CN101092645A - 诊断性传染病致病原的新颖方法 - Google Patents

Abstract

本发明关于一个新颖的方法，从一个检体中诊断出性传染病的不同致病原，本方法包括使用一引物组同步扩增不同致病原的DNA片段，并以特异的探针鉴定扩增的DNA片段。本发明同时提供引物组及探针的设计步骤。本发明进一步提供诊断奈瑟氏淋病双球菌及砂眼披衣菌的试剂盒。

Description

诊断性传染病致病原的新颖方法

技术领域

本发明是关于一个用于诊断性传染病致病原的方法，本发明另外关于用来增殖及鉴定性传染病致病原的聚核苷酸。

背景技术

性传染病(sexually transmitted diseases，STDs)是世界上一个重要的健康问题。在开发中国家，性传染病呈现出一些问题，例如：较高的发生率及盛行率、抗药性的比例已到令人担忧的程度、高比例的严重并发症及与人类免疫缺乏病毒(HIV)感染的交互作用等。而针对传统的传染病，如淋病、披衣菌感染及梅毒等的诊断及治疗，在这些国家中也是普遍缺乏的。

尤其发生在妇女的其它并发症，例如：骨盆发炎、子宫外孕、不孕及子宫颈癌等，都是严重的健康及社会问题。在大部分的发展中国家，其STDs的发生率及盛行率可能是已开发国家的二十倍以上。点盛行率的研究，在开发中国家已被广泛的应用。这样的信息虽然有用但却有限制，因为其大部分是由高危险的个人或病人所获得，因此无法完整的呈现整个族群。虽然开发中国家是一个异源性的社会，但其至少有一个共同的特质，即相较于已开发国家，在开发中国家的社会，STDs预期会发生在20岁到40岁的族群，这样的后果在开发中国家不仅会造成STDs有较高的绝对发生率，而且在未来也可能会有恶化的情况。

STDs可再分为可治愈与不可治愈两类，可治愈的STDs有奈瑟氏淋病双球菌(Neisseria gonorrhoeae)、砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、钩端螺旋体(Treponemapallidum)，及阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)的感染，而不可治愈的STDs是病毒性的来源，例如：HIV、单纯疱疹病毒(HSV)、人类乳突瘤病毒(HPV)及B型肝炎病毒等。

世界卫生组织(WHO)曾负责调查STDs及HIV感染的问题，其估计成人感染STDs一年总共有3.33亿的新生病例，而这些新生病例中，有一千两百万是梅毒，六千两百万是淋病，八千九百万是披衣菌感染，以及一亿七千万的滴虫病，这些还不包括WHO之前估计的每年三千万的生殖器乳突瘤病毒感染及两千万的疱疹型感染等。在STDs中，生殖器溃疡有相对较高的发生频率，而在发展中国家，梅毒所造成的软性下疳则是造成生殖器溃疡的主要原因。STDs主要集中于东南亚及亚撒哈拉非洲地区(sub-Saharan Africa)，在1995年时，分别有大约一亿五千万及六千四百万的新生病例。

砂眼披衣菌(C.trachomatis或CT)和奈瑟氏淋病双球菌(N.gonorrhoeae或NG)是两种最常见的性传染病感染原，根据WTO的资料显示，全球感染CT的个案每年增加四百万到一千万，而NG的感染则增加三至四百万。

砂眼披衣菌(CT)是胞内寄生的革兰氏阴性菌，共有十五种血清型，分别会引起不同的疾病，其中血清型D到K会造成男女的性病，在临床上，CT会造成淋巴肉芽肿及男女生殖系统的发炎，而曾感染五亿人的慢性病-砂眼，则可能会造成失明，如果没有早期的诊断和治疗，CT引起的尿道炎及子宫颈炎，可能会导致种种的慢性发炎，例如：阴道炎、输卵管炎及骨盆发炎等，这些可能造成不孕及子宫外孕。此外，如果母亲已染病的话，生产时可能会造成新生儿的肺部及(或)眼睛感染。

