CN115927743B - 一种用于同时检测hsv-1、hsv-2和vzv的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

一种用于同时检测hsv-1、hsv-2和vzv的组合物、试剂盒和方法 Download PDF

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CN115927743B CN202210891963.XA CN202210891963A CN115927743B CN 115927743 B CN115927743 B CN 115927743B CN 202210891963 A CN202210891963 A CN 202210891963A CN 115927743 B CN115927743 B CN 115927743B
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Abstract

本申请涉及一种用于同时检测HSV‑1、HSV‑2和VZV的组合物、试剂盒和方法。该组合物包括：组分A：用于检测人单纯疱疹病毒1型的上游引物1、下游引物1和探针1，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示；组分B：用于检测人单纯疱疹病毒2型的上游引物2、下游引物2和探针2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4‑6所示；和组分C：用于检测水痘‑带状疱疹病毒的上游引物3、下游引物3和探针3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7‑9所示。利用该组合物或包括该组合物的试剂盒可同时鉴别人单纯疱疹病毒1、2型和水痘‑带状疱疹病毒，具有较高的特异性和灵敏性，可重复性好，检测简便快速、节约成本。

Description

一种用于同时检测HSV-1、HSV-2和VZV的组合物、试剂盒和 方法
技术领域
本申请涉及病毒检测技术领域，尤其是涉及一种利用三重实时荧光定量RT-PCR同时检测人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)的组合物、试剂盒和方法。
背景技术
单纯疱疹病毒(Herpes simplex viruses，HSV)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)属疱疹病毒科，线性双链DNA病毒，人类是其主要宿主且普遍易感，可引起皮肤黏膜甚至中枢神经系统的症状。根据血清型的不同HSV可分为单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus-2，HSV-2)。HSV-1主要引起口腔及面部感染，严重者可引发脑膜炎；HSV2主要引起生殖道感染，是最常见的性传播病原体之一。VZV原发感染可表现为水痘，症状消退后随着免疫力的减弱，病毒再次激活引发带状疱疹(Herpes zoster，HZ)，常引起急性、高度接触性传染病。该病毒主要通过飞沫、气溶胶或接触传播，新生儿和免疫力低下者均为高危易感人群。HSV-1、HSV-2和VZV在全球范围内广泛分布，三种病原均可表现为皮肤或黏膜病变，症状较为相似，常影响临床诊断的准确性，错失最佳治疗及防控时期。
HSV-1、HSV-2和VZV感染虽然可通过临床表现进行诊断，但对于症状相似或非典型症状患者仍需实验室检测避免误诊。传统的实验室诊断方法有Tzanck涂片法、直接免疫荧光检测法和病毒培养法等，操作相对复杂且耗时较长。随着分子诊断技术的发展，大多数实验室开始采用荧光定量RT-PCR检测，但多为单重荧光检测，仅可检测单种病原，增加了实验操作时间和所需的样本量。
因此需要建立一种同时针对HSV-1、HSV-2和VZV的灵敏度高且快速的检测方法，初步应用于常见人类疱疹病毒的检测。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的缺陷，本申请提供一种利用三重实时荧光定量RT-PCR 同时检测人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)的组合物，利用该组合物或包括该组合物的试剂盒可同时鉴别人类疱疹病毒感染引发临床症状相似的病毒性病原体人单纯疱疹病毒1、2型和水痘-带状疱疹病毒，且具有较高的特异性和灵敏性，可重复性好，检测简便快速、节约成本。
为此，本申请第一方面提供了一种用于同时检测人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型和水痘-带状疱疹病毒的组合物，所述组合物包括以下组分：
组分A：用于检测人单纯疱疹病毒1型的上游引物1、下游引物1和探针1，其核苷酸序列分别为：
上游引物1：5’-CGCATCAAGACCACCTCCTC-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物1：5’-GCTCGCACCACGCGA-3’(SEQ ID NO.2)；
