CN113355402A - 病原体检测方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病原体检测方法和试剂盒。提供在单一的容器中同时进行组织片所包含的病原体的核酸分离工序和PCR缓冲液的制备工序的利用简便PCR法的分析方法、以及该分析方法中使用的试剂盒。一种病原体的检测方法，包含下述工序(1)～(5)。工序(1)，将包含病原体的组织片添加至包含蛋白质分解酶的PCR缓冲液中，得到检体混合液；工序(2)，将所述检体混合液在第一温度下进行加热；工序(3)，进而在第二温度下进行加热；工序(4)，将所述工序(3)中得到的液体的一部分添加至包含DNA聚合酶和一种或两种以上的PCR引物对的PCR反应用固体组合物中实施PCR；工序(5)，对所述工序(4)中生成的PCR产物进行检测。

Description

病原体检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及存在于组织片中的病原体的检测方法。另外，本发明涉及在病原体的检测中所使用的试剂盒。
背景技术
涉及病原体的扩增和检测的技术中使用各种各样的方法。例如，除了利用聚合酶链式反应(以下有时称为PCR)的PCR法之外，已知有转录-逆转录协同反应(以下有时称为TRC)法、转录介导性扩增(以下有时称为TMA)法、核酸序列基础扩增(以下有时称为NASBA)法、环介导等温扩增(以下有时称为LAMP)法、智能扩增工艺(以下有时称为SMAP)法、等温嵌合引物起始核酸扩增(以下有时称为ICAN)法等。
其中，从能够仅使特定的DNA片段选择性地扩增、以极其微量的检体溶液就能够实施、扩增所需要的时间比较短、以及工艺单纯且能够用例如全自动的台上用装置进行扩增等优点出发，PCR法是广泛地应用于研究、临床的方法。
例如在葡萄膜炎的诊断中也活用PCR法。葡萄膜炎是眼内引起炎症的疾病的总称，重症例中会大概率引起失明等视觉障碍。但是，感染性葡萄膜炎与非感染性葡萄膜炎的鉴别在仅临床所见的情况下是困难的，存在由于诊断的延迟或者不合适的治疗导致症状加重的病例。
作为成为感染性葡萄膜炎原因的病原体，可列举出病毒、细菌、真菌、原虫等，以病毒作为原因的感染性葡萄膜炎的发病频率最高。为了分别检测病原体，利用微量且迅速的PCR法。
已知有将通过PCR法进行由被检者提取的生物体试样中的病原体的有无、基因型的检测时所使用的引物、DNA聚合酶、探针收容在同一容器中而得的试剂盒(例如专利文献1)。通过使用这样的试剂盒、将由生物体试样纯化的核酸分注于该容器中，能够简便且迅速地进行PCR法。
然而，在由被检者提取的生物体试样中大量存在有抑制酶反应的物质。抑制该酶反应的物质抑制PCR，因此有必要事先去除抑制酶反应的物质。为了通过PCR法进行病原体的检测，去除抑制生物体试样中的酶反应的物质、或者对生物体试样中的DNA进行纯化的前处理是必要的。
作为减少进行上述前处理的复杂度、即便没有生物体试样的前处理也不会抑制PCR的、能够利用PCR法进行病原体检测的技术，还已知有Ampdirect(注册商标)技术(例如非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利6082141号公报
非专利文献1：Ann Clin Biochem 37，674-680(2000)
发明内容
发明要解决的问题
上述方法通常适用于病原体存在于血液、体液等液体中的情况。另一方面，如角膜炎那样在角膜这样的组织片中存在有病原体的情况下，检体试样与组织片一起被提取出来。因此，为了通过PCR法分析组织片中的病原体，首先，需要从组织片分离病原体的核酸。
作为由组织片分离病原体的核酸的方法，已知有如下方法：组织片的主要成分为蛋白质，所以在包含分解蛋白质的蛋白质分解酶例如蛋白酶K的缓冲液中添加组织片，从而将组织片的蛋白质消化。然而，蛋白质分解酶在分解蛋白质的同时也分解DNA聚合酶，因此不能使蛋白质分解酶与DNA聚合酶共存。另外，需要在实施PCR前使蛋白质分解酶失活，但是在共存有DNA聚合酶时，有DNA聚合酶也失活的可能性。
因此，需要预先将蛋白质分解酶和DNA聚合酶加入至各个反应器中，并不能像上述方法那样，向包含DNA聚合酶的PCR缓冲液中直接添加作为检体试样的组织片、利用PCR法进行病原体的核酸分析。
