CN115135777A - 用于检测微生物的多重pcr方法及其用途 - Google Patents

用于检测微生物的多重pcr方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115135777A
CN115135777A CN202180014773.3A CN202180014773A CN115135777A CN 115135777 A CN115135777 A CN 115135777A CN 202180014773 A CN202180014773 A CN 202180014773A CN 115135777 A CN115135777 A CN 115135777A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
seq
sequence
primer pair
pair
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180014773.3A
Other languages
English (en)
Inventor
弗兰克·塔伦多
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ocean Dx
Original Assignee
Ocean Dx
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ocean Dx filed Critical Ocean Dx
Publication of CN115135777A publication Critical patent/CN115135777A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种使用引物对(1)和引物对(2)扩增样品中存在的至少两种不同的核酸序列的方法。特别地，所述引物对(2)的第一引物在(5')位置处还包含所述引物对(1)的第一引物的序列，并且所述引物对(2)的第二引物在所述(5')位置处还包含所述引物对(1)的所述第二引物的序列。本发明还涉及能够实施所述方法的试剂盒和检测试剂盒及其用途。

Description

用于检测微生物的多重PCR方法及其用途
技术领域
本发明涉及至少一种感兴趣的核酸的检测和扩增的领域，特别是在感染诊断中。因此，本发明涉及使用扩增第一核酸序列(A)的引物对1和扩增第二核酸序列(B)的至少一个杂交或嵌合引物对2扩增样品中存在的至少两种不同的核酸序列的方法。特别地，第一引物，诸如引物对2的正义引物，在5'处进一步包含引物对1的第一引物的序列，并且引物对2的第二引物在5'处进一步包含引物对1的第一引物或第二引物的序列。本发明还涉及引物、能够实施所述方法的试剂盒及其用途。
背景技术
近年来，感染诊断已经经历了显著的发展，特别是通过使用分子生物学方法，诸如基因组扩增或聚合酶链式反应(PCR)。PCR越来越多地取代常规的血清学和微生物学方法，诸如细菌培养或ELISA试验。PCR具有许多优点；该试验是快速、灵敏和特异性的。尽管仍然是相对昂贵的，并且因此被保留用于困难的分析或用于特定的分析实验室，但是通过PCR诊断的特异性和灵敏度最终将取代起初实施的常规分析。
标准PCR使得可以从特定引物对扩增感兴趣的核酸。在感染诊断的情况下，例如在疑似大肠杆菌(E.Coli)感染的情况下，可以使用允许扩增对大肠杆菌具有特异性的核酸的引物对。当不知道感染的来源时，必须使用对旨在检测的病原体中的每一种具有特异性的引物对。在称为“单纯型”的PCR方法中，使用单个引物对，并且对于旨在被鉴定为对感染负责的病毒、细菌或酵母的数目，PCR反应必须按需要复制多次。在称为“多重”的PCR方法中，在一个单一反应中添加所有引物对，并且同时鉴定寻找的所有病原体。
多重PCR是使得可以从同一生物样品中同时鉴定多个不同核酸序列的PCR。这使得可以在同一个反应中进行多次靶向扩增。因此，多重PCR特别适合于感染诊断。在感染诊断期间，不同的引物对用于在靶生物样品存在下的同一PCR反应期间靶向多种细菌、病毒或酵母。
然而，多重PCR中使用的引物对需要显著优化，以便所有的引物在PCR期间可以在相同的温度下工作，特别是可以防止交叉反应的现象。
作为实例，在社区获得性肺炎的情况下，多重PCR能够在77％的住院患者中发现至少一种病原体，而通过培养则为39％(NJ Gadsby CD Russell MP McHugh《用于社区获得性肺炎中呼吸道病原体综合分子试验(Comprehensive molecular testing forrespiratory pathogens in community-acquired pneumonia.)》《临床感染疾病2016(Clin Infect Dis 2016)》)。在腹泻的情况下，其使得可以在粪便中检测到比传统方法多三倍的病原体(CR Stensvold HV Nielsen《显微镜和PCR检测丹麦患者中肠道寄生虫的比较支持对分子筛选平台的激励(Comparison of microscopy and PCR for detection ofintestinal parasites in Danish patients supports an incentive for molecularscreening platforms.)》《临床微生物学杂志2012(J Clin Microbiol 2012)》)。因此，在不到两个小时的时间里，一个单一文本就可以证明样品中存在多种感染病原。如今，已经向临床医生提出了用于脑膜炎、性传播疾病、呼吸道感染和感染性小肠结肠炎的组。
然而，多重PCR限于检测预定义量的病原体，其中靶向所述病原体的特定基因的至少一个片段的引物对包括在组中。为了扩展检测组，检测试剂盒可以包含非常大量的引物，因此可以检测大量的微生物。因此，越期望增加组中靶向的病原体的数目，就越倾向于增加引物对的数目。按通常的方式，通过引物对检测病原体，其扩增子对所述病原体具有特异性。
然而，在一个单一试验中高浓度的不同引物带来了有害的矛盾效应。因此，引物之间出现竞争现象，导致引物的抑制。此外，由于使用了多种引物，非特异性扩增更有可能。因此，过高的多路复用导致非常差的检测灵敏度。
从I.Afonina等人在2007年的著作(《具有5'瓣的引物改善实时PCR(Primers with5'flaps improve real-time PCR)》)中也可以知道，在5'处添加与引物靶标不互补的序列提高了PCR扩增的有效性。然而，添加这些序列不能解决非特异性扩增或灵敏度损失的问题，这与多重PCR期间通常使用的高浓度引物有关。
本发明的目的是解决该问题并且克服现有技术的缺点，并且特别是防止或限制多重PCR灵敏度的恶化，当引物以太大的量存在于同一试验中时，由于引物之间的竞争现象，多重PCR灵敏度的恶化可能导致靶向核酸的扩增不足或扩增不良，以及抑制或限制与以不期望的方式消耗扩增试剂的非特异性扩增相关的多重PCR的灵敏度的恶化。
发明内容
因此，根据第一方面，本发明涉及使用能够扩增感兴趣的第一核酸序列(A)的引物对1和能够扩增感兴趣的第二核酸序列(B)的至少一个杂交引物对2扩增样品中存在的至少两种不同的感兴趣的核酸序列的方法，所述方法包含以下步骤：
a.使样品与能够扩增第一核酸序列(A)的引物对1和能够扩增第二核酸序列(B)的引物对2接触，
■引物对1由能够扩增对应于第一核酸序列(A)的核酸的第一引物和第二引物形成，
■引物对2由能够扩增对应于第二核酸序列(B)的核酸的第一引物和第二引物形成，
b.添加选择的试剂和允许PCR扩增的条件，以及
c.通过进行基于样品中存在的核酸序列(A)和核酸序列(B)的特异性转录的扩增反应来扩增第一核酸序列和第二核酸序列(A和B)，
其特征在于引物对2的第一引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物的序列，并且引物对2的第二引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第二引物的序列。
根据变体，引物对2的第一引物的序列(称为嵌合或杂交)在5'处进一步包含引物对1的第一引物或第二引物的序列，并且引物对2的第二引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物或第二引物的序列。
引物对2的浓度优选地小于或等于引物对1的浓度，更优选地小于。
根据本发明的方法还可以包含第三引物对3，第四引物对4等，每个包含第一引物和第二引物，该第一引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物或第二引物的序列，并且该第二引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物或第二引物的序列。
根据另一个变体，靶向第一核酸序列(A)的第二引物转而还可以在其5'区域中含有靶向该相同核酸(A)的第一引物的序列。
例如，引物对1、2、3或4的第一寡核苷酸可以是正义引物或反义引物，并且引物对1、2、3或4的第二寡核苷酸可以是反义引物或正义引物。
优选地，根据本发明的方法是多重PCR，并且使得可以进行差异定量扩增，即靶不以相同的方式扩增，导致靶之间相同循环数目产生的量的差异。在说明书的剩余部分中，根据本发明的所述PCR也被称为根据本发明的接力PCR或PCR。
特别地，根据本发明的PCR使得可以检测和鉴定涉及感染性疾病的微生物诸如细菌、病毒、酵母。该疾病可以在受试者诸如动物或人类或植物中检测到。
根据第二方面，本发明还涉及包含特异性引物的引物和试剂盒、能够实施本发明方法的检测试剂盒，以及其用于检测感染性疾病中存在的微生物的用途。
下面将参考附图详细描述本发明。附图仅仅是本发明的一些实施例的说明，而不是限制。
附图说明
图1示出了根据本发明的接力PCR的原理。
图2A示出了标准的双重PCR试验(具有2个靶的多重)，其包含靶向金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的引物对1和靶向大肠杆菌(Escherichia coli)的引物对2。引物对1:引物对2的比例为1:1。黑色：靶向大肠杆菌特定基因的扩增曲线。灰色：靶向金黄色葡萄球菌的特定基因的扩增曲线。
图2B示出了根据本发明的接力PCR试验，其包含靶向金黄色葡萄球菌的引物对1和靶向大肠杆菌的引物对2。引物对1:引物对2的比例为10:1。黑色：靶向大肠杆菌特定基因的扩增曲线。灰色：靶向金黄色葡萄球菌的特定基因的扩增曲线。
图2C示出了根据本发明的接力PCR试验，其包含靶向金黄色葡萄球菌的引物对1和靶向大肠杆菌的引物对2。引物对1:引物对2的比例为1:1。黑色：靶向大肠杆菌特定基因的扩增曲线。灰色：靶向金黄色葡萄球菌的特定基因的扩增曲线。
图3A示出了标准的双重PCR试验，其包含靶向肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的引物对1和靶向金黄色葡萄球菌的引物对2。引物对1:引物对2的比例为1:1。黑色：靶向肺炎克雷伯氏菌的特定基因的扩增曲线。灰色：靶向金黄色葡萄球菌的特定基因的扩增曲线。