探针1：5’-TGGCAACGCGGCCCAAC-3’(SEQ ID NO.3)；
组分B：用于检测人单纯疱疹病毒2型的上游引物2、下游引物2和探针2，其核苷酸序列分别为：
上游引物2：5’-CGCTCTCGTAAATGCTTCCCT-3’(SEQ ID NO.4)；
下游引物2：5’-TCTACCCACAACAGACCCACG-3’(SEQ ID NO.5)；
探针2：5’-CGCGGAGACATTCGAGTACCAGATCG-3’(SEQ ID NO.6)；
组分C：用于检测水痘-带状疱疹病毒的上游引物3、下游引物3和探针3，其核苷酸序列分别为：
上游引物3：5’-AAACCGCACATGATAACGC-3’(SEQ ID NO.7)；
下游引物3：5’-GATTAGGACCATCCCCCG-3’(SEQ ID NO.8)；
探针3：5’-ACAATGAGTAGTGGCTTTATGGCGAG-3’(SEQ ID NO.9)。
本申请结合相关疱疹病毒病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，根据HSV-1、HSV-2和VZV序列的保守片段分别设计上、下游引物和探针，进而形成以HSV-1、HSV-2和VZV同时为检测靶标的组合物。利用该组合物或包括该组合物的试剂盒可同时鉴别人类疱疹病毒感染引发临床症状相似的病毒性病原体人单纯疱疹病毒1、2 型和水痘-带状疱疹病毒，且具有较高的特异性和灵敏性，可重复性好，检测结果准确可靠。
本申请中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
本申请中，术语“上游引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“下游引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正链和负链的指定发生互换时，对应的上游引物和下游引物的命名也可随之互换。也即，本申请中的上游引物和下游引物是相对而言的。
在一些实施方式中，所述探针1、探针2和探针3的5’端均修饰有荧光报告基团， 3’端均修饰有荧光淬灭基团。
本申请中，所述探针为TaqMan荧光探针。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。当荧光探针完整的时候，荧光报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收。
在一些实施方式中，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、 TEXAS RED和CY5中的任意一种，且所述探针1、探针2和探针3的5’端所修饰的荧光报告基团互不相同；所述荧光淬灭基团选自BHQ1和BHQ2中的任意一种。
本申请通过在所述探针1、探针2和探针3的5’端标记不同的荧光报告基团，能够对不同探针所发出的荧光信号进行区分，进而对待测样本中所存在的待检靶标(HSV-1、 HSV-2和VZV)进行区分。
本申请中利用上述组合物检测HSV-1、HSV-2和VZV的原理如下：
以组分A为例，组分A中的上游引物1、下游引物1和探针1均能够与HSV-1的DNA模板特异性结合，且探针1的结合位点在两条引物之间。当探针完整的时候，荧光报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。RT-PCR进行时，若待测样本中存在HSV-1，此时上游引物1、下游引物1和探针1均结合至HSV-1的DNA模板上，随着RT- PCR的进行，Taq酶在链延伸的过程中遇到与模板结合的探针1，其3’-5’外切酶活性会将探针1切断，荧光报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号；且每经过一个PCR循环，荧光信号和目的片段一样，均有一个同步指数增长(S型增长)的过程。因此，若在探针1所对应的荧光通道收集到呈S型的荧光信号曲线，表明待测样本中存在 HSV-1。
本申请所述组合物中的上下游引物和探针的特异性强，不会出现非特异性结合的情况。因此利用上述组合物能够对待测样本中的HSV-1、HSV-2和VZV同时进行特异性检测，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。
本申请第二方面提供了一种用于同时检测人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型和水痘-带状疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如本申请第一方面所述的组合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：逆转录酶以及包含DNA聚合酶和dNTPs的缓冲液，所述DNA聚合酶为Taq酶(又称，Taq DNA聚合酶)。
本申请中，所述包含DNA聚合酶和dNTPs的缓冲液中还可以包括Mg2+等成分。
在一些具体实施方式中，所述试剂盒中的逆转录酶以及包含DNA聚合酶和dNTPs的缓冲液可以采用广东华银医药科技有限公司销售的TaqMan Fast Virus1-Step MasterMix试剂盒中的相应组分。