另外，用蛋白质分解酶分解组织片而对病原体的核酸进行分离、之后使蛋白质分解酶失活，将失活的缓冲液添加至包含DNA聚合酶的PCR缓冲液中，但由于包含蛋白质分解酶的缓冲液与包含DNA聚合酶的PCR缓冲液组成不同，因此有在添加后的包含DNA聚合酶的PCR缓冲液组成发生变化、之后的PCR不能顺利进行的情况。
因此，向包含DNA聚合酶的PCR缓冲液中的添加量受到限制，为了增加病原体的核酸量，需要增加作为检体试样使用的试验片的量。
本发明的目的在于提供如下所述的分析方法：为了从组织片分离病原体的核酸而使用的包含蛋白质分解酶的缓冲液、与PCR缓冲液并不分别设置而是共通化(在PCR缓冲液中加入蛋白质分解酶)，在单一容器中同时进行组织片中的病原体的核酸分离工序与PCR缓冲液的制备工序，由此简便地利用PCR法简便地分析组织片所包含的病原体的核酸。
用于解决问题的方案
即，本发明涉及一种病原体的检测方法，其包含下述工序(1)～(5)：
工序(1)，将包含病原体的组织片添加至包含蛋白质分解酶的PCR缓冲液中，得到检体混合液；
工序(2)，将所述检体混合液在第一温度下进行加热；
工序(3)，进一步在第二温度下进行加热；
工序(4)，将所述工序(3)中得到的液体的一部分添加至包含DNA聚合酶和一种或两种以上的PCR引物对的PCR反应用固体组合物中，实施PCR；
工序(5)，对所述工序(4)中生成的PCR产物进行检测。
发明的效果
通过本发明，能够提供在单一的容器中同时进行组织片所包含的病原体的核酸分离工序和PCR缓冲液的制备工序的、利用简便的PCR法的分析方法、以及在该分析方法中所使用的试剂盒。
具体实施方式
本发明的方法适用于包含病原体的组织片。组织片是角膜或者眼分泌物。
另外，病原体选自由单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、腺病毒(ADV)、衣原体、淋球菌和棘阿米巴组成的组。
将包含上述病原体的组织片用棉棒等进行擦拭采集，将包含所擦拭采集的病原体的组织片添加至包含PCR缓冲液和蛋白质分解酶的液体(以下，有时称为前处理溶液的、不包含DNA聚合酶)(以下，有时称为工序(1))。将附着有包含病原体的组织片的棉棒等浸入上述前处理用液体内，可以将包含病原体的组织片添加至前处理溶液中。
PCR缓冲液的组成是包含KCl、MgCl2和dNTP混合物(包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)的缓冲液。
KCl的浓度范围优选为35～75mM、更优选为约50mM左右。MgCl2的浓度范围优选为1～4mM、更优选为约1.5mM左右。dNTP混合物所包含的dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度范围分别优选为50～500μM，更优选为约200μM。
包含病原体的组织片的添加量优选为0.5mg～5mg，更优选为0.5mg～3mg，进而优选为约1mg左右。
将通过上述工序(1)得到的检体混合液在第一温度下进行加热(以下有时称为工序(2))。通过在第一温度下进行加热，蛋白质被蛋白质分解酶分解。从有效地分解蛋白质的观点出发，第一温度优选为37℃以上且60℃以下。
工序(2)只要进行至组织片的蛋白质几乎完全分解为止即可，优选例如30分钟至60分钟左右。
工序(2)之后，将在上述第一温度下进行了加热的液体进一步在第二温度下进行加热(以下，有时称为工序(3))。通过在第二温度下进行加热，蛋白质分解酶失活。从有效地使蛋白质分解酶失活的观点出发，第二温度优选为90℃以上且95℃以下。
工序(3)只要进行至蛋白质分解酶几乎完全失活为止即可，优选例如5分钟至10分钟左右。
工序(3)中在第二温度下被加热的液体的一部分被添加至另外准备的包含DNA聚合酶和一种或两种以上PCR引物对的PCR反应用固体组合物中，实施PCR反应(以下，有时称为工序(4))。
通过上述工序(4)，作为被检体的病原体的DNA被扩增。所述DNA聚合酶是来源于嗜热性细菌的耐热性DNA聚合酶，可列举出例如Taq、Tth、KOD、Pfu和它们的突变体。从避免由DNA聚合酶带来的非特异的扩增的观点出发，也可以使用热启动DNA聚合酶。作为热启动DNA聚合酶，可列举出对结合有抗DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶或者酶活性部位进行了热敏感性化学修饰的DNA聚合酶，优选为结合有抗DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶。
