典型扩增曲线且10＜Ct值≤38，则判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；
若待检样品的p72基因通道有典型扩增曲线且10＜Ct值≤38，且I177L基因通道无典型扩增曲线或Ct值，则判为非洲猪瘟I177L基因缺失株核酸阳性；
若待检样品的双通道均无典型扩增曲线或Ct值，则判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；
若待检样品的任意通道有典型扩增曲线且38＜Ct值≤40，此时目标基因可疑，需进行复检，复检后为阳性或可疑，则判为目标基因阳性，反之为阴性；当p72基因和I177L基因均为阳性时，则判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；仅p72基因阳性时，则判为非洲猪瘟I177L基因缺失株核酸阳性；当p72和I177L基因均为阴性时，则判为非洲猪瘟病毒核酸阴性。
所述待测样品为用于疫苗生产的原料、疫苗半成品或成品。
本发明可特异性检测I177L基因缺失的新型非洲猪瘟减毒活疫苗。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供的用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针，可为疫苗生产过程中原料毒株的筛选、质量监控和合理化配苗提供有力依据，同时为临床病原流行情况的调查、ASF疫情常态化监测提供技术支撑。
本发明的试剂盒和检测方法操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好，可以同时实现对非洲猪瘟病毒p72和I177L基因定性检测和准确定量，将实现在临床病料或培养物中非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的定量检测，以及将在临床鉴别非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株的诊断检测、基于I177L缺失基因的新型非洲猪瘟减毒活疫苗的研发和生产过程中的质量监控和复产保供等方面提供技术支撑，发挥重要作用，其应用前景广阔。
附图说明
图1为实施例1中非洲猪瘟病毒p72基因的第1组、第2组引物探针扩增结果。
图2为实施例1中非洲猪瘟病毒p72基因的第3组引物探针扩增结果。
图3为实施例1中非洲猪瘟病毒I177L基因的第1组引物探针扩增结果。
图4为实施例1中非洲猪瘟病毒I177L基因的第2组、第3组引物探针扩增结果。
图5为实施例1中非洲猪瘟病毒p72和I177L基因双重荧光定量PCR检测标准品扩增曲线图，其中曲线1～6依次表示p72基因的1×106～1×101copies/μL标准品的检测结果，曲线7～12依次表示I177L基因的1×106～1×101copies/μL标准品的检测结果。
图6为实施例1中非洲猪瘟病毒p72和I177L基因双重荧光定量PCR检测1×106～1×101copies/μL标准品的标准曲线图。
图7为实施例2中PCR特异性检测扩增曲线图，其中曲线1和2分别表示非洲猪瘟ASFV GZ2018株FAM和HEX通道荧光曲线，曲线3和4分别表示非洲猪瘟GZ2018△I177L株FAM和HEX通道荧光曲线。
图8为实施例2中PCR最低检测线检测扩增曲线图。
图9为实施例2中PCR重复性检测扩增曲线图，其中1～3组曲线依次表示p72基因的1×106、1×104copies/μL、1×101copies/μL标准品的检测结果，4～6组曲线依次表示I177L基因的1×106、1×104copies/μL、1×101copies/μL标准品的检测结果。
具体实施方式
实时荧光定量PCR技术是一种对病毒基因组进行检测的相对定量技术，与普通PCR技术相比，增加了一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确的优点，可以利用多种荧光基团实现多种基因的检测，并可利用中间的寡核苷酸探针实现相似性较高基因的鉴别，是目前病原体的检测和定量、疫病诊断和流行病学调查等使用较为广泛的方法。本发明基于这一技术，对每个基因均设计了3对特异性引物和3条寡核苷酸探针，建立了一种非洲猪瘟病毒p72和I177L基因双重荧光定量PCR检测方法，并基于设计得到的特异性引物和探针提供一种能鉴别非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株的试剂盒。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示修改或替换使用，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
实施例1非洲猪瘟病毒p72和I177L基因双重荧光定量PCR检测方法
1.1、毒株
实施例中使用的灭活非洲猪瘟病毒毒株ASFV GZ2018公开于中国专利CN113122511 A中的实施例1。
实施例中使用的灭活非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株GZ2018△I177L公开于中国专利CN113122511A的实施例3(在其中命名为rASFV GZ2018ΔMGF360/ΔCD2V/ΔI177L-D)。
1.2、提取基因组DNA
使用AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/DNA Miniprep Kit(AXYGEN公司)对ASFVGZ2018株和GZ2018△I177L株灭活样品提取核酸(送检的样品包含经处理后的组织样品、全血或血清样品、拭子样品等)，提取的核酸于-20℃保存备用。
1.3、引物和探针的设计筛选