目前在临床研究上有许多CT的诊断方法，例如：细胞培养、直接免疫萤光抗体分析及酶免疫分析。然而，随着技术的进展，目前的诊断模式则是利用DNA探针直接或结合核酸扩增并用DNA探针确认。虽然细胞培养是CT诊断的标准方法，然而，使用核酸扩增及DNA探针的结果，证明了其敏感性及特异性较传统的细胞培养法好。

奈瑟氏淋病双球菌(NG)是淋病的致病原，属革兰氏阴性双球菌，会造成男性的尿道化脓发炎及肿胀，80％的感染者会有这些症状，且在感染后2-7天发作，如果不作治疗，感染会升高，且在几周后会出现摄护腺炎的症状。

在女性，80％的感染者没有或仅有轻微的症状，初期是感染子宫颈及尿道，有20％会扩散到输卵管并导致不孕。因为感染的过程通常没有症状，因此很多带原者会在不知不觉中散布这项疾病。

NG的诊断初步会使用选择性培养基来筛选致病原，或用革兰氏染色来观察其双球菌的形态，虽然临床上使用培养的方法有很好的敏感性，但其仅适用于理想的状况，不当的储存及运送都可能造成样品中的致病原灭失及伪阳性的结果，其中伪阳性的结果可能是由于粗糙地的取样技术、不适当的取样材质及人体中的一些致病原抑制物质。目前，针对奈瑟氏淋病双球菌常用的诊断模式是包括无培养的核酸扩增及DNA探针的确认。

发明内容

发明简述

本发明提供了一个鉴定性传染病不同致病原的方法，其包括：

(a)以一组引物同步扩增不同致病菌的DNA片段；

(b)以不同的特定探针和扩增的DNA片段杂交；及

(c)确认杂交的产物。

本发明同时提供一个设计引物组的流程，以用于同步扩增不同性传染病致病原的DNA片段，其包括：

(a)在微生物的基因组中找出一段保守区域；(b)将这些微生物的保守区域的序列排列；(c)从保守区域内找出目标片段，其中该片段的两端序列在这些微生物中是一样的，且此片段中必须含有差异的序列，以用来鉴定微生物；(d)选择目标片段两端的序列当引物组；(e)定义正向及反向的引物，即正向引物在这些微生物中均为正向的引物，同样的，反向引物在这些微生物中均为反向的引物；(f)选择目标片段中差异的部分当作探针序列。本发明同时提供一组引物，用以扩增奈瑟氏淋病双球菌及砂眼披衣菌的DNA片段，其序列为5’-CGCGAAGAACCTTACCTGGTTTTGACATG-3’及5’-GGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTC-3’。本发明亦提供一个探针序列，用以鉴定扩增后的DNA片段，其包括：(a)针对砂眼披衣菌的5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’；及(b)针对奈瑟氏淋病双球菌的5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3，。本发明更进一步提供一个试剂盒用以检测奈瑟氏淋病双球菌及砂眼披衣菌，其中包含一组引物用以扩增DNA，及一段探针序列以鉴定扩增的DNA片段。

发明详述

用于本公开内容及申请专利范围之专有名词，定义如下：

核苷酸

是核酸的次单元体，其由磷酸、五碳糖与含氮碱基所组成，其中五碳糖在RNA的是核糖，而DNA的则是去氧核糖。此专有名词同时包含其类似物。

核酸探针

一段单股的核酸序列，可以和单股的互补序列结合形成双股的分子，一段核酸探针可能是一段寡核苷酸或一个核苷酸的聚合物。

杂交

核酸的两个互补股结合而形成双股分子的过程。

探针特异性

为探针的特性，其能够区别目标及非目标的序列。根据序列及分析条件，探针特异性可能是绝对的(例如：探针可以区别目标及非目标生物)，或者它可以是功能性(例如：探针可以在某一样品中，区别出目标生物与其它生物)，而根据使用的条件，探针序列可有或广或窄的特异性。

变异区域

在目标及非目标生物的核苷酸序列中，至少相差一个碱基的部分。

保守区域

非变异的区域

本发明是关于鉴定性传染病(STD)不同致病原的方法，其包括：(a)以一组引物同步扩增不同致病原的DNA片段，(b)以不同的特异探针与扩增后的DNA片段杂交；及(c)确认杂交的产物。性传染病的致病原是选自细菌、病毒、真菌、立克次体及披衣菌。使用本方法，可以从一个检体中检测出不同的致病原。