从能够同时检测多个病原体DNA这样的观点出发，优选如下方法：准备2个以上包含一种或两种以上PCR引物对的PCR反应用固体组合物，将所述工序(3)中得到的使蛋白质分解酶失活的液体的一部分添加至各个PCR反应用固体组合物中。例如，将所述工序(3)中得到的使蛋白质分解酶失活的液体添加至包含PCR引物对的多个PCR反应用固体组合物中来进行PCR，从而能够同时检测多个病原体的DNA。
作为工序(4)中使用的PCR引物对的例子，可列举出用于检测单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、腺病毒(ADV)、衣原体、淋球菌和棘阿米巴的PCR引物对。
上述PCR反应用固体组合物可以包含组合了两种以上而得的PCR引物。由此，可以用一个PCR反应用固体组合物检测两种以上病原体的DNA。从检测的迅速性的观点出发，优选使用组合了两种以上PCR引物对的PCR反应用固体组合物。
作为节约检体量、同时扩增多个病原体DNA的方法，提出了多重PCR(Sugita S,etal.Br J Ophthalmol.2008；92:928-932.和Sugita S,et al.Ophthalmology.2013；120:1761-1768.)。多重PCR通过在一个PCR反应体系中使用多个PCR引物对，从而同时在多个基因区域进行扩增的方法。该方法中，具有除了能够节约检体量之外、能够同时检测多个病原体的优点。然而，在实施PCR之前，需要从检体提取核酸。另外，多重PCR中，为了使利用各个PCR引物对进行的靶基因区域的扩增在一个PCR反应体系中良好地进行，需要对所使用的引物的设定和反应条件进行研究。
上述工序(4)中所使用的PCR反应用固体组合物通常利用冷冻干燥而制备，只要维持了这些固体组合物所包含的酶等的活性，对于冷冻干燥就没有限定。通过制成固体组合物，从而仅添加使所述工序(3)中得到的蛋白质分解酶失活的液体就能够开始PCR，因此测定操作变得简便。另外，在使用之前保管也变得简易。
上述工序(4)中的PCR反应用固体组合物包含用于对PCR扩增产物进行荧光检测的、用一种或两种以上荧光色素标记的寡核苷酸探针，这从检测精度的观点出发而优选。PCR反应用固体组合物包含一种PCR引物对的情况下，后述那样的用于实时测定的荧光色素可以为一种，在包含两种以上PCR引物对的情况下，需要两种以上不同的荧光色素。作为该荧光色素的例子，可列举出6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,以下有时称为FAM)、6-羧基-X-罗丹明(6-carboxy-X-rhodamine,以下有时称为ROX)、花青(Cyanine)系色素(以下有时称为Cy5)和4,7,2’,4’,5’,7’-六氯-6-羧基荧光素(4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxyfluorescein，以下有时称为HEX)。寡核苷酸探针的碱基序列可以基于PCR扩增产物的序列数据库(GenBank等)的碱基序列信息来适宜设计。
向上述的PCR反应用固体组合物中添加工序(3)中得到的在第二温度下进行了加热的液体时，PCR反应用固体组合物溶解、进行热循环，从而PCR进行。PCR条件(温度、时间和循环数)的设定可以根据假定的病原体的DNA种类等适宜设定。如果PCR进行、病原体的DNA进入工序(3)中得到的在第二温度下进行了加热的液体中，则在后述的检测PCR产物的工序中得到阳性的结果，进行疾病的诊断、疾病发病风险的判定等。
检测所述工序(4)的结果生成的PCR产物(以下有时称为工序(5))。
用于检测PCR产物的方法可列举出例如：使用了琼脂糖凝胶的电泳法、基于热熔解曲线的检测、荧光检测等方法。另外，从检测迅速性的观点出发，优选被称为实时测定的检测方法。
PCR产物的实时测定也被称为实时PCR。实时PCR中，通常通过荧光来检测PCR扩增产物。荧光检测方法中，有使用了嵌入性荧光色素的方法和使用了荧光标记探针的方法。嵌入性荧光色素的例子，可列举出SYBR(注册商标)Green I。嵌入性荧光色素与通过PCR合成的双链DNA结合，通过激发光的照射发出荧光。通过测定其荧光强度，从而能够测定PCR扩增产物的生成量。