图3B示出了根据本发明的接力PCR试验，其包含靶向肺炎克雷伯氏菌的引物对1和靶向金黄色葡萄球菌的引物对2。引物对1:引物对2的比例为10:1。黑色：靶向肺炎克雷伯氏菌的特定基因的扩增曲线。灰色：靶向金黄色葡萄球菌的特定基因的扩增曲线。
图3C示出了根据本发明的接力PCR试验，其包含靶向肺炎克雷伯氏菌的引物对1和靶向金黄色葡萄球菌的引物对2。引物对1:引物对2的比例为1:1。黑色：靶向肺炎克雷伯氏菌的特定基因的扩增曲线。灰色：靶向金黄色葡萄球菌的特定基因的扩增曲线。
图4示出了在标准PCR中使用的能够扩增靶序列例如A的引物对的结构，其包含正义序列FW1的正义引物和序列RT1的反义引物；以及根据本发明的杂交引物或嵌合引物对的结构，其用于能够扩增靶序列例如B的接力PCT中。杂交引物或嵌合引物对包含序列FW1+FW2的正义引物和序列RT1+RT2的反义引物。序列FW2能够与靶序列B的区域杂交，序列FW1对应于引物对1的正义引物的序列，其在混合物中以较高浓度存在，并且所述序列FW1和FW2相邻，从而形成长度在12与140个核苷酸之间的单一正义引物。杂交引物或嵌合引物对还包含序列RT1+RT2的反义引物，序列RT2与靶序列B的区域互补，序列RT1对应于引物对1的反义引物的序列，其以较高浓度存在于混合物中，所述序列FW1和FW2相邻，从而形成长度在12与140个核苷酸之间的单一引物。从第二PCR循环开始，在混合物中以较高浓度存在的引物对1能够在第一循环期间扩增由引物对2生成的扩增子，并且因此还扩增靶序列B。因此，引物对1能够从第二PCR循环扩增靶序列A以及靶序列B。
图5示出了细菌基因16S的序列。所述序列包含：9个对每个物种具有特异性的可变区域，和10个与所述可变区域相邻的物种间保守区域。可变区域编号为V1至V9。根据本领域技术人员的知识，保守区域使得可以定义能够在围绕至少一个感兴趣的可变区域(例如V1至V2)的这些保守区域上杂交的正义引物和反义引物的核苷酸序列。
图6是表示根据标准双重方法(具有2个靶的多重)或根据本发明的双重接力方法的PCR结果的琼脂糖凝胶。在所有条件下，添加100拷贝的肺炎克雷伯氏菌基因组。线1：使用靶向与所述可变区相邻的保守区的高浓度引物(对照PCR)获得基因16S的5'区域的扩增子(覆盖可变区V1至V2的扩增子)。2：使用靶向与所述可变区相邻的保守区的高浓度引物(对照PCR)获得基因16S的中心区域的扩增子(覆盖可变区V4至V6的扩增子)。3：在基因16S的区域5'(V1至V2)和中心区域(V4至V6)的标准多重PCR中的扩增子，分别使用靶向每个可变区的两个引物对，该引物是高浓度的。4：本发明方法的基因16S的2个区域的扩增子在双重接力中，其中第一引物对靶向区域5'(V1至V2)并且第二杂交引物或嵌合引物对包含能够靶向中心区域(V4至V6)的序列，但也包含第一引物对的序列，所述引物分别以高浓度(第一引物对)和低浓度(第二引物对)使用。箭头指示感兴趣的扩增子(在这种情况下是基因16S的区域V1至V2)的扩增或没有扩增。
图7是表示根据标准三重方法(具有3个靶的多重)或根据本发明的方法(三重接力)的PCR结果的琼脂糖凝胶。在所有条件下，添加100拷贝的肺炎克雷伯氏菌基因组。1：使用标准三重PCR获得扩增子，该引物各自为1mM。2：使用三重接力PCR获得扩增子，其中嵌合引物或杂交引物以0.04mM的低浓度使用。三重接力的扩增子V4至V6和V7至V9略大于它们在标准三重中的等同物，由于嵌合引物的长度，其在聚合后尺寸增加。
图8是表示根据多重接力PCR方法的PCR结果的琼脂糖凝胶，该多重接力PCR方法包含一个高浓度单一引物。在所有条件下，添加100拷贝的肺炎克雷伯氏菌基因组。1：借助于双重接力PCR获得的扩增子，其包含靶向基因16S的区域V1至V2的高浓度的引物对1，和靶向基因16S的区域V7至V9的低浓度的杂交引物或嵌合引物对2。2：借助于双重接力PCR获得的扩增子，其包含靶向基因16S的区域V1至V2的引物对1，其由高浓度的正义引物和低浓度的杂交反义引物或嵌合反义引物组成，在5'处包含正义引物序列，和低浓度的靶向基因16S的区域V7至V9的杂交引物或嵌合引物对2。因此，第一对的反义引物，以及第二对的正义引物和反义引物是杂交引物或嵌合引物。只有引物对1的正义引物以高浓度存在。
定义
在本发明的含义内，“患者”意指可以是人类或动物，优选人类或哺乳动物的受试者。受试者优选地为人类患者，无论其年龄或性别如何。还包括新生儿、婴儿和儿童。
在本发明的含义内，“诊断”意指旨在检测和鉴定一种或多种病状的试验，特别是检测和鉴定受试者或植物中的感染性疾病，以能够给予受试者或植物对应于该病状的治疗。
在本发明的含义内，“引物对”或“寡核苷酸对”意指在PCR的背景中使得可以扩增靶序列的两个寡核苷酸。
在本发明的含义内，“引物”或“寡核苷酸”意指一至几十个核苷酸的核酸的短节段。所述引物能够与互补序列杂交。在本发明的上下文中，它们能够与靶序列的片段杂交。靶序列可以是核酸序列(DNA或RNA)。
在本发明的含义内，“序列FW1”意指一至几十个核苷酸的寡核苷酸的序列，特别是能够与感兴趣的序列的互补序列杂交的正义引物的序列。
在本发明的含义内，“序列RT1”意指一至几十个核苷酸的寡核苷酸的序列，特别是能够与感兴趣的序列的互补序列杂交的反义引物的序列。
在本发明的含义内，“能够扩增感兴趣的核酸序列的引物对”意指包含能够借助于PCR扩增特定感兴趣的序列的正义引物和反义引物的引物对。作为实例，感兴趣的核酸序列可以是存在于细菌的基因16S的可变部分中的序列。根据本领域技术人员的一般知识设计所述引物以靶向所述感兴趣的序列。
在本发明的含义内，“扩增”意指在PCR反应期间扩增靶序列，并且因此增加靶序列的拷贝数。根据链的延伸，通过聚合酶的作用，引物与先前变性的互补序列杂交。反应进行多个连续循环，使得可以增加扩增子的拷贝数。
在本发明的含义内，“扩增子”意指对应于在PRC期间扩增并且由所用的两种引物定界的序列的核酸片段。因此扩增子是靶序列的拷贝。
在本发明的含义内，“杂交引物”或“嵌合引物”意指包含能够与靶序列的互补链杂交的核酸序列和在5'处对应于属于另一个引物对的引物的序列，例如另一个引物对的正义引物或反义引物的序列，的核酸序列的引物。在本发明的上下文中，引物对2、3和4由杂交引物或嵌合引物形成。根据本发明的变体，引物对1包含一个“标准”引物和一个杂交引物或嵌合引物。例如，引物对2的第一寡核苷酸包含能够与特定核酸序列(靶B)杂交的序列和在5'处对应于引物对1的第一寡核苷酸的序列的核酸序列，其能够与另一个特定核酸序列(靶A)杂交。
在本发明的含义内，“浓度比率”意指引物对1相对于第二引物对诸如引物对2的浓度比率。例如，1:1的比率对应于第一对和第二对的相同浓度，而10:1的比率对应于第一对的浓度比第二对高10倍。
具体实施方式
因此，本发明涉及一种新的PCR方法，被称为多重PCR。“标准”多重PCR是已知的，其使得可以鉴定非常大量的靶序列。这种类型的标准多重PCR需要存在高浓度的靶向特定核酸的每个引物对。因此，在标准多重PCR中，每个引物对在多重PCR反应期间以相同的高浓度存在。在至少4或5个不同的引物对上，反应条件开始恶化。此外，引物之间竞争现象的出现导致引物的特异性杂交的抑制。此外，所用的多种引物可以导致非特异性扩增。这导致标准多重PCR具有非常差的检测灵敏度。
本发明涉及一种新的多重PCR方法，被称为多重接力PCR(或接力PCR)。在多重接力PCR的情况下，即根据本发明的方法，以高浓度使用一个单一引物对或一个单一引物；所有其它引物的浓度非常低。凭借本发明，可以对所有靶向的核酸保持非常高的灵敏度。
还可以促进某些核酸的扩增超过其它核酸(定量扩增不对称或差异定量扩增)，特别是靶A的核酸超过其它核酸。因此优先扩增的所述核酸将以较大量存在。在诊断中，由于某些核酸比其它核酸提供更多信息的事实，有利于某些核酸具有医学优势。
因此，本发明涉及使用能够扩增感兴趣的第一核酸序列(A)的引物对1和能够扩增感兴趣的第二核酸序列(B)的至少一个引物对2扩增样品中存在的至少两种不同的感兴趣的核酸序列的方法，所述方法包含以下步骤：
a.使样品与能够扩增第一核酸序列(A)的引物对1和能够扩增第二核酸序列(B)的引物对2接触，
i.引物对1由能够扩增对应于第一核酸序列(A)的核酸的第一引物和第二引物形成，
ii.引物对2由能够扩增对应于第二核酸序列(B)的核酸的第一引物和第二引物形成，
b.添加选择的试剂和允许PCR扩增的条件，以及
c.扩增第一核酸序列和第二核酸序列(A和B)，
其特征在于引物对2的第一引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物的序列，并且引物对2的第二引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第二引物的序列。
在步骤c.期间，通过基于样品中存在的核酸序列(A)和核酸序列(B)的聚合(伸长)的扩增反应进行第一核酸序列和第二核酸序列(A和B)的扩增。
根据变体，引物对2的第一引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物或第二引物的序列，并且引物对2的第二引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物或第二引物的序列。
优选地，引物对2的第一引物的序列与引物对1的第一引物或第二引物的序列相邻，并且引物对2的第二引物的序列与引物对1的第一引物或第二引物的序列相邻。根据变体，所述序列不是相邻的，而是借助于尺寸在1至12个核苷酸之间的间隔区(或“接头”)间隔几个核苷酸。
根据另一个变体，根据本发明的方法的特征在于：
-引物对1的第二引物的序列在5'处进一步包含所述引物对1的第一引物的序列，所述序列是相邻的，并且
-引物对2的第一引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物的序列，并且引物对2的第二引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物的序列，所述序列是相邻的。
根据另一个变体，引物对1的第二引物的序列在5'处进一步包含所述引物对1的第一引物的序列，和/或引物对2的第一引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物的序列，并且引物对2的第二引物的序列在5'处进一步包含引物对1的第一引物的序列，所述序列借助于尺寸在3至12个核苷酸之间的间隔区(或“接头”)间隔几个核苷酸。
根据本发明的优选实施例，该方法使用：
-能够扩增靶序列A的至少一个引物对1，其包含：
-与靶序列A的片段互补的序列FW1的正义引物，所述引物的尺寸在6至70个核苷酸之间，以及
-与靶序列A的片段互补的序列RT1的反义引物，所述引物的尺寸在6至70个核苷酸之间，以及
-能够扩增靶序列B的至少一个引物对2，其包含：
-序列FW1或RT1和序列FW2的正义引物，序列FW2与靶序列B的片段互补，所述序列FW1或RT1和FW2相邻以形成尺寸在12至140个核苷酸之间的单一引物，以及
