JP4967095B2

JP4967095B2 - 黄色ブドウ球菌濃度測定方法及び食中毒可能性判定方法

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Publication number: JP4967095B2
Application number: JP2005234730A
Authority: JP
Inventors: 由起子工藤; 肇高橋; 元樹後藤
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2005-08-12
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2025-08-12
Also published as: JP2007044013A

Description

本発明は、食品などの検体において、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の濃度を測定する方法、及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）が産生する毒素に起因する食中毒の可能性を判定する方法に関する。

黄色ブドウ球菌（学名：Staphylococcus aureus）は、ヒトをはじめとする各種動物の皮膚などに常在する菌である。そして、この黄色ブドウ球菌は、主に化膿性疾患に起因する菌である一方、食中毒に関連する菌の一つでもある。

黄色ブドウ球菌は、菌の種類によっても異なるが、一般に耐熱性の毒素を産生する。現在、検体中に存在する病原体を確認する細菌学的検査法としては、塗抹鏡検による観察、病原体由来抗原の検出、ＤＮＡプローブによる診断、分離培養法などが知られているが、これらの中で、黄色ブドウ球菌の確認には、主に、抗黄色ブドウ球菌毒素抗体を用いて、黄色ブドウ球菌由来の毒素を直接検出するＥＬＩＳＡ法が用いられている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。
特開平６−８８８２４「1990年6月作成逆受身ラテックス凝集反応によるブドウ球菌エンテロトキシン検出用キットＳＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」添付文書集p118-123」デンカ生研株式会社発行

しかしながら、食中毒を引き起こす主要な毒素の種類は少なくとも５種類（黄色ブドウ球菌毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）あるため、ＥＬＩＳＡ法に用いる抗体を特定するために、あらかじめ黄色ブドウ球菌の種類を確定するか、黄色ブドウ球菌の種類を確定しない場合は、各毒素に対する抗体を全て用いなければならなかった。

そこで、本発明は、食品などにおいて、簡便に黄色ブドウ球菌の濃度を測定する方法、及び黄色ブドウ球菌が産生する毒素に起因する食中毒の可能性を判定する方法を提供することを目的とする。

本発明にかかる、検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の濃度を測定する方法は、所定の菌濃度で黄色ブドウ球菌を粉砕処理して得られる菌抽出物を用いて、配列番号１の中で前記黄色ブドウ球菌では特異的に保存されているが前記黄色ブドウ球菌以外の細菌種では保存されていない領域を利用して行うリアルタイムＰＣＲを、複数の希釈段階を設けた菌濃度の前記黄色ブドウ球菌に対して行うことにより、前記黄色ブドウ球菌と、前記リアルタイムＰＣＲの結果との相関関係を求める工程と、検体を前記粉砕処理して得られる検体抽出物を用いて、前記リアルタイムＰＣＲと同じ条件でリアルタイムＰＣＲを行い、前記検体抽出物に対する前記リアルタイムＰＣＲの結果を得る工程と、前記相関関係より、前記検体抽出物に対する前記リアルタイムＰＣＲの結果から、前記検体抽出物の黄色ブドウ球菌の菌濃度を算出する工程とを含む。この方法において、前記リアルタイムＰＣＲの結果が、Ct(Threshold)値であることが好ましい。検体が固体の場合は、菌濃度を単位重量あたりの菌数とする。

また、上記方法において、前記リアルタイムＰＣＲをＴａｑＭａｎ法によって行ってもよい。その場合、前記配列番号１の中で前記黄色ブドウ球菌では特異的に保存されているが前記黄色ブドウ球菌以外の細菌種では保存されていない領域に対し、前記黄色ブドウ球菌内で異なる遺伝子プールにある複数の細菌株の塩基配列を決定することにより、前記遺伝子内に存在する多型の位置を決定し、前記多型を含まないように、前記リアルタイムＰＣＲのためのプローブの位置を決定し、前記多型を多くとも１個しか含まないように、前記リアルタイムＰＣＲのためのプライマーの位置を決定することが好ましい。