作为荧光标记探针，可列举出水解探针、分子信标(Molecular Beacon)、循环探针等。水解探针是5’末端用荧光色素修饰、另外3’末端用猝灭物质修饰的寡核苷酸。水解探针在PCR的退火步骤与模板DNA特异地杂交，由于在探针上存在有猝灭剂，所以即便照射激发光也不会抑制荧光的发生。在之后的延伸反应步骤中，例如通过具有Taq DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性，与模板DNA杂交的水解探针被分解时，荧光色素从探针游离、利用猝灭剂的荧光产生的抑制被解除，从而发出荧光。通过测定其荧光强度，从而能够测定扩增产物的生成量。
作为所述荧光色素的例子，可列举出与上述的荧光色素同样的荧光色素。作为所述猝灭剂的例子，可列举出TAMRA(注册商标)、Black Hole Quencher(BHQ、注册商标)1、BHQ2、MGB-Eclipse(注册商标)和DABCYL等。为了区别两种以上靶核酸并检测，使用各不相同的荧光色素进行了标记的两种以上寡核苷酸探针(例如水解探针)进行PCR，从检测精度的观点出发而优选。
进行PCR产物的实时测定的情况下，应用对应于所使用的荧光色素的荧光滤波器对PCR产物的扩增曲线进行监测，由此能够实时地确认PCR的进行状况。荧光强度与PCR循环数相应地增加的情况下，病原体的DNA的存在被判定为阳性，另一方面，PCR中，荧光强度不增加的情况下被判定为阴性。
PCR法的情况下，被指出产生试剂的加入错误等人为错误的可能性变高，而被赋予错误的检测结果。除人为错误以外，也存在以前进行的核酸扩增反应的扩增产物混入(污染)新进行的核酸扩增反应的容器内从而产生伪阳性等的情况。
另外，在进行核酸的扩增和检测时，尽管实际上为阳性，但由于某种原因会有出现阴性的结果(伪阴性)的情况。这样的伪阴性的结果是因为本来应该检测的核酸没有被检测到，所以需要尽可能防止伪阴性。
从防止上述伪阳性、伪阴性的观点出发，本发明的病原体的检测方法中优选还包含：将所述工序(3)中得到的液体的一部分添加至包含DNA聚合酶、阳性对照核酸和PCR反应对照核酸的PCR对照用固体组合物中，实施PCR的工序(以下有时称为工序(6))；以及对所述工序(6)中生成的PCR产物进行检测的工序(以下有时称为工序(7))。
上述工序(6)中使用的阳性对照核酸在被检病原体的定量(绝对定量、相对定量)中也是有用的。用于绝对定量的情况下，例如基于已知浓度的阳性对照核酸的测定结果制作标准曲线，由此能够精度良好地进行未知浓度的病原体的定量。另外，在应用于相对定量的情况下，例如，对于达到一定浓度为止所需要的循环数，在阳性对照核酸与被检病原体之间进行比较，基于通过1次循环扩增至2倍的PCR原理，也能够计算出相对的浓度差。
上述阳性对照核酸既可以是从被检病原体中预先提取、扩增而得到的，也可以是另行从不同的生物物种提取的。另外，阳性对照核酸也可以是人工合成的核酸。
上述阳性对照核酸优选为被认为包含于检体病原体中的核酸，从上述效果的观点出发更优选管家基因。
作为管家基因，可列举出TATA-结合蛋白(TATA-binding protein，以下有时被称为TBP)基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,以下有时称为GAPDH)基因、β-肌动蛋白基因、β2-蛋白微球基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1，以下有时称为HPRT 1)、18SrRNA基因、5-氨基酮戊酸合成酶(5-aminolevulinate synthase，以下有时称为ALAS)基因、β珠蛋白(β-globin)基因、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，以下有时称为G6PD)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase，以下有时称为GUSB)基因、输入蛋白8(importin8，以下有时称为IPO8)基因、胆色素原脱氨酶(porphobilinogen