本方法仅包含一次的DNA扩增及特异性杂交，DNA扩增的步骤中有一组新颖的引物，此引物是从不同致病原的基因组的保守区域中所设计出来，可用于同步扩增STDs所有致病原的DNA片段，而保守区域是选自5S rRNA基因，16S rRNA基因，23S rRNA基因，5.0S rRNA基因，5.8S rRNA基因，18S rRNA基因，28S rRNA基因，类16S RNA基因，及类23S rRNA基因。特异性杂交的步骤中包括数个特定引物，而这些特定引物是根据保守区域中的变异部分所设计出来，用以鉴定扩增的DNA片段。

引物及探针的设计叙述如下：

用来扩增性传染病不同致病原DNA片段的引物组，其设计步骤包括(a)在不同致病原的基因组中选出一个保守区域；(b)将不同致病原中保守区域的序列排列；(c)从保守区域内找出一个目标片段，其中该片段的两端序列在不同致病原中是一样的，且此片段中必须含有不同的序列，以用来鉴定不同的致病原；(d)将目标片段的两端序列选为引物；(e)规定正向及反向引物，即正向引物的序列，在不同的致病原间均同为正向的引物，而反向引物的序列，在不同的致病原间均同为反向的引物；(f)将目标片段中不同的部分选为该致病原的特异探针。

首先，从STDs的致病原中选出我们想检测的数个致病原，例如：砂眼披衣菌/奈瑟氏淋病双球菌，砂眼披衣菌/钩端螺旋体，或砂眼披衣菌/奈瑟氏淋病双球菌/钩端螺旋体，性传染病的致病原包括细菌、病毒、真菌、立克次体及披衣菌。用生物信息软件，如DNAsis将选出来的致病原的核酸序列排列，为节省排列时间，我们可以选择已知带有高保守序列的某些基因或DNA区域，例如：rRNA基因。除了病毒之外，所有原核生物都有rRNA，包括5S rRNA，16S rRNA，及较大的23S rRNA，真核生物已知有5.0S，5.8S，18S及28S rRNA或类似的结构。(使用“类16S”一词有时是惯指发现于核糖体小次单位中的rRNA分子，包括18S及17S rRNA。同样地，“类23S”及“类5S”亦惯指发现于核糖体大次单位中的rRNA分子。5.8S rRNA等于是类23S rRNA的5’端)。这些rRNA分子中的核苷酸序列在检测的所有生物中是高度保守的。

尽管这些rRNA有高度的保守性，仍然可以在一些区域中发现序列的差异，而这些差异甚至存在于相近的物种之间，因此可以用来区分这些生物。这些rRNA基因的差异并不是随机的遍布于基因中，而是集中于特定的区域。而保守的程度也各不相同，创造出遍布核糖体RNA次单位的独特保守模式，其差异的程度及分布可以用来分析诊断探针的目标位置。

将致病原中所选的DNA序列排列，以筛选出存在这些致病原中的保守区域，从这些筛选出的保守区域中，我们找到一个区域，其两端序列在所选的致病原中是一样的，而两端之间则含有变异的区域。保守区域两端的序列不需要完全一样，更明确的说，一端的序列可与另一端的不同；然而，保守区域一端的序列，在所选的致病原间必需是相同的。

从保守区域的两端，我们选择适当长度的核苷酸来设计引物组，包括正向及反向的引物。规定正向及反向引物，其中在一致病原的正向引物序列与另一致病源的正向引物相同，而在一致病原的反向引物序列与另一致病源的反向引物相同，根据描述的步骤，设计的引物组可以用来扩增所有选用的致病原。

从保守区域两端中间的变异区，我们选择一段独特的核苷酸片段，且此片段是特异于每一株选用的致病原，选择此独特核苷酸片段的适当长度来设计探针，每一个设计的探针都高度特异于其相对的致病原，因此，当检体中致病原的DNA扩增完之后，藉由特异的探针与扩增的DNA杂交，我们可以诊断出探针特异的致病原是否存在于检体之中。