さらに、前記検体は、食品であることが好ましい。

また、本発明にかかる、検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）が産生する毒素に起因する食中毒の可能性を判定する方法は、検体を粉砕処理して得られる検体抽出物を用いて、配列番号１の中で前記黄色ブドウ球菌では特異的に保存されているが前記黄色ブドウ球菌以外の細菌種では保存されていない領域を利用して行うリアルタイムＰＣＲを行い、前記検体抽出物に対する前記リアルタイムＰＣＲの結果を得る工程と、前記リアルタイムＰＣＲの結果におけるCt(Threshold)値が20以上である場合は「食中毒の可能性が低い」と判断し、前記リアルタイムＰＣＲの結果におけるCt値が20未満である場合は「食中毒の可能性が高い」と判断する工程とを含む。

さらに、前記検体は、食品であることが好ましい。

本発明によると、食品などにおいて、簡便に黄色ブドウ球菌の濃度を測定する方法、及び黄色ブドウ球菌が産生する毒素に起因する食中毒の可能性を判定する方法を提供することができる。

以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

本発明は、食品などの検体中に存在する黄色ブドウ球菌の毒素の量を簡便に測定する方法、及び黄色ブドウ球菌が産生する毒素に起因する食中毒の可能性を判定する方法である。以下、それらの方法の具体的詳細を述べる。

まず、検体を粉砕処理して検体抽出物を得る。検体としては、食品などを用いることができる。粉砕処理は、加熱する、すり鉢で擂る、ホモジナイザーでホモジナイズするなど、検体を細かく粉砕できればよいが、液状になるまで粉砕するのが好ましい。粉砕する際、バッファーなどの溶液を加え、溶液中で検体を粉砕してもよい。また、検体が液状（例えば、牛乳など）の場合は、超音波によって粉砕処理を行ってもよい。検体抽出物を得るのに、フェノール処理などのＤＮＡ抽出処理をしてもよいが、ＰＣＲによって結果が得られる程度の抽出処理であればよい。最後に、遠心処理やフィルター処理などにより、固形物を除去するのが好ましい。

この検体抽出物を用い、黄色ブドウ球菌に存在する配列番号１を対象にリアルタイムＰＣＲを行い、検体抽出物に含まれる配列番号１のＤＮＡ量を定量する。ここで、配列番号１は、全ての黄色ブドウ球菌種が共通に持っているため、リアルタイムＰＣＲを行うには有効な検出対象の配列となる。

この配列番号１内において、黄色ブドウ球菌では特異的に保存されているが黄色ブドウ球菌以外の細菌種では保存されていない領域を利用して、リアルタイムＰＣＲを行うように、プライマーやプローブなどを設定する。図１に、以下の実施例で用いた黄色ブドウ球菌におけるそのような領域の一例を挙げる（図１の黒塗りに白抜き字の部分）。この領域内においてプライマー及びプローブを設定してリアルタイムＰＣＲを実施したところ、図２に示す通り、このプライマー及びプローブは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対して特異的に反応することが分かった。従って、この領域中で、多型を有する塩基をできるだけ含まないように、リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーやプローブなどの塩基配列を決定すれば、黄色ブドウ球菌の全ての菌株において、ＤＮＡを増幅させることができる。なお、本実施例では、図１の矢印の部分の配列をＰＣＲプライマーに、四角の部分の配列をプローブに用いた。

リアルタイムＰＣＲ法には、５’末端を蛍光物質（ＦＡＭなど）で、３’末端をクエンチャー物質（ＴＡＭＲＡなど）で修飾したオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に加えるＴａｑＭａｎ法、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ）をＰＣＲ反応系に加えるインターカレーター法、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブとＲＮａｓｅＨの組み合わせを利用するサイクリングプローブ法などが開発されているが、ＰＣＲによる検出対象として配列番号１の遺伝子を用いる場合、リアルタイムＰＣＲとして、ＴａｑＭａｎ法又はサイクリングプローブ法を行うことが特に好ましい。なぜなら、ＴａｑＭａｎ法及びサイクリングプローブ法では、プライマーだけでなく、プローブも用いるので、検出対象としているＤＮＡに対する特異性が著しく上昇し、非特異的に出現するシグナルによるＤＮＡ量の過剰評価が抑えられるからである。以下の実施例では、ＴａｑＭａｎ法によるリアルタイムＰＣＲを行った。なお、ＴａｑＭａｎ法においてプローブの塩基配列を決める際には、検出対象の黄色ブドウ球菌の菌株で特異的に保存されたＤＮＡ領域中で、多型を有する塩基をできるだけ含まないように決定することが望ましい。