deaminase，以下有时称为PBGD)基因、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，以下有时称为PGK1)基因、肽基脯氨酸异构酶A(peptidylprolyl isomerase A，以下有时称为PPIA)基因、核糖体蛋白L13a(ribosomal protein L13a,以下有时称为RPL13A)基因、核糖体蛋白大P0(ribosomal protein large P0，以下有时称为RPLP0)基因、琥珀酸脱氢酶亚单位A(succinate dehydrogenase subunit A，以下有时称为SDHA)基因、运铁蛋白受体(transferrin receptor,以下有时称为TFRC)基因、3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白Z(3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,zeta(以下，有时称为YWHAZ)基因等。
上述工序(6)中所使用的PCR反应对照核酸成为如下指标：表示通过显示阳性的扩增曲线而进行正确分析、即被检病原体被正确添加至上述PCR反应用固体组合物中的指标。
PCR反应对照核酸既可以是从被检病原体中预先提取、扩增而得到的，也可以是另行从不同的生物物种提取的。另外，PCR反应对照核酸也可以是人工合成的核酸。
上述PCR对照核酸优选为被检病原体所包含的核酸，从上述效果的观点出发更优选管家基因。
作为管家基因，可例示出与上述阳性对照核酸相同的核酸，从确认被检病原体被正确地添加至PCR反应用固体组合物中的观点出发，优选使用与阳性对照核酸不同的核酸。
上述工序(6)中所使用的PCR对照用固体组合物与上述PCR固体组合物同样地通过冷冻干燥而制备，只要能维持这些固体组合物所包含的酶等的活性，则对冷冻干燥没有限定。通过制成固体组合物，从而仅添加使所述工序(3)中得到的蛋白质分解酶失活的液体就能够开始PCR，因此测定操作变得简便。另外，在使用之前的保管也变得简易。
上述工序(7)中检测PCR产物的方法与上述工序(5)同样地可列举出例如：使用了琼脂糖凝胶的电泳法、基于热熔解曲线的检测、荧光检测等方法。另外，从检测迅速性的观点出发，优选被称为实时测定的检测方法。从操作的简略化的观点出发，优选工序(5)与工序(7)的检测PCR产物的方法相同。
例如，工序(5)、工序(7)均进行实时PCR的情况下，如果上述阳性对照核酸的荧光强度与PCR循环数相应地增加，则可以判断病原体没有差错地供于工序(4)。另外，如果上述PCR反应对照核酸的荧光强度与PCR循环数相应地增加，则可以判断病原体没有差错地供于工序(4)，并且DNA聚合酶和PCR引物对正常工作。因此，判定病原体的存在为阴性时的可靠性提高。
从检测精度的观点出发，作为阳性对照核酸与PCR反应对照核酸的组合，优选为GAPDH和TBP的组合。GAPDH是作为管家基因在很多组织、细胞中共通且表达一定量的基因，作为用于确认PCR进行的阳性对照而使用。TBP是与被称为TATA box的DNA序列结合的基本转录因子，反映细胞数，因此作为用于确认细胞被提取、包含于检体的PCR反应对照而使用。
为了有效地进行上述检测方法，本发明还提供包含下述(1)和(2)的病原体的检查用试剂盒。
(1)具备PCR缓冲液和蛋白质分解酶的检体提取容器；
(2)具备PCR反应用固体组合物的至少一个以上PCR反应容器，所述PCR反应用固体组合物包含DNA聚合酶和一种或两种以上PCR引物对；
上述检查用试剂盒能够提取极其少量的检体，按照上述的各工序检查多个靶核酸的情况下有效地进行检查。
本发明的检查用试剂盒包含具备PCR缓冲液和蛋白质分解酶的检体提取容器。所包含的PCR缓冲液和蛋白质分解酶如上所述。对于检体检测容器的形状、大小等没有特别的限制，优选处理简便且耐试剂性优异的材质。另外，优选可视性优异的材质。从处理性的观点出发，优选带盖的容器。
在上述检体提取容器内浸渍擦拭采集了包含病原体的组织片的棉棒等，通过将检体提取容器内的液体与包含病原体的组织片进行混合，从而得到检体混合液。包含得到的检体混合液的检体提取容器直接在第一温度下被加热，接着在第二温度下被加温。