DNA扩增的步骤是熟知的技术，但不局限于聚合酶链式反应(PCR)，TMA，滚环扩增，基于核酸序列的扩增(NASBA)及链置换扩增(SDA)等。熟知此技术者当知使用某些扩增技术时，引物可能需要修饰，例如：SDA所用的引物，其5’端有额外核苷酸组成的限制内切酶辨识位。同样的，NASBA所使用的引物，其5’端有一段额外的核苷酸组成的RNA聚合酶激活子，因此，多核苷酸的修饰也涵盖在本发明的范畴。

因为熟知此项技术，当选择扩增反应的引物时，必须考虑某些准则，例如：当一对引物用来作扩增反应时，其形成3’双链体的可能性要最小，如此其熔链温度就足以相仿于最佳的复性条件，且将非特异复性的量降到最低。

本文中，根据本发明的多核苷酸是以组合提供扩增反应用的引物，以特异地扩增目标核酸序列。

本发明中扩增的方法通常包括(a)组成一个反应混合物，其包括核酸扩增试剂、至少一组本发明的引物，及疑含有至少一段标地序列的检体。以及(b)将反应混合物置于扩增条件中以产生至少一个副本的核酸序列。

上述方法的步骤(b)可以被重复任何适当的次数(在检测方法步骤(c)之前)，例如：以温度循环反应10到100次，典型的是约20至60次，更典型的是在约25至约45次。

核酸扩增试剂包括已知及可能的试剂，但不局限于有至少聚合酶活性的酶、辅酶因子，例如：镁或锰、盐、NAD及dNTP例如：dATP、dGTP、dCTP及dTTP。

扩增反应的条件通常是促进复性及延伸一段或更多的核酸序列，已知复性反应取决于一些可预期的因子，包括：温度、离子强度、序列长度、互补性及序列的GC含量。例如：降低反应温度可以促进复性，对任何的序列而言，熔链温度Tm可以用很多已知的方法估算。典型地，诊断上应用以低于熔链温度约10℃(例如：2℃到8℃)为杂交温度。离子强度或盐的浓度也会影响熔链温度，因为小阳离子倾向于以消减磷酸二酯骨干的负电荷来稳定双链体的形成。典型的盐类浓度视阳离子的性质及价数而定，但熟知此技术者可很快的了解，同样地，高G∶C含量及增加序列长度也已知会稳定双链体的形成，因为G∶C配对有三个氢键而A∶T配对只有两个，另外，因为较长序列有较多的氢键将序列抓在一起，因此，高G∶C含量及较长的序列长度会因提高熔链温度而影响杂交的条件。

在选择用来作诊断应用的序列时，要知道其G∶C含量及长度以用来决定杂交反应的条件，因为一般离子强度会最适于酶活性，剩下唯一要改变的因子就是温度。一般而言，杂交的温度都选择在靠近引物或探针的熔链温度。因此，要得到一组特殊引物或探针的适合杂交条件，对操作此技术者是普通的技术。

如上所述，使用本发明的多核苷酸所扩增的特异扩增子，可以用很多已知的方法来检测，例如：在一个或多个用在扩增反应的引物作标记，如此，这样的扩增子便可以用常用的技术直接检测。另外，也可以用标记过的探针来检测，而此探针可以是扩增反应中的一段引物，或是异于引物但可和扩增序列互补的其它多核苷酸，而这样的探针可以加到扩增反应后的混和液中，经过适当的杂交及清洗后，标记可用常用的方法检测。

使用上述方法所得的扩增产物，可以在扩增反应时或之后检测，当扩增反应完成后，可以用胶体电泳来检测产物，另外，扩增产物被杂交到探针，然后与反应中的其它成份分离并使用微粒子及标记的探针来检测。

为方便使用，引物及探针用可检测的成分或分子标记。探针用磁性粒子标记就成为磁性探针。正、反向引物可用生物活性物质如生物素标记。扩增的DNA产物可用磁性探针杂交以形成杂体混合物，此杂体混合物可被磁性物质吸引，而可以在磁性架子中轻易的与未结合的DNA产物分离。此杂体混合物可以进一步的用引物标记来定量。例如：如果引物是用生物素标记，加入其底物-亲合素，则可以用光度计来读取发光值。