-序列FW1或RT1和序列RT2的反义引物，序列RT2与靶序列B的片段互补，所述序列FW1或RT1和RT2相邻以形成尺寸在12至140个核苷酸之间的单一引物。
因此，本发明还涉及杂交引物或嵌合引物对，其包含：
-序列FW1或RT1和序列FW2的正义引物(或第一寡核苷酸)，序列FW2与靶序列B的片段互补，序列FW1或RT1分别对应于在混合物中以较高浓度存在的引物对1的正义引物或反义引物的序列，所述序列FW1或RT1和FW2相邻以形成长度在12至140个核苷酸之间的单一正义引物，以及
-序列FW1或RT1和序列RT2的反义引物(或第二寡核苷酸)，序列RT2与靶序列B的片段互补，序列RT1或FW1分别对应于在混合物中以相同或较高浓度存在的引物对1的反义引物或正义引物的序列，所述序列FW1或RT1和FW2相邻以形成长度在12至140个核苷酸之间的单一正义引物。
根据变体，本发明还涉及杂交引物或嵌合引物对，其包含：
-序列FW1或RT1的正义引物或反义引物(或第一寡核苷酸)，序列FW1或RT1与在混合物中以较高浓度存在的靶序列A的片段互补，所述序列的长度在6至70个核苷酸之间，以及
-序列FW1和序列RT1的杂交或嵌合正义引物或反义引物(或第二寡核苷酸)，或序列RT1和序列FW1的杂交或嵌合正义引物或反义引物(或第二寡核苷酸)，与序列FW1或RT1的第一寡核苷酸相比，所述引物以较低浓度存在于混合物中，所述序列FW1和RT1或RT1和FW1相邻以形成长度在12至140个核苷酸之间的单一引物。
在双重接力PCR期间，根据本发明，PCR反应发生在混合物中，该混合物包含能够杂交和扩增第一核酸序列(A)的引物对1和能够杂交和扩增第二核酸序列(B)的引物对2，如标准双重PCR的情况。然而，双重接力PCR与标准双重PCR的不同之处在于第二引物对使用杂交引物或嵌合引物，并且任选地第一引物对的正义引物或反义引物。
因此，从第二PCR循环开始，引物对1也能够扩增由引物对2生成的扩增子，并且因此扩增靶序列B。
双重接力PCR具体包含使样品与包含能够扩增核酸序列(A)的引物对1和能够扩增第二核酸序列(B)的引物对2的反应混合物接触。
引物对1由第一正义引物(例如序列FW1)和第二反义引物(例如序列RT1)组成，它们各自能够与核酸(A)的链中的一条的互补序列杂交，并且扩增对应于两个引物之间的链的互补序列的序列。所述互补序列是靶序列(A)。
引物对2由第一正义引物(例如序列FW1-FW2)和第二反义引物(例如序列RT1-RT2)组成，它们各自能够与核酸(B)的链中的一条的互补序列杂交，并且扩增对应于两个引物之间的链的互补序列的序列。所述互补序列是靶序列(B)。
此外，反应混合物包含进行PCR扩增所必需的所有试剂和条件。所述试剂可以最初存在于反应混合物中，或在样品接触后添加。所需试剂具体包括dNTP和聚合酶，本领域技术人员能够根据PCR和反应条件进行选择。聚合酶优选地为水生嗜热菌(Thermophilusaquaticus)的聚合酶，或所述聚合酶的“克列诺(Klenow)”片段。
一旦所有成分都存在于反应混合物中，就可以开始扩增。
PCR反应的各个步骤是本领域技术人员已知的。PCR循环包含变性步骤，其旨在分离双链以获得两条单链，随后是杂交步骤。在该步骤期间，引物将识别存在于单链中的一条上的、先前变性的互补序列，并且然后杂交。这随后是伸长步骤，其使得聚合酶可以合成与单链互补的链。所述链由反应混合物中存在的游离dNTP合成。该步骤的持续时间取决于待扩增序列的长度。
PCR反应继续进行第二循环、第三循环等，每个循环包含相同的步骤。因此，在PCR结束时，实现了引物之间含有的序列的扩增。所述序列对应于扩增子。
因此，第一核酸序列和第二核酸序列的扩增基于样品中存在的靶核酸序列(A)和靶核酸序列(B)的扩增，优选样品中存在的靶核酸序列(A)和靶核酸序列(B)的同时扩增。
根据本发明的方法的特征在于，引物对2的第一引物在5'处进一步包含引物对1的第一引物的序列，并且引物对2的第二引物在5'处进一步包含引物对1的第二引物的序列。对2的第一引物的序列和对1的第一引物的序列相邻，并且对2的第二引物的序列和对1的第二引物的序列也相邻。
根据变体，引物对2的第二引物在5'处进一步包含引物对1的第一引物或第二引物的序列。对2的第一引物的序列和对1的第一引物的序列相邻，并且对2的第一引物或第二引物的序列和对1的第二引物的序列也相邻。
优选地，引物对2的第一引物包含能够与待扩增序列，诸如靶序列(B)，的互补序列杂交的核酸序列，并且此外，在5'处，包含引物对1的第一引物或第二引物的序列，并且引物对2的第二引物包含能够与待扩增序列，诸如靶序列(B)，的互补序列杂交的核酸序列，并且此外，在5'处，包含引物对1的第一引物或第二引物的序列。能够与待扩增的互补序列诸如靶序列(B)杂交的核酸序列对于引物1和引物2是不同的。特别地，引物1可以是正义引物，并且引物2可以是反义引物。
优选地，从第二PCR循环开始，第一引物对能够扩增第一序列(A)和第二序列(B)。实际上，在第一PCR循环期间，第一引物对能够扩增第一序列(A)，并且第二引物对能够扩增第二序列(B)。在第一PCR循环结束时，生成包含第一对的第一引物的序列和序列(A)的互补序列的核酸序列、包含第一对的第二引物的序列和序列(A)的互补序列的核酸序列、包含第二对的第一引物的序列和序列(B)的互补序列的核酸序列，和包含第二对第二引物的序列和序列(B)的互补序列的核酸序列。
实际上，第二对的第一引物包含第一对的第一引物的序列和能够与序列(B)杂交的序列，并且第二对的第二引物包含第一对的第二引物的序列和能够与序列(B)杂交的序列。因此，在第二循环期间，引物对1能够扩增在第一循环期间生成的核酸序列(图1)。
根据一个实施例，第一对的第一引物的序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQID NO:5，第一对的第二引物的序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6，第二对的第一引物的序列选自SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9，第二对的第二引物的序列选自SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:10。所述序列列于下表1中。
[表1A]
Figure BDA0003797688520000111
为了诊断目的，感兴趣的是靶向所有细菌中存在的基因16S的可变区域。
基因16S包含保守区域和可变区域，特别是9个可变区域和10个保守区域(参考图5)。可变区域编号为V1至V9，并且全部被保守区域包围。基于其常识，本领域技术人员完全能够确定基因16S上的所述区域。Tremblay等人2015《微生物学前沿(Frontiers inMicrobiology)》描述了例如用于扩增和测序所述区域以鉴定样品中存在的细菌的那些众多方法中的一种。
因此，根据优选实施例，感兴趣的序列对应于单一基因或至少两个独立基因的可变序列，更优选地，感兴趣的序列对应于基因16S的可变序列，并且所述引物能够与基因16S的保守序列的至少十二个核苷酸杂交。优选地，正义引物可以与基因16S的保守序列的至少十二个核苷酸在所述基因16S的可变序列的位置5'处杂交，并且反义引物可以与基因16S的保守序列的至少十二个核苷酸在所述基因16S的可变序列的位置3'处杂交。
在本发明的上下文中，发明人已经设计了引物，其使得可以在与感兴趣的可变区域相邻的保守区域上特异性杂交，诸如V1至V2、V3、V4至V6和V7至V9。因此，生成的扩增子对应于可变区域V1至V2或V3或V4至V6或V7至V9的序列，其序列对一种病原体具有特异性。
根据优选实施例，第一对的第一引物(正义引物)的序列选自SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:24；第一对的第二引物(反义引物)的序列选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
优选地，第一对SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的第一引物(正义引物)的序列和第一对的第二引物(反义引物)的序列选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27。
第二对的第一引物(正义引物)的序列选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:S4或SEQ ID NO:35；第二对的第二引物的序列选自SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38。所述序列列于下表1B中。
[表1B]
Figure BDA0003797688520000131
靶向基因16S的可变区域V1至V2的第一引物对优选地由以下组成：
-与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
-与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有至少70％序列同源性的反义引物。
靶向基因16S的可变区域V4至V6的第二杂交引物或嵌合引物对优选地由以下组成：
-与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
-与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33具有至少70％序列同源性的反义引物。
靶向基因16S的可变区域V7至V9的第二引物对或第三引物对优选地由以下组成：
-与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
-与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38具有至少70％序列同源性的反义引物。
优选地，70％的序列同源性特别地涉及所述序列的位置3'处的前10个核苷酸。
更优选地，靶向基因16S的可变区域V1至V2的第一引物对由以下组成：
-SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的正义引物，以及
-反义引物SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27。
靶向基因16S的可变区域V4至V6的第二杂交引物或嵌合引物对优选地由以下组成：
-SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的正义引物，以及
-反义引物SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33。
靶向基因16S的可变区域V7至V9的第二引物对或第三引物对优选地由以下组成：
-SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的正义引物，以及