本发明的检查用试剂盒包含至少一个具备PCR反应用固体组合物的PCR反应容器，所述PCR反应用固体组合物包含DNA聚合酶和一种或两种以上的PCR引物对。用所述检体提取容器提取在第二温度下被加热的液体的一部分，向所述PCR反应容器中滴加必要量，如上所述进行热循环，由此在PCR反应容器内进行PCR反应，如果在检体中存在病原体，则进行病原体的扩增。
PCR反应用固体组合物所包含的DNA聚合酶和一种或两种以上的PCR引物对如上所述。另外，针对PCR反应用固体组合物也如上所述。
另外，上述PCR反应容器可以包含用于对上述PCR扩增产物进行荧光检测的、含有用一种或两种以上荧光色素进行了标记的寡核苷酸探针的PCR反应用固体组合物。从能够削减检体量的观点出发，优选使用含有多个PCR引物对和/或两种以上荧光色素的PCR反应用固体组合物。
PCR反应容器的个数可以根据检体病原体、PCR反应用固体组合物所包含的PCR引物对的种类数而适宜设定。从处理性的观点出发，优选带盖的容器。
本发明的检查用试剂盒从防止伪阳性、伪阴性的观点出发，也可以进一步包含具备PCR对照用固体组合物的PCR反应对照容器，所述PCR对照用固体组合物包含DNA聚合酶、阳性对照核酸和PCR反应对照核酸。用所述检体提取容器提取在第二温度下被加热的液体的一部分，对所述PCR反应对照容器滴加必要量，如上所述进行热循环，由此在PCR反应对照容器内PCR反应进行，从而进行阳性对照核酸和PCR反应对照核酸的扩增。
PCR反应对照用固体组合物所包含的DNA聚合酶、阳性对照核酸和PCR反应对照核酸如上所述。另外，针对PCR反应对照用固体组合物，如上所述。
PCR反应对照容器任选为1个或2个以上。从操作的简便性的观点出发，PCR反应对照容器优选为1个。另一方面，从使PCR反应的结果准确度更高这样的观点出发，PCR反应对照容器优选为2个以上。从靶核酸的种类数、检体的量等出发，可以适宜设定PCR反应对照容器的数。另外，上述PCR反应对照容器也可以包含用于对上述的PCR扩增产物进行荧光检测的、含有用一种或两种以上的荧光色素进行了标记的寡核苷酸探针的PCR对照用固体组合物。
利用上述检查用试剂盒得到的PCR产物被供于电泳法、利用热熔解曲线的检测、荧光检测等分析方法而被分析。
上述检体提取容器、PCR反应容器、PCR反应对照容器的材质、形状、容量等任选相互不同或者相同。对于材质，优选处理简便且耐化学药品性优异的材质。另外，优选可视性优异的材质。作为这些材质的例子可列举出玻璃、聚丙烯等。
形状、容量等从例如处理的观点出发，优选都相同，但从抑制检体、各混合物的漏添加等人为错误的观点出发，优选预先设置为能够通过色彩、符号、序号等识别各容器。
作为用于各容器的试管，可列举出将多个试管连接而得到的联排管，优选为孔连接的联排管。数通常为2～12，优选为2～10、更优选为2～8。
实施例
接着列举出实施例，对本发明详细地进行说明，本发明的范围不限定于此。
实施例1
[感染性角膜炎阳性检体的检测]
将由疑似患感染性角膜炎的患者得到的检体的角膜或者眼分泌物与180μL的前处理液(包含蛋白质分解酶的PCR缓冲液)进行混合。混合后的前处理液的组成设为200μg/mL蛋白酶K、0.05％(w/v)非离子性表面活性剂、1.5mM MgCl2、35mM KCl和各200μM dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。将前处理后的液体向包含PCR反应用固体组合物的8联排管(tube strip)的各试管中分注各20μL。联排管内的PCR反应用固体组合物包含DNA聚合酶、以及用于对每个试管的不同的PCR扩增产物进行荧光检测的进行了荧光色素标记的寡核苷酸探针、和PCR引物对。
作为病原体的检测用PCR引物对，使用以下的碱基序列。
GAPDH基因检测用引物对
(正向)5’-tgtgctcccactcctgatttc-3’(序列号1)
(反向)5’-cctagtcccagggctttgatt-3’(序列号2)
TBP基因检测用引物对
(正向)5’-gcaccactccactgtatccc-3’(序列号3)
(反向)5’-cccagaactctccgaagctg-3’(序列号4)
HSV-1检测用引物对
(正向)5’-cgcatcaagaccacctcctc-3’(序列号5)
(反向)5’-gtcagctcgtgRttctg-3’(序列号6)
扩增的靶基因：UL27
VZV检测用引物对