于本发明之一实施例中，使用一组新颖的引物来同步扩增单一检体中砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病双球菌的DNA片段，用来扩增砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病双球菌DNA片段的引物组包括：5’-CGCGAAGAACCTTACCTGGTTTTGACATG-3’及

5’-GGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTC-3’。此引物组是由砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病双球菌的基因组中的保守区域所设计而来，而此保守区域中是16S rRNA基因，引物是用生物活性物质标记，再较佳实施例中，此物质为生物素。

引物组的设计过程描述如下：选择16S rRNA基因，其已知是基因组中高保守的区域；将16S rRNA基因的核苷酸序列排列以筛选出保守区域；从保守区域中找出目标片段，此片段的两端序列在砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病双球菌中是相同的，而且片段中还含有变异的区域，其中的不同序列用来鉴定C.trachomatis及N.gonorrhoeae；及选择保守区域中目标片段两端的适当长度来设计引物组。引物组中包括正向引物及反向引物，定义正向及反向引物，其中从C.trachomatis来的正向引物序列与从N.gonorrhoeae来的正向引物相同，而从C.trachomatis来的反向引物序列与从N.gonorrhoeae来的反向引物相同。

于本发明之一实施例中，用来鉴定从奈瑟氏淋病双球菌及/或砂眼披衣菌扩增而来的DNA片段的探针，其包括：(a)5’-AATGTCGTTTTCCGCA AGGACATAT-3’对砂眼披衣菌；及(b)5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’对奈瑟氏淋病双球菌。此探针以磁性粒子标记。此探针是从奈瑟氏淋病双球菌及砂眼披衣菌基因组的保守区域中的变异区域所设计而来，其中的不同DNA序列可用来鉴定奈瑟氏淋病双球菌及砂眼披衣菌。其保守区域是在16S rRNA基因中，C.trachomatis的变异区域特异于C.trachomatis，而N.gonorrhoeae的变异区域特异于N.gonorrhoeae。所选的变异区域位于保守区域内，而保守区域的两端用来设计引物，因此，此变异区域可被引物组扩增出来，选择变异区域中的适当序列长度来设计特异的探针。

本发明的具体实施例中，检测奈瑟氏淋病双球菌及砂眼披衣菌的试剂盒包括：(a)用来扩增样品DNA的引物组，其包括5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’及5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’；及(b)用来鉴定扩增的DNA片段的探针，其包括：5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’对奈瑟氏淋病双球菌，及5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’对砂眼披衣菌。此引物组可用来同时扩增砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病双球菌的DNA片段，探针之一是特异于砂眼披衣菌，另一则特异于奈瑟氏淋病双球菌。引物以生物素标记，探针则以磁性颗粒标记成磁性探针。试剂盒中含有一个磁性架，用来分离杂交复合体，另外含有一种酶(例如：生物素)的底物，用来定量此杂交复合体。

利用此试剂盒来诊断砂眼披衣菌及/或奈瑟氏淋病双球菌的过程描述如下：从临床上的病人或任何含有此致病菌的来源取得合适的样本；以生物素标记的引物扩增目标DNA片段；加入特异于砂眼披衣菌(或奈瑟氏淋病双球菌)的磁性探针来杂交特异的目标；使用磁性架来分离杂交复合体及未结合的扩增产物；加入亲合素—辣根过氧化物酶及其底物来确认杂交复合体，再以光度计读取发光值。

本发明提供了一个方便的方法来诊断STDs的致病菌，根据前述方法制备的试剂盒提供了简单且经济的工具来诊断STDs的致病菌，尤其是最常见的C.trachomatis及N.gonorrhoeae。本试剂盒不仅节省检测的时间而且显示出高的特异性及敏感性。最有趣的是，本试剂盒可以检测尿液及平常的临床样本拭子(SWAB)中的致病原。

【附图简述】

图1是描述C.trachomatis和N.gonorrhoeae.之16SrRNA序列的排比结果，其中NG是代表N.gonorrhoeae，CT是代表C.trachomatis。

图2是描述序列排比结果中，其保守区域的放大图，NG是代表N.gonorrhoeae，CT是代表C.trachomatis。底线1：标示用来设计正向引物的序列。底线2：标示用来设计反向引物的序列。黑框部分则标示出用来设计特定探针的序列。