-反义引物SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38。
在根据本发明的方法期间，引物对2的浓度可以小于、大于或等于引物对1的浓度。因此，一个引物对与另一个引物对的相比可以提升或不提升，并且因此扩增一个感兴趣的序列。
根据本发明的特别优选实施例，引物对2的浓度小于或等于引物对1的浓度，更优选地小于。当引物对2的浓度小于引物对1的浓度时，引物对2相对于第一对是不利的。因此由引物对1生成的扩增子将以更大的量存在。当然后进行测序时，靶A的扩增子将被过度表达，并且因此将优先测序。因此将更快地获得其序列。
根据本发明的方法使得可以通过引物对1生成比引物对2生成的扩增子多至少4倍的量的扩增子。因此，由第二对生成的扩增子将以较小的量存在，并且在测序期间将较不那么快速地消除。
引物对1和引物对2之间的浓度比率优选地在1:1至1000:1之间，甚至更优选在1:1至100:1之间。根据特别有利的实施例，引物对1和引物对2之间的浓度比率为10:1，更优选地在25:1之间。这种比率可以例如对应于1mM的引物对1的浓度和0.1mM或0.04mM的引物对2的浓度。
根据另一个实施例，根据本发明的方法还可以包含使样品与能够扩增第三核酸序列(C)的第三引物对接触。引物对3的第一引物包含能够与互补序列(C)杂交的核酸序列，并且此外，在5'处，包含对应于引物对1的第一引物或第二引物的序列的序列。引物对3的第二引物包含能够与互补序列(C)杂交的核酸序列，并且此外，在5'处，包含对应于引物对1的第一引物或第二引物的序列的序列。
根据本发明的方法因此包含3对不同的引物，其使得可以扩增3个不同的靶核酸序列，特别是序列A、序列B和序列C。所述方法是被称为三重接力的PCR。
序列B和C优选地通过杂交或嵌合正义和反义引物扩增，每个引物包含以较高浓度存在的引物对1的正义引物序列，和以较高浓度存在的引物对1的正义引物或反义引物序列。
因此，根据本发明的方法使用：
-能够扩增靶序列A的至少一个引物对1，其包含：
■与靶序列A的片段互补的序列FW1的正义引物，所述引物的尺寸在6至70个核苷酸之间，以及
■与靶序列A的片段互补的序列RT1的反义引物，所述引物的尺寸在6至70个核苷酸之间，以及
-能够扩增靶序列B的至少一个杂交引物或嵌合引物对2，其包含：
■序列FW1或RT1和序列FW2的正义引物，序列FW2与靶序列B的片段互补，所述序列FW1或RT1和FW2相邻以形成尺寸在12至140个核苷酸之间的单一引物，以及
■序列FW1或RT1和序列RT2的反义引物，序列RT2与靶序列B的片段互补，所述序列FW1或RT1和RT2相邻以形成尺寸在12至140个核苷酸之间的单一引物，以及
-能够扩增靶序列C的至少一个引物对3，其包含：
■序列FW1和序列FW3的正义引物，序列FW3与靶序列C的片段互补，所述序列FW1和FW3相邻以形成尺寸在12至140个核苷酸之间的单一引物，以及
■序列FW1或RT1和序列RT3的反义引物，序列RT3与靶序列C的片段互补，所述序列FW1或RT1和RT3相邻以形成尺寸在12至140个核苷酸之间的单一引物。
在该方法期间，引物对3的浓度小于或大于或等于引物对1的浓度，和/或引物对2的浓度小于或大于或等于引物对1的浓度。因此，一个引物对与另一个引物对相比可以提升或不提升。优选地，引物对3的浓度小于引物对1的浓度，和/或引物对2的浓度小于引物对1的浓度。
优选地，引物对1的浓度大于第二引物对和/或第三引物对的浓度，并且引物对2的浓度等于引物对3的浓度。
根据一个实施例，引物对1的浓度大于第二引物对和第三引物对的浓度，并且引物对2的浓度大于引物对3的浓度。因此，第一对与第二对相比被提升，并且第二对与第三对相比也被提升。
根据另一个实施例，根据本发明的方法还可以包含使样品与能够扩增第四核酸序列(D)的被称为杂交或嵌合的第四引物对接触。引物对4的第一引物包含能够与互补序列(D)杂交的核酸序列，并且此外，在5'处，包含对应于引物对1的第一引物或第二引物的序列的序列。引物对4的第二引物包含能够与互补序列(D)杂交的核酸序列，并且此外，在5'处，包含对应于引物对1的第一引物或第二引物的序列的序列。
优选地，第四引物对的浓度小于或等于引物对1的浓度，并且第二对、第三对和第四对的浓度相同。
根据另一个实施例，根据本发明的方法还可以包含使样品与能够扩增第n个核酸序列的第n引物对接触。引物对n的第一引物包含能够与靶互补序列杂交的核酸序列，并且此外，在5'处，包含对应于引物对1的第一引物或第二引物的序列的序列。引物对n的第二引物包含能够与靶互补序列杂交的核酸序列，并且此外，在5'处，包含对应于引物对1的第一引物或第二引物的序列的序列。
优选地，第n引物对的浓度小于或等于引物对1的浓度，并且第二对、第三对、第四对和第n对的浓度相同。
在本发明的含义内，“n”意指自然数，其是正数，使得可以枚举对象，将每个对象计数为1。因此，作为单一后继者的整数，即立即大于它的整数，以及自然数的列表是无限的。
此外，使得可以实施根据本发明的方法的反应介质可以包含耦合到荧光团的一种或多种特异性探针，该荧光团的发射光谱与其它的不同。因此，通过所述特异性探针实时测量PCR反应的每个产物。
因此，根据一个实施例，根据本发明的方法还包含通过使用耦合到荧光团的探针，优选“TaqMan”探针对扩增子进行定量的步骤。
根据本发明的这种探针列于下表2中。
[表2]
探针1(EC) CGCGTCCGATCACCTGCGTC SEQ ID No:11
探针2(KP) GTTGAGGTCAACAGTGCTGCGG SEQ ID No:12
探针3(SA) TCGCGACATTCATTATGCCA SEQ ID No:13
根据另一个实施例，根据本发明的方法包含通过荧光探针、荧光标记、解链曲线、巢式PCR、定量PCR、反转录PCR或通过DNA测序来检测扩增子并且因此检测微生物的步骤。
当扩增子的检测通过测序进行时，该方法进一步包含对扩增的核酸或扩增子进行测序的步骤。
根据特别优选实施例，根据本发明的方法使得可以检测和鉴定涉及至少一种感染性疾病的微生物(细菌、酵母、病毒等)，优选细菌。
根据本发明的方法还可以用于诊断肿瘤学中，以及一般地，分子生物学中的遗传疾病。
根据另一个方面，本发明涉及包含引物对1和引物对2的试剂盒，该引物对1包含SEQ ID No:1和SEQ ID No:2，或SEQ ID No:3和SEQ ID No:4，或SEQ ID No:5和SEQ ID No:6，该引物对2包含SEQ ID No:7和SEQ ID No:8，或SEQ ID No:9和SEQ ID No:10。
根据优选实施例，本发明涉及试剂盒，其包含：
-靶向基因16S的可变区域V1至V2的引物对1，其由以下组成：
■与SEQ ID No:14或SEQ ID No:15具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
■与SEQ ID No:16或SEQ ID No:17或SEQ ID No:26或SEQ ID No:27具有至少70％序列同源性的反义引物，
-靶向基因16S的可变区域V4至V6的引物对2，其由以下组成：
■与SEQ ID No:28或SEQ ID No:29或SEQ ID No:30具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
■与SEQ ID No:31或SEQ ID No:32或SEQ ID No:33具有至少70％序列同源性的反义引物。
根据另一个优选实施例，本发明涉及试剂盒，其包含：
-靶向基因16S的可变区域V1至V2的引物对1，其由以下组成：
■与SEQ ID No:14或SEQ ID No:15具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
■与SEQ ID No:16或SEQ ID No:17或SEQ ID No:26或SEQ ID No:27具有至少70％序列同源性的反义引物，
-靶向基因16S的可变区域V7至V9的引物对2，其由以下组成：
■与SEQ ID No:34或SEQ ID No:35具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
■与SEQ ID No:36或SEQ ID No:37或SEQ ID No:38具有至少70％序列同源性的反义引物。
根据另一个实施例，本发明涉及试剂盒，其包含：
-靶向基因16S的可变区域V1至V2的引物对1，其由以下组成：
■与SEQ ID No:14或SEQ ID No:15具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
■与SEQ ID No:16或SEQ ID No:17或SEQ ID No:26或SEQ ID No:27具有至少70％序列同源性的反义引物，
-靶向基因16S的可变区域V4至V6的引物对2，其由以下组成：
■与SEQ ID No:28或SEQ ID No:29或SEQ ID No:30具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
■与SEQ ID No:31或SEQ ID No:32或SEQ ID No:33具有至少70％序列同源性的反义引物，
-靶向基因16S的可变区域V7至V9的引物对3，其由以下组成：
■与SEQ ID No:34或SEQ ID No:35具有至少70％序列同源性的正义引物，以及
■与SEQ ID No:36或SEQ ID No:37或SEQ ID No:38具有至少70％序列同源性的反义引物。
根据以上任一实施例的试剂盒优选包含引物，该引物的序列同源性为70％，特别是与所述序列位置3'处的前10个核苷酸相关。
根据特别优选实施例，本发明涉及试剂盒，其包含：
-靶向基因16S的可变区域V1至V2的引物对1，其由以下组成：
■SEQ ID No:14或SEQ ID No:15的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:16或SEQ ID No:17或SEQ ID No:26或SEQ ID No:27，
-靶向基因16S的可变区域V4至V6的引物对2，其由以下组成：
■SEQ ID No:28或SEQ ID No:29或SEQ ID No:30的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:31或SEQ ID No:32或SEQ ID No:33，
根据特别优选实施例，本发明涉及试剂盒，其包含：
-靶向基因16S的可变区域V1至V2的引物对1，其由以下组成：
■SEQ ID No:14或SEQ ID No:15的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:16或SEQ ID No:17或SEQ ID No:26或SEQ ID No:27，
-靶向基因16S的可变区域V7至V9的引物对2，其由以下组成：