本申请中，所述试剂盒中所述组合物的组分A、组分B和组分C可以混合包装，也可以各自独立包装。当独立包装时，组分A、组分B和组分C可以分别单独使用以对待测样本中的HSV-1、HSV-2和VZV单独进行检测。
本申请第三方面提供了一种利用如本申请第一方面所述的组合物或者第二方面所述的试剂盒对待测样本中的人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型和水痘-带状疱疹病毒进行同时检测的方法，其包括如下步骤：
S1，将待测样本中所提取的DNA、所述的组合物、包含dNTPs的缓冲液和DNA聚合酶混合，形成反应体系；
S2，对所述反应体系进行三重实时荧光定量RT-PCR扩增，得到扩增曲线；
S3，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
本申请中，所设计的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法，即在同一反应体系中，加入针对三种病原体(HSV-1、HSV-2和VZV)保守区段的具有特异性的引物和探针，解决了传统实时荧光定量RT-PCR检测方法仅可使用单对引物扩增一种病原体DNA，每次只能单独检测一种病原体的问题，减少了在操作中引起交叉污染。
在一些实施方式中，所述反应体系中各引物的浓度均为0.2～0.25μmol/L，各探针的浓度均为0.2～0.25μmol/L。
本申请中，上述各引物指的是针对HSV-1、HSV-2和VZV的上游引物1-3和下游引物1-3；上述各探针指的是针对HSV-1、HSV-2和VZV的探针1-3。
在一些具体实施方式中，所述反应体系中各引物的浓度相同，均为0.2μmol/L，各探针的浓度相同，均为0.2μmol/L。
本申请中，通过将反应体系内上下游引物和探针的浓度控制在上述范围内，使得所述方法检测HSV-1、HSV-2和VZV的效果最好，反应效率最高；反应体系内上下游引物和探针的浓度过高或高低均会降低检测效果。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述反应体系为25uL，具体为：待测样本中所提取的DNA溶液为2uL，逆转录酶为0.2μL，上游引物1-3和下游引物1-3均为0.5μL(浓度均为10μmol/L)，探针1-3均为0.25μL(浓度均为20μmol/L)，包含DNA聚合酶、 dNTPs和Mg2+的缓冲液为12.5μL和余量的去核酸酶水。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述扩增的条件包括：
50～55℃逆转录3～5分钟；
90℃～95℃预变性1～3分钟；
90℃～95℃变性5～10秒，50℃～60℃退火延伸30～40秒，35～40个循环，采集荧光。
在一些优选的实施方式中，步骤S2中，所述扩增的条件包括：
50℃逆转录5分钟；
95℃预变性2分钟；
95℃变性5秒，60℃退火延伸35秒，40个循环，采集荧光。
本申请通过采用上述扩增条件，能够对待测样本中的HSV-1、HSV-2和VZV基因进行有效扩增。
在一些实施方式中，步骤S3中，对扩增曲线进行分析判断的原则为：
当待测样本在探针1上所标记的荧光报告基团的荧光通道的扩增曲线呈S形，且Ct值在38 以内，则判断待测样本为人单纯疱疹病毒1型阳性样本；
当待测样本在探针2上所标记的荧光报告基团的荧光通道的扩增曲线呈S形，且Ct值在38 以内，判断待测样本为人单纯疱疹病毒2型阳性样本；
当待测样本在探针3上所标记的荧光报告基团的荧光通道的扩增曲线呈S形，且Ct值在38 以内，判断待测样本为水痘-带状疱疹病毒阳性样本。
在一些实施方式中，所述方法还包括分别建立人单纯疱疹病毒1型标准品模板拷贝数浓度的对数-Ct值的标准曲线、人单纯疱疹病毒2型标准品模板拷贝数浓度的对数-Ct值的标准曲线以及水痘-带状疱疹病毒标准品模板拷贝数浓度的对数-Ct值的标准曲线，以对待测样本中的人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型和水痘-带状疱疹病毒进行定量检测。
本申请通过建立标准曲线，不仅能根据实时荧光信号的动态变化对待测样本中的HSV-1、HSV-2和VZV三种病原体进行定性分析，还能够通过建立的标准曲线，实现对待测样本中的HSV-1、HSV-2和VZV的定量分析。
本申请中，所述标准曲线具体的建立方法为：将HSV-1、HSV-2和VZV三种已知拷贝数的质粒，按照1×107～1×100copy/uL浓度，分别10倍等比梯度稀释，得到8个不同拷贝数浓度的标准品模板，对上述8个不同拷贝数浓度的标准品模板进行三重实时荧光定量 RT-PCR扩增，进而获得相应疱疹病毒标准品模板拷贝数浓度的对数-Ct值的标准曲线；其中，扩增时的反应体系以及扩增条件与上述相同。
在一些实施方式中，所述方法在步骤S1之前还包括步骤S0：提取待测样本中的DNA。本申请对上述提取方法没有明确限定，其为本领域中常规采用的方法。