图3是描述N.gonorrhoeae的PCR结果，标示在两条泳道中间的数字(45，50，55，60，65，70)，表示PCR反应中复性的温度，NC是代表负控制组，以0.22μm滤器过滤后的MQ水当PCR的模板。测试组：以N.gonorrhoeae DNA当PCR的模板。

图4A是描述以60℃当复性温度的PCR结果，NC：负控制组，以0.22μm滤器过滤后的MQ超纯水当PCR的模板。NG和CT则分别表示以N.gonorrhoeae和C.trachomatis的DNA当PCR的模板。图4B是描述PCR产物以特定探针杂交的结果，斜纹长条表示以NG特异的探针，而方格长条则表示用CT特异的探针。在PCR反应中，NC是代表负控制组，PC是代表正控制组，分别以NG和CT的DNA当模板。R-b是代表表示以生物素标记的反向引物，F-b是代表表示以生物素标记的正向引物。

图5：描述杂交的特异性，斜纹长条表示用NG特异的探针，而方格长条则是使用CT特异的探针。在杂交的模板中，NC是代表负控制组；NG是代表N.gonorrhoeae的PCR产物，CT是代表C.trachomatis的PCR产物。图A是表示反应时间10分钟。图B是表示反应时间20分钟。

图6A是属是PCR结果，图6B是用特定探针和PCR产物杂交的结果。NC：负控制组；以0.22μm滤器过滤后的MQ超纯水当PCR的模板。TB是代表Mycobacterium tuberculosis，SA是代表Staphylococcus aureus，HI是代表Haemophilusinfluenzae，PS是代表Streptococcus pneumonia，GP是代表Klebsiella pneumonia，KF2是代表Mycobacteriumkansasii，RGM是代表Rapid grower Mycobacterium，MAC是代表Mycobacterium avium，NG是代表N.gonorrhoeae，及CT是代表C.trachomatis。

具体实施方式

实施例一：序列比对及引物探针搜寻

将C.trachomatis及N.gonorrhoeae的16S rRNA基因序列以DNAsis软件分析，来筛选他们的保守区域，根据保守区域来设计引物，而探针则是根据保守区域中的特异序列来设计。

图1为DNA排列的结果，显示C.trachomatis及N.gonorrhoeae间有72.4％的相似性，一个从957bp到1131bp的保守区域被筛选出来，此保守区域的放大图展示于图2。底线1及底线2的两个片段，在C.trachomatis及N.gonorrhoeae中是相同的，因此底线1及底线2的序列分别设计成正向(F)及反向(R)的引物。而有起伏底线的片段是各个致病原的特异性，这些片段则设计成特异探针。

实施例二：临床样本的准备

拭子(SWAB)：将样本拭子放入含有2ml 1x PBS的15ml离心管，激烈震荡一分钟以分离附着物，然后样本拭子以烧过的镊子夹起，并将所有的液体从拭子中挤出来。将15ml离心管以3000rpm离心五分钟，除去上清液后，加入100μl PCR缓冲液、Tween 20(0.45％)、及蛋白酶K，然后混合均匀；再移到1.5ml的微量离心管，置于55℃一小时，然后存放于95℃十分钟以除去蛋白酶K的活性，最后的混合液可以直接作PCR反应或存在-20℃中备用。

尿液：从病人的前段尿液中收集约20~30ml，然后放入50ml的离心管中以12,000rpm离心三十分钟，除去上清液。加入100μl PCR缓冲液、Tween 20(0.45％)、及蛋白酶K，然后混合均匀再移到1.5ml的微量离心管，置于55℃一小时，然后存放于95℃十分钟以除去蛋白酶K的活性，最后的混合液可以直接作PCR反应或存在-20℃中备用。