このようにして得られたプライマー配列及び／又はプローブ配列を有するオリゴヌクレチドを合成し、それらを用いて、検出抽出物に対し、リアルタイムＰＣＲを行う。

一方、複数の希釈段階を設けた菌濃度で黄色ブドウ球菌を粉砕処理して得られる菌抽出物を用い、その黄色ブドウ球菌に対してリアルタイムＰＣＲを行うことにより、黄色ブドウ球菌濃度と、リアルタイムＰＣＲの結果との相関関係を求める。この相関関係より、検体抽出物に対して得られたリアルタイムＰＣＲの結果から、検体抽出物中の黄色ブドウ球菌の菌濃度を算出する。なお、その菌濃度から検体中に存在する黄色ブドウ球菌の菌数を算出することもできる。

例えば、段階希釈した黄色ブドウ球菌に対し、検体と同様に粉砕処理して得られる菌抽出物を用いて、それぞれ検体と同様にリアルタイムＰＣＲを行い、検量線を作成する。この検量線を用いて、検体抽出物で行ったリアルタイムＰＣＲの結果から、検体抽出物中のその黄色ブドウ球菌の菌濃度を算出する。

具体的には、横軸にＰＣＲのサイクル数、縦軸にＰＣＲ産物量をとり、各希釈段階黄色ブドウ球菌に対するＰＣＲについてプロットすると、Ｓ字曲線が平行に並んだグラフとなる。次に、縦軸に増幅が指数関数的に起こる領域内で所定の増幅産物量になるサイクル数（Threshold cycle；Ct値）を、横軸に細菌濃度（log(黄色ブドウ球菌数)/ml）をとり、各希釈段階についてプロットすると、グラフは直線状になる（検量線）。検体抽出物で行った黄色ブドウ球菌のリアルタイムＰＣＲの結果から、上記所定の増幅産物量になるサイクル数（Ct）を求め、検量線より、検体抽出物中の菌濃度を算出する。

なお、菌濃度ではなく、抽出したＤＮＡ量を基にして作成した検量線を用いて、その黄色ブドウ球菌のゲノム量を用いて菌濃度を計算することも理論上は可能である。しかし、ＤＮＡを抽出する際の効率などの問題があり、実際上100％のＤＮＡが抽出されているわけではないため、検量線を作成し、その検量線を用いて、検体抽出物中の菌濃度を算出するのが好ましい。

また、上記の相関関係は、黄色ブドウ球菌の菌数と、リアルタイムＰＣＲの結果との相関関係であってもよいが、検量線の作成には、複数のサンプルの処理を同じ条件で行うことが好ましく、検量線を作製するときに用いる複数のサンプルの処理を全く同じ条件で行った場合、複数のサンプルは同じ容量を有するので、菌数とリアルタイムＰＣＲの結果との相関関係は、菌濃度とリアルタイムＰＣＲの結果との相関関係と等価なものとなる。

さらに、上記粉砕処理は、上記各菌抽出物を作製する場合と検体抽出物を作製する場合において異なっていてもよいが、正確なデータを得るために粉砕処理の条件は同じである方が好ましい。

黄色ブドウ球菌が産生する毒素に起因する食中毒の可能性を判定する方法を得るために、実施例に記載するように、複数の菌濃度の黄色ブドウ球菌を用いて、黄色ブドウ球菌が産生する毒素の量を測定することにより、黄色ブドウ球菌濃度と、黄色ブドウ球菌の毒素量との関係を求めた(図４−１、図４−２及び図４−３参照)。いずれの場合も、Ｃｔ値が２０以上である場合には毒素が検出されなかった。従って、Ｃｔ値が２０未満である場合に「食中毒の可能性が高い」と判定し、Ｃｔ値が２０以上である場合に「食中毒の可能性が低い」と判定する。なお、Ｃｔ値が２０未満である場合、毒素が検出されないことがあるが、毒素が検出される場合があるときに「食中毒の可能性が低い」と判定するよりも、毒素が検出されない場合があるときに「食中毒の可能性が高い」と判定するほうが、現実的に問題が少ない。従って、判定の境界となる値は２０より大きいほうが好ましく、２４がより好ましく、２７がさらに好ましい。

以上より、本発明は、検体抽出物中の黄色ブドウ球菌の型が異なった場合でも、黄色ブドウ球菌が産生する毒素に起因する食中毒の可能性を判定することができるのでとても有用である。