与其它检测方法相比，本申请所述的检测方法具有高灵敏性和特异性、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染等优点，可直接对待测样本中所提取的DNA进行检测，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值。
值得注意的是，本申请所述方法为以非疾病诊断为目的的方法。
有益技术效果为：本申请所提供的用于同时检测人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型和水痘-带状疱疹病毒的组合物为针对上述三种病原体保守区段的具有特异性的引物和探针，将其添加在同一反应体系中，可同时对样本中的人单纯疱疹病毒1、2型和水痘- 带状疱疹病毒进行检测，且不会出现交叉反应，解决了传统荧光定量RT-PCR检测方法仅可使用单对引物扩增一种病原体DNA，每次只能单独检测一种病原体的问题，减少了在操作中引起交叉污染。利用该组合物或包括该组合物的试剂盒进行检测的方法，具有高灵敏性和特异性、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染等优点，可直接对待测样本中所提取的核酸进行检测，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值。
附图说明
图1为实施例3中HSV-1的三重实时荧光定量RT-PCR扩增曲线图。
图2为实施例3中HSV-2的三重实时荧光定量RT-PCR扩增曲线图。
图3为实施例3中VZV的三重实时荧光定量RT-PCR扩增曲线图。
图4为实施例3中HSV-1的三重实时荧光定量RT-PCR标准曲线图。
图5为实施例3中HSV-2的三重实时荧光定量RT-PCR标准曲线图。
图6为实施例3中VZV的三重实时荧光定量RT-PCR标准曲线图。
图7为实施例4中对HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和CMV 5种疱疹病毒核酸样本的混合物进行三重实时荧光定量RT-PCR的扩增曲线图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：引物和探针的设计及合成
从NCBI核苷酸数据库中获取HSV-1(GenBank：X14112)、HSV-2(GenBank：Z86099)和VZV(GenBank：X04370)的全基因组序列，使用生物信息学软件Primer Express3.0根据HSV-1、HSV-2和VZV序列的保守片段分别设计上、下游引物和探针，并进行结构分析。最后利用NCBI的Primer Blast功能进行引物特异性分析，确保引物、探针对HSV-1、 HSV-2和VZV具有高度特异性。最终经筛选确定的针对HSV-1、HSV-2和VZV的引物和探针的具体核苷酸序列(5’-3’)如表1所示。经试验验证，采用表1所示的组合能够更好地避免HSV-1、HSV-2和VZV病毒检测的相互干扰，保证三种病毒同时检测的准确性。
表1
实施例2：反应体系的建立
使用广东华银医药科技有限公司销售的TaqMan Fast Virus1-Step Master Mix试剂盒，设计三重反应体系。为了保证体系的灵敏，对引物和探针用量进行了优化，经优化后的最终反应体系如下：
包含DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+的RT-PCR缓冲液12.5μL，逆转录酶0.2μL，针对三种病原体的上游引物1-3和下游引物1-3(10μmol/L)各0.5μL，HSV-1、HSV-2和VZV特异性探针1-3(20μmol/L)各0.25μL，DNA模板2μL，并用去核酸酶水将体系补至25μ L；其中反应体系中，上游引物1-3和下游引物1-3的浓度均为0.2μmol/L，探针1-3的浓度均为0.2μmol/L。
经优化试验发现，反应体系中上游引物1-3和下游引物1-3的浓度均为0.2μmol/L，探针1-3的浓度均为0.2μmol/L时，能使反应的灵敏性、反应效率和扩增效果最优，
结合3种病原体(HSV-1、HSV-2和VZV)特性，经优化后的扩增程序设置如下：50℃逆转录5min；95℃预变性2min；95℃变性5s，60℃退火延伸35s，共扩增40个循环。每个循环进行荧光信号检测。
实施例3：灵敏性评价及标准曲线的建立
将HSV-1、HSV-2和VZV三种已知拷贝数的质粒，按照1×107～1×100copy/uL浓度，分别10倍等比梯度稀释，得到8个不同拷贝数浓度的标准品模板，每个浓度设3个复孔，并使用DEPC水作为空白对照。
采用实施例2所构建的反应体系和扩增程序对上述标准品模板进行三重实时荧光定量RT-PCR检测，分别获得HSV-1、HSV-2和VZV标准品模板在不同拷贝数浓度下的扩增曲线，然后根据扩增曲线，以循环数Ct值为Y轴，HSV-1、HSV-2和VZV标准品模板的拷贝数浓度Log值为X轴，分别建立标准曲线，得出线性回归方程。HSV-1、HSV-2和 VZV三重实时荧光定量RT-PCR扩增曲线及标准曲线分别如图1-6所示；其中HSV-1标准曲线方程为：Y＝-4.03lg(X)+43.348，扩增效率Eff％＝77.08，相关系数：R2＝0.998；HSV-2标准曲线方程为：Y＝-3.58lg(X)+41.343，扩增效率Eff％＝90.249％，相关系数：R2＝0.999； VZV标准曲线方程为：Y＝-3.301lg(X)+37.482，扩增效率Eff％＝100.864％，相关系数： R2＝0.999，在上述梯度范围内，具有良好的线性关系。