从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)分别检索多株不同基因型非洲猪瘟病毒参考毒株(表1)，获得p72和I177L全基因核苷酸参考序列，用DNAStar软件进行比对后，根据引物、TaqMan探针设计原则，在p72全基因保守区域，以及I177L基因缺失334～450位区域各设计了3组引物和探针(表2)。
将方法1.2提取的非洲猪瘟ASFV GZ2018株核酸，做5个连续10倍梯度稀释，分别使用p72和I177L基因的3组引物探针对5个稀释度的核酸进行荧光PCR扩增，p72或I177L基因荧光PCR反应体系包括：荧光PCR预混液HieffUniversal TaqMan multiplex qPCRmaster mix 12.5μl，上游引物(10μM)1μL，上游引物(10μM)1μL，荧光探针(10μM)0.5μL，模板5μl，使用DEPC处理水补齐至25μl。荧光PCR的反应条件为：预变性95℃5min；PCR扩增95℃30s，60℃30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。图1、图2为p72基因3组荧光PCR引物探针筛选结果，图3、图4为I177L基因3组荧光PCR引物探针筛选结果，经对比不同引物探针组检测同一模板的Ct值、曲线形态、荧光强度等，确定p72基因第1组(SEQ IDNO.1～3)和I177L基因第2组(SEQ ID NO.13～15)为优选的引物探针组。
表1非洲猪瘟病毒参考毒株信息表
表2非洲猪瘟病毒p72和I177L基因荧光PCR引物探针信息表
为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。
1.4、标准曲线的构建
1.4.1、普通PCR扩增
使用表3中的2对引物，分别对步骤1.2提取的非洲猪瘟ASFV GZ2018株基因组DNA进行PCR扩增，分别得到含非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的目的片段，25μL的PCR反应体系为：PCR反应液Premix Taq TM12.5μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，模板1μL，用DEPC处理水补齐。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，共32个循环；延伸72℃7分钟。
表3非洲猪瘟病毒p72和I177L基因普通PCR引物信息表
1.4.2、标准品制备
将纯化回收的非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的目的片段均连接pMD19-T载体构建重组质粒，转入JM109感受态细胞(购自TakaRa公司)后进行克隆，并筛选阳性重组质粒送生工生物工程(北京)股份有限公司测序。测序获得了序列正确的分别携带非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的2种阳性质粒，分别命名为pMD19-T-p72和pMD19-T-I177L。使用Nanodrop测定浓度，按公式“copies/μl＝(6.02×1023copies/mol×浓度ng/μl)/(DNA碱基数×660×109ng/mol)”计算质粒的拷贝数，使用TE缓冲液均稀释至1×1010copies/μl，并将稀释的2种阳性质粒与TE缓冲液按1:1:8的比例混合均匀后，标记为1×109copies/μl质粒混合液，再连续10倍梯度稀释至1×101copies/μl，制备试剂盒标准品和阳性对照，-15℃以下保存。
1.4.3、标准曲线的建立
将1.4.2制备的阳性质粒混合液，取1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL的稀释液作为标准样品(模板)，在实施例1中优选的p72和I177L基因引物探针的引导下进行双重荧光定量PCR检测。其中双重荧光定量PCR反应体系如下表4所示。
表4非洲猪瘟病毒p72和I177L基因双重荧光定量PCR反应体系表
双重荧光定量PCR的反应条件为：预变性95℃5min；PCR扩增95℃15s，60℃30s，45个循环。标准样品双重荧光定量PCR扩增曲线如图5所示，图中从左向右对应的是1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL的标准品，各浓度标准品p72和I177L基因的扩增曲线均为平滑的“S”形，曲线形态良好。图6是以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线，其中p72基因标准曲线相关系数R2是0.996，扩增效率E为103.944％，线性方程为y＝-3.231X+39.37；I177L基因的标准曲线相关系数R2是0.999，扩增效率E为101.776％，线性方程为y＝-3.28X+39.57；符合要求，因此标准曲线可用于对非洲猪瘟病毒p72和I177L基因进行荧光PCR定量检测。
1.5、双重荧光定量PCR检测
将提取的待检样品基因组DNA作为模板，以制备的适量浓度的标准样品作为阳性对照，以DEPC处理水作为阴性对照，根据实时荧光定量PCR检测结果，对待测样品进行判定，并对阳性样品的非洲猪瘟病毒p72和I177L基因拷贝数进行定量。
具体检测方法包括以下步骤：