以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。

＝＝食品中の黄色ブドウ球菌濃度の測定＝＝
検体として市販の牛乳を用いた。

次に、検量線の作成のため、以下の（１）及び（２）の試料を準備し、100μl（50U）アクロモペプチダーゼを用いてＤＮＡをMag Extrator(TOYOBO社)で抽出した。
（１）8時間培養した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）をＰＢＳで10〜10⁹倍まで10倍ずつ希釈した菌培養液
（２）黄色ブドウ球菌で汚染されていない1mlの上記牛乳（これをネガティブコントロールとする）、及び黄色ブドウ球菌で汚染されていない上記牛乳に対しＰＢＳで10〜10⁹倍まで10倍ずつ希釈した菌培養液を0.1mlずつ添加した人工汚染牛乳

次に、上記の菌培養液、牛乳、人工汚染牛乳から得られたＤＮＡを用いて、ＴａｑＭａｎ法を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲに用いた反応液50μｌは以下のように調製した；25μｌTaqMan universal PCR maseter mix （アプライド・バイオシステム社）、5μｌ鋳型ＤＮＡ（10ng/μl）、100ｎＭ下記プライマー、1000ｎＭ下記 TaqMan プローブ。なお、プローブの塩基配列は、図１に示されているように、黄色ブドウ球菌において保存されており、黄色ブドウ球菌以外の細菌で保存されていないＤＮＡ領域のうち、多型を示す塩基対を含まないように決定した。一方、プライマーの塩基配列は、図１に示されているように、黄色ブドウ球菌において保存されており、黄色ブドウ球菌以外の細菌で保存されていないＤＮＡ領域のうち、１個しか多型を示す塩基対を含まないように決定した。

プライマー及びプローブの配列は以下の通りである。
フォワードプライマー: ＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴＴＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＣ（配列番号２）
リバースプライマー: ＴＣＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＴＧＲＡＧＡＧＡＡＡＣＡＴＣ（配列番号３）
ＴａｑＭａｎプローブ:ＴＣＧＣＧＡＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡ（配列番号４）

リアルタイムＰＣＲ反応は、50℃2分、95℃10分の初期変性、95℃15秒（熱変性）、65℃1分（アニーリング及び伸長反応）を40サイクルの条件で行った。ＰＣＲを行っている最中の蛍光強度の測定は自動的に行われた。また、ＤＮＡ増幅データは、ABI PRISM 7000 SDS softwareによって解析された。

次に、各試料において、菌の濃度（log (菌数)/ml）に対する検出した蛍光強度が検出閾値に達した時のサイクル数（Ct）をプロットし、菌培養液及び人工汚染牛乳の検量線をそれぞれ作成した（図３）。

その結果、図３に示すように、人工汚染牛乳の検量線は、菌培養液の検量線の上側へ平行にずれたが、そのずれは誤差レベルであった。従って、用いる食品ごとに人工汚染物を作製し検量線を作成することが好ましいが、異なる人工汚染物で作成した検量線も用いることができる。

＝＝黄色ブドウ球菌が産生する毒素に起因する食中毒の可能性の判定＝＝
50mlのトリップティックソイブロス（TRYPTIC SOY BROTH）（会社名：Difco、製品番号：0370-17-3）培地に黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ型産生性株、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＣ型産生性株及び黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＤ型産生性株を約1×10⁵個植菌し、37℃のインキュベーターにて培養した。そして、３時間ごとに、前述の「食品中の黄色ブドウ球菌濃度の測定」に記載のリアルタイムＰＣＲ法を用いてCt値を求めこの培養液中に存在する黄色ブドウ球菌の濃度を測定した。また、同時に培地中に産生された黄色ブドウ球菌由来の毒素（エンテロトキシンＡ、Ｃ、Ｄ）を逆受身ラテックス凝集反応法（逆受身ラテックス凝集反応によるブドウ球菌エンテロトキシン検出用キットＳＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」（会社名：デンカ生研株式会社））によって測定した。その結果を図４−１、図４−２及び図４−３に示す。なお、図中の数字はCt値を示す。