实施例三：聚合酶链式反应

引物组的序列为：5’-CGCGAAGAACCTTACCTGGTTTTGACATG-3’(F) 及5’-GGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTC-3’(R)，50μl的PCR反应中含有1x PCR缓冲液、1.5mM MgCl₂(GeneTeks BioscienceInc.)、2μM的引物、2mM的dNTP(ProTech)、2U的Taq聚合酶及2μl的模板。其在MyCycler Thermal Cycler(Bio-Rad)的热循环条件为94℃5分钟，30个循环的94℃45秒、60℃30秒、及72℃30秒，最后72℃10分钟的延伸反应。160bp的PCR产物以含有1μg/ml溴化乙锭(ethidium bromide)的2％琼脂糖(agarose gel)电泳分析。

为找出适合的复性温度，测试了N.gonorrhoeae的DNA及六种不同的复性温度，包括：45℃、50℃、55℃、60℃、65℃及70℃等，结果如图3所示，适合此引物组的复性温度是广泛的，为避免污染及非特异性的复制，选择60℃为后续实验的复性温度。

实施例四：杂交及讯号检测

对C.trachomatis的探针序列为5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’，而对N.gonorrhoeae的探针序列则为5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGT-3’，275μl杂交缓冲液，15μl自身结合探针(Seradyn Inc.)及10μl PCR产物一起加入杂交试管(Ht)，以激烈震荡混合均匀，将Ht置于95℃干浴5分钟，再于50℃干浴20分钟，然后移到干浴的磁性槽，将杂交缓冲液吸除。将清洗缓冲液(预热50℃)加到每一根试管，震荡混合后放回磁性管静置3~5分钟，然后吸除清洗缓冲液，前述清洗的步骤重复一次，再将新鲜配制含有1∶4000稀释的SA-HRP(Pierce Biotechnology，Inc.)的阻断缓冲液加入，避光室温静置20分钟。将Ht置于磁性架并把溶液吸除，加入0.5％PBST，震荡混合后放回磁性架，再将溶液吸除，前述步骤重复一次。加入适量体积的1x PBS并震荡混合以将磁性珠悬浮起来，再将底物(Pierce Biotechnology，Inc.)加到每一根试管，以光度计读取发光值。

图4A所展示的是N.gonorrhoeae和C.trachomatis的PCR产物，这两种致病原的DNA扩增产物大约160bp，而且没有其它的条带在电泳凝胶上。图4B所展示的是杂交的结果，其只有在含有目标DNA的样本中出现明显的讯号。

实施例五：两个特异探针间无交叉作用

图4展示出NG特异的探针只会辨识N.gonorrhoeae的PCR产物，而不会识别C.trachomatis的PCR产物。而CT特异的探针只会辨识C.trachomatis的PCR产物，而不会识别N.gonorrhoeae的PCR产物。不管反应时间是10分钟或20分钟，都可检测到明显的讯号。

实施例六：检测系统的特异性

引物组(引物F及R)及两个特异探针(CT探针及NG探针)被用来建立一个检测系统，为分析此试剂盒的特异性，选取八株细菌来作检测，包括Mycobacterium tuberculosis，Staphylococcus aureus，Haemophilus influenzae，Streptococcus pneumoniae，Klebsiella pneumoniae，Mycobacterium kansasii，Rapid grower Mycobacterium及Mycobacterium avium.。这些细菌株的DNA用来当PCR的模板，所得到的产物用这两个特异探针来作杂交，图6(A)展示PCR产物，本系统中的引物组可在这些细菌株中扩增特异的DNA片段，进一步的探针确认结果则展示于图6(B)，CT探针只会和C.trachomatis的PCR产物反应，而NG探针则只和N.gonorrhoeae的PCR产物反应。测试的八株细菌则呈现不明显的杂交结果，因此，杂交的结果证明了本检测系统的特异性。

                       序列表

<110>亚洲基因科技股份有限公司

<120>诊断性传染病致病原的新颖方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>SEQUENCE ID NO 1

<211>29

<212>DNA

<213>人造序列

<220>正向引物

<221>Primer_bind

<400>1

CGCGAAGAAC  CTTACCTGGT TTTGACATG    29

<210>SEQUENCE ID NO 2

<211>27

<212>DNA

<213>人造序列

<220>反向引物

<221>Primer_bind

<400>2

GGCAACTAAT  GACAAGGGTT  GCGCTC    27

<210>SEQUENCE ID NO 3

<211>27

<212>DNA

<213>人造序列

<220>砂眼披衣菌的专一性探针

<221>Primer_bind

<400>3

AATGTCGTTT  TCCGCAAGGA  CATAT    27

<210>SEQUENCE ID NO 4

<211>27

<212>DNA

<213>人造序列

<220>奈瑟氏淋病双球菌的专一性探针

<221>Primer_bind

<400>4

CGGAGGAGTG    CCTTCGGGAG    CCGTA    27

Claims (23)