(正向)5’-tcactaccagtcatttctatccatctg-3’(序列号7)
(反向)5’-gaaaacccaaaccgttctcgag-3’(序列号8)
扩增的靶基因：ORF29
腺病毒检测用引物对
(正向1)5’-tgggcgtacatgcacatc-3’(序列号9)
(正向2)5’-gtggtcttacatgcacatc-3’(序列号9)
(正向3)5’-atggtcttacatgcacatc-3’(序列号9)
(正向4)5’-tgggcatacatgcacatc-3’(序列号9)
(正向5)5’-tgggcttacatgcacatc-3’(序列号9)
(反向1)5’-cgggcgaactgcacca-3’(序列号10)
(反向2)5’-cgggcaaactgcacca-3’(序列号10)
(反向3)5’-cgggcgaattgcacca-3’(序列号10)
(反向4)5’-cgggcaaattgcacca-3’(序列号10)
(反向5)5’-cgggcaaactgcacga-3’(序列号10)
所扩增的靶基因：
衣原体检测用引物对
(正向)5’-gaaaagaacccttgttaagggag-3’(序列号11)
(反向)5’-cttaactccctggctcatcatg-3’(序列号12)
所扩增的靶基因：
淋球菌检测用引物对
(正向)5’-ggaaagtaatcagatgaaaccagttc-3’(序列号13)
(反向)5’-ggatcggtatcactcgctct-3’(序列号14)
所扩增的靶基因：
棘阿米巴检测用引物对
(正向1)5’-tcaaagcaggcagatYcaatt-3’(序列号17)
(正向2)5’-tcaaagcaggcagatttaacca-3’(序列号17)
(反向)5’-gtcctattccattatcccatgctaa-3’(序列号18)
所扩增的靶基因：
用于检测利用PCR的扩增产物的寡核苷酸探针使用5’末端用荧光色素ROX进行了标记的物质。所使用的所有寡核苷酸探针使用了3’末端用猝灭物质BHQ进行了修饰的物质。探针的碱基序列使用以下的物质。
GAPDH基因检测用探针
5’-aaaagagctaggaaggacaggcaacttggc-3’(序列号23)(ROX标记)
TBP基因检测用探针
5’-acccccatcactcctgccacgc-3’(序列号24)(ROX标记)
HSV-1检测用探针
5’-tggcaacgcggcccaac-3’(序列号25)(ROX标记)
VZV检测用探针
5’-tgtctttcacggaggcaaacacgt-3’(序列号26)(ROX标记)
腺病毒检测用探针
5’-caggaYgcYtcggagta-3’(序列号27)(ROX标记)
衣原体检测用探针
5’-caaaaggcacgccgtcaac-3’(序列号28)(ROX标记)
淋球菌检测用探针
5’-gaaacacgccaatgaggggcatgat-3’(序列号29)(ROX标记)
棘阿米巴检测用探针
5’-ctgccaccgaatac-3’(序列号31)(ROX标记)
对于包含通过了处理检体的PCR缓冲液溶解的PCR反应用固体组合物的8连联排管，使用实时PCR装置、利用水解探针法对PCR反应进行监测。作为PCR条件，进行95℃/10秒的初始变性、接着进行95℃/5秒-60℃/20秒的PCR 45个循环。作为对象的病原微生物的存在(阳性)或者非存在(阴性)基于Cq值(扩增曲线与阈值线(Threshold Line)交叉的循环数)进行判断。另外，作为对照，利用各检体将DNA纯化之后，利用实时PCR(qPCR)法对拷贝数进行定量。
针对通过本发明的方法测定的病原体，与实时PCR(qPCR)法进行比较。另外，对于利用实时PCR(qPCR)法的定量值与通过本发明的方法测定的Cq值的相关性进行调查。
以上的结果，对于能够用实时PCR(qPCR)法定量的阳性检体，即便在使用本发明的方法测定的情况下也均为阳性。另外，显示出鉴定出了HSV-1、VZV、腺病毒、衣原体、淋球菌和棘阿米巴。还显示了，定量值与Cq值之间相关性。
实施例2
〔被诊断为非感染性葡萄膜炎的检体的分析〕
针对由被诊断为非感染性葡萄膜炎的患者得到的检体，通过实时PCR(qPCR)法和本发明的方法进行测定。实时PCR(qPCR)法中，所有的检体均为阴性，本发明的方法中均为阴性。即，由两种方法得到的测定结果表现出一致。