1)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，在上述确定优选p72和I177L基因引物探针(SEQ ID NO.1～3和SEQ ID NO.13～15)的引导下进行双重荧光定量PCR检测，反应体系包括：荧光PCR预混液HieffUniversal TaqMan multiplex qPCR master mix12.5μl，p72-F1(10μM)0.5μL，p72-R1(10μM)0.5μL，p72-P1(10μM)0.5μL，I177L-F2(10μM)0.75μL，I177L-R2(10μM)0.75μL，I177L-P2(10μM)0.75μL，模板5μl，使用DEPC处理水补齐至25μl。双重荧光定量PCR的反应条件为：预变性95℃5min；PCR扩增95℃15s，60℃30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。
2)用得到的Ct值和出现的典型扩增曲线实现对非洲猪瘟病毒p72和I177L基因定性检测，再根据同时生成的标准曲线，得出待测样品中所含非洲猪瘟病毒p72和/或I177L基因的拷贝数，实现定量检测。
1.6、结果判定
1.6.1、结果分析设定
反应结束后仪器将自动分析结果，也可根据仪器噪声情况调整阈值线，以刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。
1.6.2、试验成立条件
阴性对照的FAM和HEX通道均无典型扩增曲线且无Ct值显示；阳性对照的FAM和HEX通道均出现典型扩增曲线且Ct值≤35。以上要求在同一次实验中同时满足，则判为试验成立。否则，本次实验无效，需重新进行。
1.6.3、判定标准
(1)若待测样品在FAM和/或HEX荧光通道中出现典型扩增曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为非洲猪瘟病毒p72和/或I177L基因核酸阳性。
(2)若待测样品在FAM和/或HEX荧光通道中出现典型扩增曲线，且38＜Ct值≤40，则结果判定为非洲猪瘟病毒p72和/或I177L基因核酸可疑；可疑样品复检后为阳性或可疑的，结果判定为阳性，反之为阴性。
(3)若待测样品在FAM和/或HEX荧光通道无Ct值或无典型扩增曲线，则结果判定为非洲猪瘟病毒p72和/或I177L基因核酸阴性。
结合p72和I177L基因的检测结果进行综合判定，具体判定标准见表5。
表5判定标准表
实施例2对鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株双重荧光定量PCR检测方法的评价
2.1、病毒含量敏感性检测
对金宇保灵生物药品有限公司生物安全3级实验室测定的，病毒含量分别为107.0TCID50/ml、106.0TCID50/ml、105.0TCID50/ml、104.0TCID50/ml、103.0TCID50/ml、102.0TCID50/ml、101.0TCID50/ml的非洲猪瘟ASFV GZ2018株和非洲猪瘟GZ2018△I177L株灭活病毒液提取核酸，在上述确定优选的引物和探针(SEQ ID NO.1～3和SEQ ID NO.13～15)的引导下进行双重荧光PCR检测，反应体系及反应条件参照实施例1中方法1.5。结果如下表6所示，非洲猪瘟ASFV GZ2018株和非洲猪瘟GZ2018△I177L株均最低可检测到的病毒含量为102.0TCID50/ml。
表6病毒含量敏感性检测结果表
2.2、特异性检测
按照实施例1中方法1.2，对金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室备存的猪瘟病毒(C株)、伪狂犬病毒(Bartha-K61株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PC株)、猪圆环病毒2型(YZ株)、猪流行性腹泻病毒(ZJ08株)和猪传染性胃肠炎病毒(HB08株)进行基因组DNA或RNA提取。在上述确定优选的引物和探针(SEQ ID NO.1～3和SEQ ID NO.13～15)的引导下对获得的上述多种病毒核酸、非洲猪瘟ASFV GZ2018株和GZ2018△I177L株病毒核酸以及阴性对照进行双重荧光PCR检测(PCR反应体系及反应条件参照实施例1中方法1.5)，以评价方法的特异性。
检测结果如图7所示，非洲猪瘟ASFV GZ2018株在FAM和HEX通道同时出现典型扩增曲线，且Ct值≤38，结果为非洲猪瘟病毒阳性；非洲猪瘟GZ2018△I177L株只在FAM出现典型扩增曲线且Ct值≤38，HEX通道未出现典型扩增曲线且无Ct值，结果为非洲猪瘟I177L基因缺失株阳性；其他病原和阴性对照在FAM和HEX通道均未出现典型扩增曲线和Ct值，结果为非洲猪瘟病毒阴性。检测结果表明用本发明的方法，不同引物和探针相互无干扰，可特异性检测p72和I177L基因，能够鉴别非洲猪瘟病毒和I177L基因缺失株，并且与其他7种猪源病毒均无交叉反应，特异性强。
2.3、最低检测限检测
将实施例1的1.4.2中制备获得的1×101copies/μL的标准样品使用TE缓冲液再稀释至5copies/μL和1copies/μL，将1×101copies/μL、5copies/μL和1copies/μL这3个浓度的标准样品作为模板，在上述确定优选的引物和TaqMan探针(SEQ ID NO.1～3和SEQ IDNO.13～15)的引导下，各进行20次重复的双重荧光PCR检测，反应体系及反应条件参照实施例1中方法1.5，评价该方法的最低检测下限。检测结果如表7所示。
本发明提供的荧光PCR方法对浓度为5copies/μL的标准品20次重复检测(检测结果如图8所示)，p72和I177L基因2个通道均至少19次有典型扩增曲线且Ct值≤40，为p72和I177L基因核酸阳性，因此可确认该方法的最低检测下限为5copies/μL。由表7也可知，本发明的方法对1copies/μL标准样品的p72和I177L基因检出率分别为13/20(65％)、16/20(80％)，也证明本发明提供的鉴别非洲猪瘟病毒和I177L基因缺失株双重荧光PCR检测方法灵敏度高。
表7最低检测线检测结果表