1.一种鉴定不同性传染病致病原的方法，其包括：

(a)以一组引物同步扩增不同致病菌的DNA片段；

(b)以不同的特异探针和扩增的DNA片段杂交；及

(c)确认杂交的产物。

2.根据权利要求1的方法，其中性传染病的致病原是选自下列群组包括细菌、病毒、真菌、立克次体或披衣菌。

3.根据权利要求1的方法，其中引物组是从不同致病原的基因组的保守区域中所设计出来。

4.根据权利要求3的方法，其中保守区域是选自下列群组包括5Sr RNA基因，16S rRNA基因，23S rRNA基因，5.0S rRNA基因，5.8S rRNA基因，18S rRNA基因，28S rRNA基因，类16S RNA基因，或类23S rRNA基因。

5.根据权利要求1的方法，其中特异的探针是由权利要求3的保守区域中的变异区域所设计出来。

6.一个设计不同性传染病致病原DNA片段引物组的步骤，其包括：

(a)在不同致病原的基因组中选出一个保守区域；

(b)将不同致病原中保守区域的序列排列；

(c)从保守区域内找出一个目标片段，其中该片段的两端序列在不同致病原中是一样的，且此片段中必须含有不同的序列，以用来鉴定不同的致病原；

(d)将目标片段的两端序列选为引物；

(e)定义正向及反向引物，其中正向引物的序列，在不同的致病原间均同为正向的引物，而反向引物的序列，在不同的致病原间均同为反向的引物；及

(f)将目标片段中不同的部分选为该致病原的特异探针。

7.根据权利要求6的步骤，其中步骤(b)的排列，是使用生物信息软件DNAsis。

8.根据权利要求6的步骤，其中性传染病的致病原是选自下列群组包括细菌、病毒、真菌、立克次体或披衣菌。

9.一组引物，用以扩增砂眼披衣菌(Chlamydiatrachomatis)及奈瑟氏淋病双球菌(Neisseria gonorrhoeae)的DNA片段，其包括：5’-CGCGAAGAACCTTACCTGGTTTTGACATG-3’及5’-GGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTC-3’。

10.根据权利要求9的引物组，其是由砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病双球菌的基因组中的保守区域所设计而来。

11.根据权利要求10的引物组，其中该保守区域是由16SrRNA基因而来。

12.根据权利要求9的引物组，该引物是用生物活性物质标记。

13.根据权利要求12的引物组，其中生物活性物质是生物素。

14.一个用来鉴定从砂眼披衣菌及/或奈瑟氏淋病双球菌扩增而来的DNA片段的探针，其由下列序列组成：

(a)5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’对砂眼披衣菌；及

(b)5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’对奈瑟氏淋病双球菌。

15.根据权利要求14的探针，该探针是从砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病双球菌基因组的保守区域中的变异区域所设计而来，其中的不同DNA序列可用来鉴定奈瑟氏淋病双球菌及砂眼披衣菌。

16.根据权利要求15的探针，其中该保守区域是由16SrRNA基因而来。

17.根据权利要求14的探针，其以磁性颗粒标记。

18.一个检测砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病双球菌的试剂盒，其包括：(a)用来扩增样品DNA的引物组，其包括5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’

及5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’；及

(b)用来鉴定扩增的DNA片段的探针，包括：5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’对砂眼披衣菌及5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’对奈瑟氏淋病双球菌。

19.根据权利要求18的试剂盒，其中该引物是用生物活性物质标记。

20.根据权利要求19的试剂盒，其中该生物活性物质是生物素。

21.根据权利要求18的试剂盒，其中该探针是以磁性颗粒标记。

22.根据权利要求18的试剂盒，其另包括一个磁性架。

23.根据权利要求18的试剂盒，其另包括一种酶底物，用以定量杂交复合体。

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