図４−１、図４−２及び図４−３に示す通り、Ct値が20以上の場合には各々のエンテロトキシンが産生されないことが分かった。

本発明の一実施形態において、プライマー及びプローブを設定するための黄色ブドウ球菌の塩基配列を示す図である。なお、この配列は、GeneBank Accession No.ＢＡ000018を参考にした。本発明の一実施形態において、ＴａｑＭａｎ法に使用するプライマー及びプローブの特異性を細菌ごとに示した図である。なお、ＰＣＲ（＋）はＰＣＲ反応陽性、ＰＣＲ（−）はＰＣＲ反応陰性を示す。本発明の一実施形態において、菌培養液及び人工汚染牛乳の検量線を表わした図である。本発明の一実施形態において、黄色ブドウ球菌濃度、黄色ブドウ球菌が産生した毒素の量、及びCt値を測定した結果を示す図である。なお、グラフ中の数字は、Ct値を表わす。図４−１はエンテロトキシンＡの産生を表わす。本発明の一実施形態において、黄色ブドウ球菌濃度、黄色ブドウ球菌が産生した毒素の量、及びCt値を測定した結果を示す図である。なお、グラフ中の数字は、Ct値を表わす。図４−２はエンテロトキシンＣの産生を表わす。本発明の一実施形態において、黄色ブドウ球菌濃度、黄色ブドウ球菌が産生した毒素の量、及びCt値を測定した結果を示す図である。なお、グラフ中の数字は、Ct値を表わす。図４−３はエンテロトキシンＤの産生を表わす。

Claims

検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の濃度を測定する方法であって、
複数の希釈段階を設けた菌濃度の前記黄色ブドウ球菌を粉砕処理して得られる菌抽出物に対してリアルタイムＰＣＲを行うことにより、前記黄色ブドウ球菌と、前記リアルタイムＰＣＲの結果との相関関係を求める工程であって、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーが、ＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴＴＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＣ（配列番号２）とＴＣＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＴＧＲＡＧＡＧＡＡＡＣＡＴＣ（配列番号３）であり、プローブが、ＴＣＧＣＧＡＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡ（配列番号４）である工程と、
検体を前記粉砕処理して得られる検体抽出物を用いて、前記リアルタイムＰＣＲと同じ条件でリアルタイムＰＣＲを行い、前記検体抽出物に対する前記リアルタイムＰＣＲの結果を得る工程と、
前記相関関係より、前記検体抽出物に対する前記リアルタイムＰＣＲの結果から、前記検体抽出物の黄色ブドウ球菌の菌濃度を算出する工程と、
を含む方法。
前記リアルタイムＰＣＲの結果が、Ｃｔ(Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ)値であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記リアルタイムＰＣＲをＴａｑＭａｎ法によって行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
前記検体が、食品であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）が産生する毒素に起因する食中毒の可能性を判定する方法であって、
ＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴＴＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＣ（配列番号２）とＴＣＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＴＧＲＡＧＡＧＡＡＡＣＡＴＣ（配列番号３）をプライマーとして用いたリアルタイムＰＣＲを、１Ｅ＋０７ｃｆｕ／ｍｌの菌濃度を有する前記黄色ブドウ球菌を粉砕処理して得られる学習用菌抽出物を用いて行い、増幅産物量が所定量になるサイクル数（Ｃｔ）をＣｔ基準値として決定する工程（イ）と、
前記学習用菌抽出物の代わりに検体を粉砕処理して得られる検体抽出物を用いる以外は、工程（イ）と同様の条件下でリアルタイムＰＣＲを行い、前記検体抽出物に対する前記リアルタイムＰＣＲの結果を得る工程（ロ）と、
工程（ロ）のリアルタイムＰＣＲの結果におけるＣｔ値が、工程（イ）で決定した前記Ｃｔ基準値以上である場合は「食中毒の可能性が低い」と判断し、工程（ロ）のリアルタイムＰＣＲの結果におけるＣｔ値が、工程（イ）で決定した前記Ｃｔ基準値未満である場合は「食中毒の可能性が高い」と判断する工程（ハ）と、
を含む方法。
前記リアルタイムＰＣＲをＴａｑＭａｎ法によって行うことを特徴とする請求項５に記載の方法。
前記リアルタイムＰＣＲのためのプローブは、ＴＣＧＣＧＡＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡ（配列番号４）であることを特徴とする
請求項６に記載の方法。
前記検体が、食品であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の方法。