2.4、重复性检测
使用实施例1中含p72和I177L阳性质粒的1×106copies/μL、1×104copies/μL、1×101copies/μL标准品，按照实施例1中的1.5方法进行5次重复的双重荧光PCR检测，计算每个模板Ct值的平均数、标准偏差和变异系数，分析和评价方法的可重复性。
检测结果如图9和表8所示，同一浓度的标准品，p72和I177L基因重复5次检测的扩增曲线均较聚拢，Ct值均无明显差距，不同浓度标准品检测3个基因循环数的变异系数CV值均小于2％，表明本发明提供的用于检测非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的双重荧光PCR方法的重复性好。
表8非洲猪瘟病毒p72和I177L基因双重荧光定量PCR重复性检测结果
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实施例3鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株双重荧光PCR检测试剂盒
本实施例提供的鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株双重荧光PCR检测试剂盒包括：
(1)引物探针：SEQ ID NO.1～3和SEQ ID NO.13～15所示的，用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的上游引物(p72-F1)、下游引物(p72-R1)和TaqMan探针(p72-P1)；以及用于检测非洲猪瘟病毒I177L基因的上游引物(I177L-F2)、下游引物(I177L-R2)和TaqMan探针(I177L-P2)。
(2)荧光PCR预混液：具体地，用于25μL荧光定量PCR检测体系的试剂：荧光PCR预混液HieffUniversal TaqMan multiplex qPCR master mix 12.5μl，p72-F1(10μM)0.5μL，p72-R1(10μM)0.5μL，p72-P1(10μM)0.5μL，I177L-F2(10μM)0.75μL，I177L-R2(10μM)0.75μL，I177L-P2(10μM)0.75μL，模板5μl，DEPC处理水补齐。
(3)对照品：为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为实施例1的1.4.2中制备的1×104copies/μL的标准样品。所述阴性对照为不含非洲猪瘟病毒的反应体系，如DEPC处理水(双蒸水、无菌去离子水等)。
(4)标准品：为方便检测，试剂盒中还可包括标准品，为携带非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的标准品(参见实施例1的1.4.2)，其浓度可为1×1010、1×109、1×108、1×107或1×106copies/μL(在建立标准曲线时，可以标准品进行梯度稀释)。
(5)说明书：为方便检测，试剂盒中还可包括试剂盒使用说明书，该说明书内容包括PCR反应程序：预变性95℃ 5min；PCR扩增95℃ 15s，60℃ 30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。
实施例4样品检测
对金宇保灵生物药品有限公司生物安全3级实验室提供的80份来自猪的灭活样品，编号为1～80，同时按照《非洲猪瘟检疫技术规范》(SN/T1559-2010)和实施例3的试剂盒进行检测。检测结果如下表9所示，《非洲猪瘟检疫技术规范》(SN/T1559-2010)方法检测为45份非洲猪瘟病毒阳性和35份非洲猪瘟病毒阴性样品。本发明试剂盒检测为45份非洲猪瘟病毒阳性，其中3份非洲猪瘟I177L基因缺失株阳性，35份非洲猪瘟病毒阴性，阳性符合率为100％(45/45)，阴性符合率为100％(35/35)，总符合率为100％(80/80)。可见，本发明提供的试剂盒，不仅能够鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失毒株，也可实现对样品中非洲猪瘟病毒p72和I177L基因定量检测。
表9 80份样品检测结果
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虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR的引物探针组合，其特征在于，含有两对特异性引物和两条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.13-14所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团并在3’端经磷酸化处理，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；
所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL中的任一种。
3.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR检测试剂或试剂盒中的应用。
4.用于鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述双重荧光定量PCR检测试剂盒在进行检测时，每25μL荧光定量PCR检测体系中包括：0.5μL浓度为10μM的p72-F1，0.5μL浓度为10μM的p72-R1，0.5μL浓度为10μM的p72-P1，0.75μL浓度为10μM的I177L-F2，0.75μL浓度为10μM的I177L-R2，0.75μL浓度为10μM的I177L-P2；p72-F1、p72-R1和p72-P1的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，I177L-F2、I177L-R2、I177L-P2的序列分别如SEQ ID NO.13-15所示。