[方式]
本领域技术人员可以理解，上述的例示的实施方式为以下方式的具体例。
[1]一种病原体的检测方法，其包含下述工序(1)～(5)：
工序(1)，将包含病原体的组织片添加至包含蛋白质分解酶的PCR缓冲液中，得到检体混合液的工序(1)；
工序(2)，将所述检体混合液在第一温度下进行加热；
工序(3)，进一步在第二温度下进行加热；
工序(4)，将所述工序(3)中得到的液体的一部分添加至包含DNA聚合酶和一种或两种以上的PCR引物对的PCR反应用固体组合物中，实施PCR；
工序(5)，对所述工序(4)中生成的PCR产物进行检测。
根据上述[1]的发明，可以提供在单一容器中同时进行组织片所包含的病原体的核酸分离工序与PCR缓冲液的制备工序的、利用简便的PCR法的分析方法。
[2]根据上述[1]所述的检测方法，其中，所述工序(2)的第一温度为37℃以上且60℃以下。
通过上述[2]的发明，能够有效地分解蛋白质。
[3]根据上述[1]所述的检测方法，其中，所述工序(3)的第二温度为90℃以上且95℃以下。
通过上述[3]的发明，能够有效地使蛋白质分解酶失活。
[4]根据上述[1]所述的检测方法，其中，所述组织片为角膜或者眼分泌物。
[5]根据上述[1]所述的检测方法，其中，病原体选自由单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、腺病毒(ADV)、衣原体、淋球菌和棘阿米巴组成的组。
根据上述发明[4]和[5]，能够简便地对角膜或者眼分泌物中的各种各样的病原体进行检测。
[6]根据上述[1]所述的检测方法，其中，所述蛋白质分解酶为蛋白酶K。
根据上述发明[6]，能够有效地分解蛋白质。
[7]根据上述[1]所述的检测方法，其中，所述工序(5)的PCR产物的测定是以实时PCR进行的。
根据上述发明[7]，能够迅速地进行病原体的检测。
[8]一种病原体的检测用试剂盒，其包含下述(1)和(2)：
(1)具备PCR缓冲液的检体提取容器，所述PCR缓冲液包含蛋白质分解酶；
(2)具备PCR反应用固体组合物的至少一个以上的PCR反应容器，所述PCR反应用固体组合物包含DNA聚合酶和一种或两种以上的PCR引物对。
根据上述发明[8]，可以提供一种试剂盒，其能够在单一容器中同时进行组织片所包含的病原体的核酸分离工序与PCR缓冲液的制备工序。

Claims (8)

1.一种病原体的检测方法，其包含下述工序(1)～(5)：
工序(1)，将包含病原体的组织片添加至包含蛋白质分解酶的PCR缓冲液中，得到检体混合液；
工序(2)，将所述检体混合液在第一温度下进行加热；
工序(3)，进一步在第二温度下进行加热；
工序(4)，将所述工序(3)中得到的液体的一部分添加至包含DNA聚合酶和一种或两种以上的PCR引物对的PCR反应用固体组合物中，实施PCR；
工序(5)，对所述工序(4)中生成的PCR产物进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述工序(2)的第一温度为37℃以上且60℃以下。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述工序(3)的第二温度为90℃以上且95℃以下。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述组织片为角膜或眼分泌物。
5.根据权利要求1所述的病原体的检测方法，其中，病原体选自由单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、腺病毒(ADV)、衣原体、淋球菌和棘阿米巴组成的组。
6.根据权利要求1所述的病原体的检测方法，其中，所述蛋白质分解酶为蛋白酶K。
7.根据权利要求1所述的病原体的检测方法，其中，所述工序(5)的PCR产物的测定是用实时PCR来进行的。
8.一种病原体的检测用试剂盒，其包含下述(1)和(2)：
(1)具备PCR缓冲液的检体提取容器，所述PCR缓冲液包含蛋白质分解酶；
(2)具备PCR反应用固体组合物的至少一个以上的PCR反应容器，所述PCR反应用固体组合物包含DNA聚合酶和一种或两种以上的PCR引物对。
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