同时根据荧光定量结果，确定该方法对HSV-1、HSV-2和VZV的检出限和灵敏性。结合实验结果显示，该方法的最低检测线为100copy/ml。
实施例4：特异性评价
选取本实验室已鉴定出的HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和CMV 5种疱疹病毒核酸样本的混合物作为阳性对照，使用DEPC水作为空白阴性对照，按照实施例2所构建的反应体系和扩增程序，进行三重实时荧光定量RT-PCR扩增，观察实时扩增结果，判断方法的特异性。扩增结果如图7所示。
如图7所示，仅HSV-1、HSV-2、VZV呈现S型扩增曲线，其余病原体(EBV和 CMV 5)均无扩增，表明利用本申请的组合物建立的检测方法对HSV-1、HSV-2、VZV的特异性良好。
实施例5：稳定性评价
实施例2所构建的反应体系和扩增程序，使用10倍等比梯度稀释后，5种浓度为1×106～1 ×102copy/uL的HSV-1、HSV-2和VZV三种质粒标准品模板，分别进行批内平行重复实验 3次，批间重复实验3次，分别计算批内、批间三种样本的平均Ct值、标准差(SD)和变异系数(CV)，评估该检测方法的稳定性，结果如表2和3所示。
表2：批内重复性检测结果
注：Ct：循环次数；SD：Ct值的标准差；CV：Ct值的变异系数
表3：批间重复性检测结果
注：Ct：循环次数；SD：Ct值的标准差；CV：Ct值的变异系数
从表2和表3可知，HSV-1、HSV-2和VZV标准品模板三重实时荧光定量RT-PCR的批内重复性试验Ct值的变异系数(CV)均小于2％，批间重复试验Ct值的变异系数(CV)均小于5％。说明利用本申请的组合物建立的检测方法具有良好的稳定性。
实施例6：临床样本检测
对本实验室保存的50例临床样本，使用实施例2所构建的反应体系和扩增程序进行检测，并将检测结果与原诊断结果比较，进行复合。
结果显示，使用本申请构建的三重实时荧光反应体系进行检测的检测结果与临床诊断鉴定情况一致，说明本申请的检测方法准确可靠。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (9)

1.一种用于同时检测人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型和水痘-带状疱疹病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括以下组分：
组分A：用于检测人单纯疱疹病毒1型的上游引物1、下游引物1和探针1，其核苷酸序列分别为：
上游引物1：5’-CGCATCAAGACCACCTCCTC-3’；
下游引物1：5’-GCTCGCACCACGCGA-3’；
探针1：5’-TGGCAACGCGGCCCAAC-3’；
组分B：用于检测人单纯疱疹病毒2型的上游引物2、下游引物2和探针2，其核苷酸序列分别为：
上游引物2：5’-CGCTCTCGTAAATGCTTCCCT-3’；
下游引物2：5’-TCTACCCACAACAGACCCACG-3’；
探针2：5’-CGCGGAGACATTCGAGTACCAGATCG-3’；
组分C：用于检测水痘-带状疱疹病毒的上游引物3、下游引物3和探针3，其核苷酸序列分别为：
上游引物3：5’-AAACCGCACATGATAACGC-3’；
下游引物3：5’-GATTAGGACCATCCCCCG-3’；
探针3：5’-ACAATGAGTAGTGGCTTTATGGCGAG-3’；
所述探针1、探针2和探针3的5’端均修饰有荧光报告基团，3’端均修饰有荧光淬灭基团，且所述探针1、探针2和探针3的5’端所修饰的荧光报告基团互不相同；
利用所述组合物进行检测时，反应体系中各引物的浓度均为0.2μmol/L，各探针的浓度均为0.2μmol/L。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、TEXAS RED和CY5中的任意一种；所述荧光淬灭基团选自BHQ1和BHQ2中的任意一种。
3.一种用于同时检测人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型和水痘-带状疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：逆转录酶以及包含DNA聚合酶和dNTPs的缓冲液，所述DNA聚合酶为Taq酶。
5.一种如权利要求1或2所述的组合物或者权利要求3或4所述的试剂盒在制备用于对待测样本中的人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型和水痘-带状疱疹病毒同时进行检测的产品中的应用，所述检测包括如下步骤：
S1，将待测样本中所提取的DNA、所述的组合物、包含dNTPs的缓冲液和DNA聚合酶混合，形成反应体系；
S2，对所述反应体系进行三重实时荧光定量RT- PCR扩增，得到扩增曲线；