■SEQ ID No:34或SEQ ID No:35的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:36或SEQ ID No:37或SEQ ID No:38。
根据另一个特别优选实施例，本发明涉及试剂盒，其包含：
-靶向基因16S的可变区域V1至V2的引物对1，其由以下组成：
■SEQ ID No:14或SEQ ID No:15的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:16或SEQ ID No:17或SEQ ID No:26或SEQ ID No:27，
-靶向基因16S的可变区域V4至V6的引物对2，其由以下组成：
■SEQ ID No:28或SEQ ID No:29或SEQ ID No:30的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:31或SEQ ID No:32或SEQ ID No:33，
-靶向基因16S的可变区域V7至V9的引物对3，其由以下组成：
■SEQ ID No:34或SEQ ID No:35的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:36或SEQ ID No:37或SEQ ID No:38。
根据本发明的试剂盒优选地能够实施根据本发明的方法。
本发明还涉及根据本发明的试剂盒用于检测在感染性疾病情况下存在的微生物，诸如细菌、病毒或酵母，的用途。本发明优选地涉及试剂盒用于诊断受试者或植物中的感染性疾病的用途。
本发明还涉及根据本发明的试剂盒用于检测至少一种遗传疾病或至少一种癌症的用途。
实例
根据本发明的用于扩增金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的特定基因的两个序列的方 法的实例1(图2A/2B/2C)
材料和方法
按照以下方式进行接力PCR反应：0.2mM的dNTP、4mM的MgCl2、0.05单位的FastStart聚合酶(罗氏制药(Roche))和根据供应商条件的缓冲液。引物对1的TaqMan探针为0.25mM，而引物对2的TaqMan探针为0.1mM。引物对被设定为不同浓度：标准双重为1mM、双重接力中的引物对1为1mM以及双重接力中的引物对2为0.1mM或1mM。循环如下：在95℃下变性10分钟，然后在95℃下15秒/55℃下15秒/68℃下15秒进行55次循环。将大约100当量的试验细菌中的每一种的基因组拷贝添加到混合物中，以进行扩增。
结果
两个感兴趣的序列的扩增通过标准双重PCR、通过根据本发明的具有引物对1:引物对2的比率为10:1的接力PCR，以及通过根据本发明的具有引物对1:引物对2的比率为1:1的接力PCR进行。
在标准双重PCR的情况下，以高浓度使用两个引物对。使得可以扩增金黄色葡萄球菌基因特异性序列的引物对由序列SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的引物形成，并且使得可以扩增大肠杆菌的对由序列SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的引物组成。结果列于图2A和表3中。因此，本发明人已经观察到Cq(启动荧光信号检测的循环数)的叠加，这意味着在PCR混合物中确实添加了相同量的细菌基因组。此外，生成了同样多量的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的扩增子。
在具有比率为10:1的双重接力PCR期间，引物对1由序列SEQ ID No:2和SEQ IDNo:3的引物形成，并且引物对2由序列SEQ ID No:7和SEQ ID No:8的引物组成。第一引物对使得可以扩增金黄色葡萄球菌基因的特异性序列，并且第二杂交引物或嵌合引物对使得可以扩增大肠杆菌基因的特异性序列。结果列于图2B和表3中。本发明人因此观察到在金黄色葡萄球菌与大肠杆菌扩增子之间的曲线的Cq偏移。对于10:1的引物比率，由双重接力PCR引起的这种延迟是2.09个循环(35.27至33.18)，即因子大约为4(2^1.99)。与金黄色葡萄球菌的扩增子相比，它导致与基因大肠杆菌相关的扩增子的差异量大约少4倍。
在具有比率1:1的接力PCR期间，使用的引物对与接力PCR中使用的引物对相同(比率为10:1)。结果列于图2C和表3中。发明人还观察到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌扩增子之间曲线的Cq偏移。由双重接力PCR引起的这种延迟是1.79个循环(35.68至33.89)，即因子大约为3.5(2^1.79)。对于类似的因子，这里也观察到不同量的扩增子。
[表3]
Figure BDA0003797688520000211
M.Cq＝Cq的平均值。
SD.Cq＝Cq的标准偏差。
SA：金黄色葡萄球菌的值
EC：大肠杆菌的值。
根据本发明用于扩增肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌的特定基因的两个序列 的方法的实例2(图3A/3B/3C)
材料和方法与实例1中所描述的相同。
结果
两个感兴趣的序列的扩增通过标准双重PCR、通过根据本发明的具有引物对1:引物对2的比率为10:1的双重接力PCR，以及通过根据本发明的具有引物对1:引物对2的比率为1:1的双重接力PCR进行。
在标准双重PCR的情况下，以高浓度使用两个引物对。使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌基因特异性序列的引物对由序列SEQ ID No:5和SEQ ID No:6的引物组成，并且使得可以扩增金黄色葡萄球菌的对由序列SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的引物组成。结果列于图3A和表4中。因此，本发明人已经观察到Cq(启动荧光信号检测的循环数)的叠加，这意味着在PCR混合物中确实添加了相同量的细菌基因组。此外，生成了同样多量的肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌的扩增子。
在具有比率为10:1的接力PCR期间，引物对1由序列SEQ ID No:5和SEQ ID No:6的引物形成，并且引物对2由序列SEQ ID No:9和SEQ ID No:10的引物组成。第一引物对使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌基因的特异性序列，并且第二嵌合引物对使得可以扩增金黄色葡萄球菌基因的特异性序列。结果列于图3B和表4中。本发明人因此观察到肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌扩增子之间曲线的Cq偏移。对于10:1的引物比率，由双重接力PCR引起的这种延迟是1.99个循环(35.35至33.36)，即因子大约为4(2^1.99)。与肺炎克雷伯氏菌的扩增子相比，它导致与金黄色葡萄球菌相关的扩增子的差异量大约少4倍。
在具有比率1:1的接力PCR期间，使用的引物对与接力PCR中使用的引物对相同(比率为10:1)。结果列于图3C和表4中。本发明人还观察到肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌扩增子之间曲线的Cq偏移。由双重接力PCR引起的延迟是2.59个循环(36.43至33.84)，即因子大约为6(2^2.59)。与肺炎克雷伯氏菌的扩增子相比，它导致与金黄色葡萄球菌相关的扩增子的差异量大约少6倍。
[表4]
Figure BDA0003797688520000221
M.Cq＝Cq的平均值。
SD.Cq＝Cq的标准偏差。
KP：肺炎克雷伯氏菌的值
SA：金黄色葡萄球菌的值
根据本发明的方法与用于扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的两个序列的标准多重 PCR进行比较的实例3(图6)
材料和方法
按照以下方式进行接力PCR反应：0.2mM的dNTP、4mM的MgCl2、0.05单位的FastStart聚合酶(罗氏制药)和根据供应商条件的缓冲液。引物对被设定为不同的浓度：标准单纯型为1mM，标准双重为1mM、双重接力中的引物对1为1mM以及双重接力中的引物对2为0.04mM。循环如下：在95℃下变性10分钟，然后在95℃下15秒/55℃下15秒/68℃下30秒进行65次循环。将大约100当量的肺炎克雷伯氏菌基因组拷贝添加到混合物中，以进行扩增。
结果
通过标准双重PCR(图6，线3)，和根据本发明的具有引物对1:引物对2的比率为25:1的双重接力PCR(图6，线4)对两个感兴趣的序列进行扩增。
线1表示基因16S的区域5'的扩增子(覆盖可变区V1至V2)(对照PCR)。
线2表示基因16S的中心区域的扩增子(覆盖可变区V4至V6)(对照PCR)。
线3表示基因16S的V1至V2和V4至V6区域的标准多重PCR中的扩增子。
线4表示使用根据本发明的方法(多重接力PCR)的基因16S的V1至V2和V4至V6区域的扩增子。
在标准双重PCR的情况下，以高浓度使用两个引物对(线3)。使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的序列V1V2的引物对由序列SEQ ID No:14和SEQ ID No:16的引物组成，并且使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的序列V4至V6的对由序列SEQ ID No:20和SEQ ID No:23的引物组成。结果列于图6中。本发明人已经观察到(线3和左手箭头)不存在基因16S的区域V1至V2的扩增子，表明多重PCR的标准条件与基因16S的2个区域的同时扩增不相容。
在具有比率为25:1的接力PCR期间，引物对1由序列SEQ ID No:14和SEQ ID No:16的引物形成，并且引物对2由序列SEQ ID No:28和SEQ ID No:33的引物组成。第一引物对使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的区域V1至V2，并且第二嵌合对引物使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的区域V4至V6。结果列于图6中。本发明人因此观察到，接力PCR的条件使得可以同时共扩增基因16S的2个区域(线4)，并且区域V1至V2的扩增子以比中心区域的扩增子更大的量存在(扩增子V1至V2的信号更强烈，即使其尺寸更小)。
因此，与标准多重PCR相反，根据本发明的方法使得可以共扩增两个靶向区域。因此，根据本发明的嵌合引物的特定结构使得可以克服现有技术的问题，特别是多重PCR的问题。
根据本发明的方法与用于扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的三个序列的标准多重 PCR进行比较的实例4(图7)
材料和方法