6.根据权利要求5所述的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，每25μL荧光定量PCR检测体系中还包括：12.5μL的预混液Hieff Universal TaqMan multiplexqPCR master mix；
和/或，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含非洲猪瘟病毒p72和I177L基因的重组质粒，所述阴性对照为不含非洲猪瘟病毒及基因组的组分；
和/或，还包括标准品，所述标准品为含相同拷贝数的p72和I177L基因重组质粒混合液，浓度选自1×1010、1×109、1×108、1×107或1×106copies/μL。
7.一种非疾病诊断目的利用双重荧光定量PCR技术鉴别非洲猪瘟I177L基因缺失株的方法，其特征在于，以待测样品的DNA为检测模板，利用如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.13-14所示的特异性引物和如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.15所示的特异性探针进行双重荧光定量PCR检测，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有相应病毒，和/或根据标准曲线得出待测样品中相应病毒的含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)建立标准曲线：将计算拷贝数的重组质粒pMD19-T-p72和pMD19-T-I177L等浓度混合，按照10倍梯度稀释获得1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL的标准品；以不同浓度的标准品作为模板，在权利要求1或2所述的引物探针组合的引导下进行双重荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值对其相应Ct值作图，绘制标准曲线；
2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在权利要求1或2所述的引物探针组合的引导下进行双重荧光定量PCR检测；
3)用得到的Ct值和出现的典型扩增曲线实现对非洲猪瘟病毒的p72、I177L基因的定性检测，再根据步骤1)中的检测生成的标准曲线，得出待测样品中所含非洲猪瘟病毒的p72和I177L基因的拷贝数，实现定量检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中的双重荧光定量PCR检测的每25μL体系包括：荧光PCR预混液Hieff Universal TaqMan multiplex qPCRmaster mix 12.5μL，10μM的p72-F1 0.5μL，10μM的p72-R1 0.5μL，10μM的p72-P1 0.5μL，10μM的I177L-F2 0.75μL，10μM的I177L-R2 0.75μL，10μM的I177L-P2 0.75μL，模板5μL，DEPC处理水补齐；p72-F1、p72-R1和p72-P1的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，I177L-F2、I177L-R2、I177L-P2的序列分别如SEQ ID NO.13-15所示；
和/或，步骤1)和步骤2)中的双重荧光定量PCR检测的条件为：95℃预变性5分钟；PCR扩增95℃变性15秒，60℃延伸30秒，45个循环；
和/或，步骤3)中的定性检测的判定方法为：
阳性对照双通道均有典型扩增曲线，且Ct值≤35，阴性对照双通道均无典型扩增曲线或Ct值，则判定试验成立；否则试验不成立；
若待检样品的双通道均有典型扩增曲线且10＜Ct值≤38，则判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；
若待检样品的p72基因通道有典型扩增曲线且10＜Ct值≤38，且I177L基因通道无典型扩增曲线或Ct值，则判为非洲猪瘟I177L基因缺失株核酸阳性；
若待检样品的双通道均无典型扩增曲线或Ct值，则判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；
若待检样品的任意通道有典型扩增曲线且38＜Ct值≤40，此时目标基因可疑，需进行复检，复检后为阳性或可疑，则判为目标基因阳性，反之为阴性；当p72基因和I177L基因均为阳性时，则判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；仅p72基因阳性时，则判为非洲猪瘟I177L基因缺失株核酸阳性；当p72和I177L基因均为阴性时，则判为非洲猪瘟病毒核酸阴性。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品为用于疫苗生产的原料、疫苗半成品或成品。
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|---|---|---|---|---|
| CN117701779A (zh) * | 2024-02-04 | 2024-03-15 | 湖南派智生物科技有限公司 | 鉴别非洲猪瘟毒株的方法、引物探针组合、试剂、试剂盒及应用 |
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