S3，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述反应体系中各引物的浓度均为0.2μmol/L，各探针的浓度均为0.2μmol/L。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤S2中，所述扩增的条件包括：
50~55℃逆转录3~5分钟；
90℃~95℃预变性1~3分钟；
90℃~95℃变性5~10秒，50℃~60℃退火延伸30~40秒，35~40个循环，采集荧光。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤S3中，对扩增曲线进行分析判断的原则为：
当待测样本在探针1上所标记的荧光报告基团的荧光通道的扩增曲线呈S形，且Ct值在38以内，则判断待测样本为人单纯疱疹病毒1型阳性样本；
当待测样本在探针2上所标记的荧光报告基团的荧光通道的扩增曲线呈S形，且Ct值在38以内，判断待测样本为人单纯疱疹病毒2型阳性样本；
当待测样本在探针3上所标记的荧光报告基团的荧光通道的扩增曲线呈S形，且Ct值在38以内，判断待测样本为水痘-带状疱疹病毒阳性样本。
9.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述方法还包括分别建立人单纯疱疹病毒1型标准品模板拷贝数浓度的对数-Ct值的标准曲线、人单纯疱疹病毒2型标准品模板拷贝数浓度的对数-Ct值的标准曲线以及水痘-带状疱疹病毒标准品模板拷贝数浓度的对数-Ct值的标准曲线，以对待测样本中的人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型和水痘-带状疱疹病毒进行定量检测。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009122201A1 (en) * 2008-04-03 2009-10-08 Genomica S.A.U. Method for detection of herpesvirus in a test sample
AU2015202707A1 (en) * 2008-01-29 2015-06-04 Applied Genetic Technologies Corporation Recombinant virus production using mammalian cells in suspension
WO2016071925A2 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 Indian Council Of Medical Research (Icmr) TITLE: INTEGRATION OF β-ACTIN GENE FOR SAMPLE QUALITY CHECK IN HSV-1 AND HSV-2 DIAGNOSTIC KIT
CN113355402A (zh) * 2020-01-31 2021-09-07 株式会社岛津制作所 病原体检测方法和试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7348145B2 (en) * 2002-08-14 2008-03-25 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Clinical assays for the detection and typing of human herpesviruses
JP7418717B2 (ja) * 2019-06-07 2024-01-22 国立大学法人 東京医科歯科大学 微生物の検出方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015202707A1 (en) * 2008-01-29 2015-06-04 Applied Genetic Technologies Corporation Recombinant virus production using mammalian cells in suspension
WO2009122201A1 (en) * 2008-04-03 2009-10-08 Genomica S.A.U. Method for detection of herpesvirus in a test sample
WO2016071925A2 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 Indian Council Of Medical Research (Icmr) TITLE: INTEGRATION OF β-ACTIN GENE FOR SAMPLE QUALITY CHECK IN HSV-1 AND HSV-2 DIAGNOSTIC KIT
CN113355402A (zh) * 2020-01-31 2021-09-07 株式会社岛津制作所 病原体检测方法和试剂盒

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