按照以下方式进行接力PCR反应：0.2mM的dNTP、4mM的MgCl2、0.05单位的FastStart聚合酶(罗氏制药)和根据供应商条件的缓冲液。引物对被设定为不同浓度：标准三重为1mM、三重接力中的引物对1为1mM、三重接力中的引物对2和引物对3为0.04mM。循环如下：在95℃下变性10分钟，然后在95℃下15秒/55℃下15秒/68℃下18秒进行65次循环。将大约100当量的肺炎克雷伯氏菌基因组拷贝添加到混合物中，以进行扩增。
结果
在标准三重PCR的情况下，以高浓度使用三个引物对(线1)。使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的特异性序列(V1至V2)的引物对由序列SEQ ID No:14和SEQ ID No:16的引物形成，使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的特异性序列(V4至V6)的对由序列SEQ ID No:20和SEQ ID No:23的引物组成，并且使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的特异性序列(V7至V9)的对由序列SEQ ID No:24和SEQ ID No:25的引物组成。
在三重接力PCR(线2)的情况下，使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的特异性序列(V1V2)的引物对由序列SEQ ID No:14和SEQ ID No:16的引物形成，使得可以肺炎扩增克雷伯氏菌的基因16S的特异性序列(V4至V6)的对由序列SEQ ID No:28和SEQ ID No:33的引物组成，并且使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的特异性序列(V7至V9)的对由序列SEQ ID No:34和SEQ ID No:36的引物组成。靶向区域V1至V2的对的引物以高浓度设定，而其它对的杂交引物或嵌合引物以低浓度设定。结果列于图7中。
本发明人观察到靶向区域被标准Triplex扩增得很差，特别是肺炎克雷伯氏菌的基因16S的可变区域V1和V2。相反，三重接力能够扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的3个区域，即区域V1至V2(343bp)、区域V7至V9(在标准双重PCR中413bp、在双重接力PCR中447bp)，和区域V4至V6(在标准双重PCR中509bp、在双重接力PCR中543bp)。
因此，根据本发明的方法使得可以共扩增三个靶向区域。
根据本发明的方法的实例5，具有包含一个高浓度的引物和一个低浓度的杂交引 物或嵌合引物的引物对1(图8)。
材料和方法
按照以下方式进行两个接力PCR反应：0.2mM的dNTP、4mM的MgCl2、0.05单位的FastStart聚合酶(罗氏制药)和根据供应商条件的缓冲液。在双重接力的第一条件下，引物被设定为不同的浓度：对1的两个引物为1mM以及引物对2为0.04mM。在双重接力的第二条件下，引物被设定为不同的浓度：对1的第一标准引物为1mM、对1的第二嵌合引物为0.04mM，以及对2的嵌合引物为0.04mM。循环如下：在95℃下变性10分钟，然后在95℃下15秒/55℃下15秒/68℃下45秒进行55次循环。将大约100当量的肺炎克雷伯氏菌基因组拷贝添加到混合物中，以进行扩增。
结果
在第一双重接力PCR(线1)情况下，使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的序列V1至V2的引物对由高浓度的序列SEQ ID No:14和SEQ ID No:16的引物形成，使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的区域V7至V9的对由低浓度的序列SEQ ID No:34和SEQ IDNo:36的嵌合引物组成。
在第二双重接力PCR(线2)情况下，对1的一个单一引物以高浓度设定，SEQ ID No:14，另一个引物是以低浓度设定的杂交引物，SEQ ID No:26。使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的区域V1V2的引物对由序列SEQ ID No:14和SEQ ID No:26的引物形成，使得可以扩增肺炎克雷伯氏菌的基因16S的区域V7至V9的对由序列SEQ ID No:34和SEQ ID No:37的引物组成。结果列于图8中。
本发明人已经观察到，在两种条件下，对应于区域V1至V2(第一双重接力PCR(线1)为343bp并且第二双重接力PCR(线2)为349pb)和V7至V9(第一双重接力PCR(线1)为447bp并且第二双重接力PCR(线2)为453pb的扩增子被成功扩增。然而，注意到使用高浓度的对1的单一引物的事实似乎甚至进一步促进了根据本发明的接力PCR。此外，扩增子V1至V2的条带的亮度与条带V7至V9的相同表明扩增子V1至V2的量远大于扩增子V7至V9的量，扩增子V1至V2较小。因此，本发明方法的这种变化保持了使用高浓度引物的区域的有利扩增。
序列表
<110> 海洋DX公司（OCEAN DX）
<120> 用于检测微生物的多重PCR方法及其用途
<130> PPI22171389US
<160> 38
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一对
<400> 1
cggaagcaac gcgtaaactc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一对
<400> 2
tgagcgtcgc agaacattac a 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一对
<400> 3
tcgaaattaa atgttgtcgt gtcttc 26
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一对
<400> 4
caatattttc atttttgaca tggagagaaa catc 34
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一对
<400> 5
gacgggatat ctgaccagtc gg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一对
<400> 6
ccgggttttg cgtaatgatc tg 22
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二对
<400> 7
tcgaaattaa atgttgtcgt gtcttccgga agcaacgcgt aaactc 46
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二对
<400> 8
caatattttc atttttgaca tggagagaaa catctgagcg tcgcagaaca ttaca 55
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二对
<400> 9
gacgggatat ctgaccagtc ggtcgaaatt aaatgttgtc gtgtcttc 48
<210> 10
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二对
<400> 10
ccgggttttg cgtaatgatc tgcaatattt tcatttttga catggagaga aacatc 56
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针1 - EC
<400> 11
cgcgtccgat cacctgcgtc 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针2 - KP
<400> 12
gttgaggtca acagtgctgc gg 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针3 - SA
<400> 13
tcgcgacatt cattatgccc a 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义
<400> 14
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义
<400> 15
gcctaacaca tgcaagt 17
<210> 16
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V2反义
<400> 16
gcctcccgta ggag 14
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V2反义
<400> 17
tctggaccgt gtctcagt 18
<210> 18
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V3正义
<400> 18
ctcctacggg aggc 14
<210> 19
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V3反义
<400> 19
accgcggctg ct 12
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V4正义
<400> 20
cgtgccagca gccgcggt 18
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V4正义
<400> 21
cggaattact gggcgtaaa 19
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V6反义
<400> 22
acacgagctg acgac 15
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V6反义
<400> 23
tcacgacacg agctgacgac 20
<210> 24
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V7正义
<400> 24
aacgagcgca accc 14
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V9反义
<400> 25
tacggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V2反义
<400> 26
agagtttgat cctggctcag tctggaccgt gtctcagt 38
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V2反义
<400> 27
gcctaacaca tgcaagttct ggaccgtgtc tcagt 35
<210> 28
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V4正义
<400> 28
agagtttgat cctggctcag cgtgccagca gccgcggt 38
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V4正义
<400> 29
agagtttgat cctggctcag cggaattact gggcgtaaa 39
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V4正义
<400> 30
gcctaacaca tgcaagtcgg aattactggg cgtaaa 36
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V6反义
<400> 31
agagtttgat cctggctcag acacgagctg acgac 35
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V6反义
<400> 32
gcctaacaca tgcaagtaca cgagctgacg ac 32
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V2反义至V6反义
<400> 33
gcctcccgta ggagtcacga cacgagctga cgac 34
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V7正义
<400> 34
agagtttgat cctggctcag aacgagcgca accc 34
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V2反义至V7正义
<400> 35
tctggaccgt gtctcagtaa cgagcgcaac cc 32
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V2反义至V9反义
<400> 36
gcctcccgta ggagtacggt taccttgtta cgactt 36
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V9反义
<400> 37
agagtttgat cctggctcag tacggttacc ttgttacgac tt 42
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V1正义至V9反义
<400> 38
gcctaacaca tgcaagttac ggttaccttg ttacgactt 39

Claims (19)

1.一种使用能够扩增感兴趣的第一核酸序列(A)的引物对1和能够扩增感兴趣的第二核酸序列(B)的至少一个引物对2扩增样品中存在的至少两种不同的感兴趣的核酸序列的方法，所述方法包含以下步骤：
a.使样品与能够扩增所述核酸序列(A)的所述引物对1和能够扩增所述第二核酸序列(B)的引物对2接触，
i.所述引物对1由能够扩增对应于第一序列(A)的核酸的第一引物和第二引物形成，
ii.所述引物对2由能够扩增对应于第二序列(B)的核酸的第一引物和第二引物形成，
b.添加选择的试剂和允许PCR扩增的条件，以及
c.扩增所述第一核酸序列和所述第二核酸序列(A和B)，
其特征在于，所述引物对2的所述第一引物的序列在5'处进一步包含所述引物对1的所述第一引物或所述第二引物的序列，并且所述引物对2的所述第二引物的序列在5'处进一步包含所述引物对1的所述第一引物或所述第二引物的所述序列。
2.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述引物对2的所述第一引物的所述序列与所述引物对1的所述第一引物或所述第二引物的所述序列相邻，并且所述引物对2的所述第二引物的所述序列与所述引物对1的所述第一引物或所述第二引物的所述序列相邻。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述对1的所述第二引物是在5'处包含所述对1的所述第一引物的所述序列的杂交引物，并且所述序列是相邻的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述引物对2的浓度小于或等于所述引物对1的浓度。
5.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述引物对1与所述引物对2之间的浓度比率为1:1至1000:1。
6.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述引物对1与所述引物对2之间的所述浓度比率为1:1至100:1，优选25:1。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含使所述样品与能够扩增对应于第三核酸序列(C)的核酸序列的引物对3接触，其特征在于，所述引物对3的第一引物的序列在5'处进一步包含所述引物对1的所述第一引物或所述第二引物的所述序列，并且所述引物对3的第二引物的序列在5'处进一步包含所述引物对1的所述第一引物或所述第二引物的所述序列。
8.根据前述权利要求所述的方法，其中所述引物对1的所述浓度大于第二对和/或第三对的浓度。
9.根据前述权利要求所述的方法，其中所述引物对2的所述浓度等于所述引物对3的浓度。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其进一步包含使所述样品与能够扩增第四核酸序列(D)的引物对4接触，其特征在于，所述引物对4的第一引物的序列在5'处进一步包含所述引物对1的所述第一引物或所述第二引物的所述序列，并且所述引物对4的第二引物的序列在5'处进一步包含所述引物对1的所述第一引物或所述第二引物的所述序列。
11.根据前述权利要求所述的方法，其中所述引物对4的浓度小于所述引物对1的所述浓度。
12.根据前述权利要求所述的方法，其中所述引物对2的所述浓度、所述引物对3的所述浓度和所述引物对4的所述浓度相同。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含对扩增的核酸进行测序的步骤。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中感兴趣的核酸序列的扩增使得能够检测和鉴定参与至少一种感染性疾病的至少一种微生物。
15.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述微生物通过荧光探针、荧光标记、解链曲线、巢式PCR、定量PCR、反转录PCR或通过DNA测序来鉴定。
16.一种试剂盒，其包含：
-靶向基因16S的可变区域V1至V2的引物对1，其由以下组成：
■SEQ ID No:14或SEQ ID No:15的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:16或SEQ ID No:17或SEQ ID No:26或SEQ ID No:27，
-靶向所述基因16S的可变区域V4至V6的引物对2，其由以下组成：
■SEQ ID No:28或SEQ ID No:29或SEQ ID No:30的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:31或SEQ ID No:32或SEQ ID No:33。
17.一种试剂盒，其包含：
-靶向基因16S的可变区域V1至V2的引物对1，其由以下组成：
■SEQ ID No:14或SEQ ID No:15的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:16或SEQ ID No:17或SEQ ID No:26或SEQ ID No:27，
-靶向所述基因16S的可变区域V7至V9的引物对2，其由以下组成：
■SEQ ID No:34或SEQ ID No:35的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:36或SEQ ID No:37或SEQ ID No:38。
18.一种试剂盒，其包含：
-靶向基因16S的可变区域V1至V2的引物对1，其由以下组成：
■SEQ ID No:14或SEQ ID No:15的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:16或SEQ ID No:17或SEQ ID No:26或SEQ ID No:27，
-靶向所述基因16S的可变区域V4至V6的引物对2，其由以下组成：
■SEQ ID No:28或SEQ ID No:29或SEQ ID No:30的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:31或SEQ ID No:32或SEQ ID No:33，
-靶向所述基因16S的可变区域V7至V9的引物对3，其由以下组成：
■SEQ ID No:34或SEQ ID No:35的正义引物，以及
■反义引物SEQ ID No:36或SEQ ID No:37或SEQ ID No:38。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的试剂盒用于实施根据权利要求1至15中任一项所述的方法以及用于检测在至少一种感染性疾病的情况下存在的至少一种微生物的用途。
CN202180014773.3A 2020-01-30 2021-01-29 用于检测微生物的多重pcr方法及其用途 Pending CN115135777A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FRFR2000902 2020-01-30
FR2000902A FR3106834A1 (fr) 2020-01-30 2020-01-30 Nouveau procédé de PCR multiplexe et utilisation
PCT/EP2021/052115 WO2021152096A1 (fr) 2020-01-30 2021-01-29 Procede de pcr multiplexe pour la detection de microorganismes et son utilisation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115135777A true CN115135777A (zh) 2022-09-30

Family

ID=70456934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180014773.3A Pending CN115135777A (zh) 2020-01-30 2021-01-29 用于检测微生物的多重pcr方法及其用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230093543A1 (zh)
EP (1) EP4097255A1 (zh)
JP (1) JP2023517464A (zh)
CN (1) CN115135777A (zh)
AU (1) AU2021215034A1 (zh)
CA (1) CA3166316A1 (zh)
FR (1) FR3106834A1 (zh)
WO (1) WO2021152096A1 (zh)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19616750A1 (de) * 1996-04-26 1997-11-06 Newlab Diagnostic Systems Gmbh Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gemischen
FR2811321A1 (fr) * 2000-07-04 2002-01-11 Bio Merieux Amplificateur d'une region ribonucleique cible d'un arn ribosomal 16s ou adn pour un tel arn d'une espece eubacterienne et detection de telles especes
KR20030015010A (ko) * 2001-08-14 2003-02-20 주식회사 파이오니아 신규한 가지검은마름병원균 ｗｔ＃３（ｋｃｃｍ１０２８３）유래 ｗｔ＃３－１유전자를 이용한 새로운생물농약
FR2886946B1 (fr) * 2005-06-09 2007-08-10 Biomerieux Sa Procede pour le diagnoctic/pronostic du cancer du sein
JP4967095B2 (ja) * 2005-08-12 2012-07-04 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 黄色ブドウ球菌濃度測定方法及び食中毒可能性判定方法
CA2693438A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Universite Laval Nucleic acid sequences and combination thereof for sensitive amplification and detection of bacterial and fungal sepsis pathogens
ITMI20071410A1 (it) * 2007-07-13 2009-01-14 Univ Firenze Test in biologia molecolare su campioni biologici per la diagnosi e tipizzazione di germi causa di malattie invasive
FR2925918A1 (fr) * 2007-12-28 2009-07-03 Pasteur Institut Typage et sous-typage moleculaire de salmonella par identification des sequences nucleotidiques variables des loci crispr
FR2970480B1 (fr) * 2011-01-18 2017-01-20 Inst Nat De La Rech Agronomique - Inra Procede de depistage de xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
FR3004728B1 (fr) * 2013-04-19 2016-02-19 Univ Reims Champagne Ardenne Methode de caracterisation des mutations chromosomiques des genes codant les topoisomerases bacteriennes
US10136646B2 (en) * 2013-06-26 2018-11-27 Indigo Ag, Inc. Agricultural endophyte-plant compositions, and methods of use
US20170166956A1 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 Shoreline Biome, Llc Methods for DNA Preparation for Multiplex High Throughput Targeted Sequencing

Also Published As

Publication number Publication date
EP4097255A1 (fr) 2022-12-07
US20230093543A1 (en) 2023-03-23
JP2023517464A (ja) 2023-04-26
AU2021215034A1 (en) 2022-08-25
CA3166316A1 (fr) 2021-08-05
FR3106834A1 (fr) 2021-08-06
WO2021152096A1 (fr) 2021-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Barken et al. Advances in nucleic acid-based diagnostics of bacterial infections
US20100273159A1 (en) Nested Multiplex Amplification Method for Identification of Multiple Biological Entities
US20100075305A1 (en) Detection of bacterium by utilizing dnaj gene and use thereof
US20110287965A1 (en) Methods and compositions to detect clostridium difficile
US20110287428A1 (en) Neisseria gonorrhoeae detection
US7381547B2 (en) Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR
Debruyne et al. Comparative performance of different PCR assays for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli
US20030113757A1 (en) Rapid and specific detection of campylobacter
JP5210634B2 (ja) スペーサー領域を使用するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出、同定および鑑別
WO2015103710A1 (en) Methods, reagents and kits for the assessment of bacterial infection
US9487833B2 (en) Primer set specific for vancomycin-resistant Enterococcus, composition comprising the same and method of detecting vancomycin-resistant microorganism Enterococcus in sample
EP3438280B1 (en) Haemoplasma detection method
WO2021201091A1 (ja) クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ
CN115135777A (zh) 用于检测微生物的多重pcr方法及其用途
CN101092645B (zh) 诊断性传染病致病原的新颖方法
CN111575395A (zh) 检测沙门氏菌和单增李斯特菌的引物组、试剂盒和方法
EP2300620B1 (en) Lepa / guf1 gene sequences as a diagnostic target for the identification of bacterial species
CN107110864B (zh) 用于检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法
JP4766878B2 (ja) ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および識別
US7749696B2 (en) Method and kit for the specific detection of M. tuberculosis
CA2474136A1 (en) One-step multiplex pcr for the identification and differentiation of campylobacter species
US20220396828A1 (en) Method of determining the presence of a hyper-virulent clostridioides difficile strain of the b1/nap1/027 group in a sample
US7384770B1 (en) Rapid quantification of acetic acid-producing bacteria using real-time PCR
AU2007266857B2 (en) Mycoplasma genitalium detection assay based on the MG219 gene
JP2004081054A (ja) 腸管出血性大腸菌ベロトキシン検出のためのプライマーおよびそれを用いた腸管出血性大腸菌の同定法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination