CN104232783A - 牛种布氏菌弱毒疫苗株a19的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组,引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-3。本发明引物组及方法的优点如下:1)高效灵敏:在1.5h的时间里,即可完成扩增,扩增模板的最低检出限为4.0×10-5ng/μl;2)特异性强:采用Cycling标记的荧光探针,特异性针对A19基因组产生荧光扩增信号,而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株,不产生荧光扩增信号;3)操作简便:配置好的Cycleave PCR反应体系,置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程,不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定;4)高通量:根据荧光定量PCR仪的检测孔数量,可以一次性实现48~384个样品的检测。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域,具体涉及一种牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的Cycleave PCR快速检测方法。
背景技术
布氏菌病(简称“布病”)是由布氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病,不仅给畜牧业造成严重的经济损失,并威胁人类健康。弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段,但弱毒疫苗的使用往往对布病的诊断和监测造成干扰。实现布氏菌弱毒疫苗与野生菌株的鉴别,对于布病防控工作具有重要现实意义。
A19株是我国目前在用的布氏菌弱毒疫苗株之一,其鉴别包括血清抗体和病原检测两个方面。A19为光滑型菌株,其LPS含有O-侧链,能刺激机体产生抗体,对牛有一定的保护力,但也使常规血清学检测方法难以区分疫苗免疫与自然感染。病原分离鉴定,所需营养条件复杂,分离培养需在P2级以上生物安全实验室进行,且难以区分A19与同生物型的其它菌株,限制其广泛应用。
近年,Real-time PCR技术发展迅速,其检测特异、敏感、操作简便,为A19的鉴别提供了新技术手段。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)指单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形态,SNP位点广泛的应用于细菌耐药性基因、细菌分种分型、病毒分型等鉴别检测中。基于Cycling荧光探针的Cycleave PCR方法可以区分SNP位点的差异,其检测具有特异、敏感、快速以及荧光背景低、信噪比高等优势。目前,还没有有效的基于Cycling探针鉴别A19的Cycleave PCR扩增引物。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的Cycleave PCR快速检测方法,从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组,引物信息如下:
ATT-F:CCAGAATGCGAACGGAGATG(SEQ ID NO:1)
ATT-R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG(SEQ ID NO:2)
ATT-P:GCTCACGGA(SEQ ID NO:3)
其中ATT-P的5′端用FAM进行标记;3′端用Eclipse进行标记。
本发明还提供一种利用上述的Cycleave PCR引物组检测A19的方法,包括有如下的步骤:
1)待检测基因组DNA的提取:用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA;
2)Cycleave PCR步骤:根据本发明设计A19的Cycleave PCR引物组,加入反应体系中各组分。反应程序:95℃30s;95℃5s,55℃10s,72℃20s,在72℃进行FAM荧光信号采集,进行40个循环。
3)结果检测:根据荧光扩增曲线情况,判定检测结果。
另一方面,本发明的Cycleave PCR引物组可用于制备检测试剂盒。
本发明引物组及方法的优点如下:1)高效灵敏:在1.5h的时间里,即可完成扩增,扩增模板的最低检出限为4.0×10-5ng/μl;2)特异性强:采用Cycling标记的荧光探针,特异性针对A19基因组产生荧光扩增信号,而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株,不产生荧光扩增信号;3)操作简便:配置好的Cycleave PCR反应体系,置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程,不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定;4)高通量:根据荧光定量PCR仪的检测孔数量,可以一次性实现48~384个样品的检测。
附图说明
图1:阳性结果荧光扩增曲线图,其中:曲线1.阳性对照,即A19基因组的荧光扩增曲线;曲线2.阴性对照,即水的荧光扩增曲线。
图2:Cycleave PCR方法检测A19基因组DNA的灵敏度检测荧光扩增曲线图,其中:曲线1-8.A19基因组DNA的质量浓度分别为40ng/μl,4ng/μl,4.0×10-1ng/μl,4.0×10-2ng/μl,4.0×10-3ng/μl,4.0×10-4ng/μl,4.0×10-5ng/μl,4.0×10-6ng/μl;曲线9.阴性对照。
图3:Cycleave PCR方法检测A19基因组DNA的特异性检测荧光扩增曲线图,其中:曲线1,Brucella suis biovar 1 S1330;曲线2,B.suis biovar 2Thomsen;曲线3,B.suis biovar 3 686;曲线4,B.suis biovar 4 40;曲线5,B.abortus biovar 1 A544;曲线6,B.abortus biovar 2 86/8/59;曲线7,B.abortus biovar 3 Tulya;曲线8,B.abortus biovar 4 292;曲线9,B.abortus biovar 5B3196;曲线10,B.abortus biovar 6 870;曲线11,B.abortus biovar 7 63/75; 曲线12,B.abortus biovar 9C68;曲线13,B.melitensis biovar 1 16M;曲线14,B.melitensis biovar 2 63/9;曲线15,B.melitensis biovar 3 Ether;曲线16,B.ovis 63/290;曲线17,B.canis RM6/66;曲线18,B.neotomae 5K33;曲线19,S2;曲线20,104M;曲线21,M5-90;曲线22,Escherichia coli K99;曲线23,Pasteurella multocida C48-1;曲线24,Streptococcus suis ST171;曲线25,Pseudomonas aeruginosa DI-1;曲线26,阳性对照;曲线;27,阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
一、用于检测A19的Cycleave PCR引物组的设计
牛种布鲁氏菌A19株于1923年由美国自牛奶中分离,经实验室自然传代减毒后,成为一株毒力稳定的弱毒菌株,是我国在用的布氏菌弱毒疫苗株之一。S19是在A19的基础上筛选出的赤藓糖醇敏感株,两者基因组比较,S19较A19存在Ery基因缺失,而我国目前未推广S19株弱毒疫苗。本发明首先根据GeneBank中公布的S19全基因组序列,经与GeneBank中其它布氏菌株全基因组序列BLAST比对,分析获得S19SNP位点,再测序鉴定A19基因组中对应S19SNP位点处的核苷酸序列。之后,选择经鉴定存在的A19SNP位点,与我国布氏菌地方流行株和常用布氏菌弱毒疫苗株相应SNP处核苷酸序列测序比较,验证该SNP的A19特异性。经上述筛选,本发明获得Att基因上一处A19特异的SNP位点。
本发明依据Att基因上A19特异的SNP位点,在其两翼用 PCR Assay Designer软件进行引物与探针设计。设计合适的引物是进行PCR反应的关键,通过考虑碱基组成、GC含量、二级结构的形成、Tm值等因素来设计检测A19的Cycleave PCR反应的引物及探针。其中,引物用于扩增Att片段基因,探针用于检测该Att片段基因中SNP位点存在与否。用上述引物及探针进行检测时,当布氏菌基因组DNA中,存在SNP位点时,扩增后出现荧光扩增曲线,可判定该模板来源于A19株;当布氏菌基因组DNA中不含SNP位点或模板本身为非布氏菌时,扩增后不出现荧光扩增曲线。引物及探针由大连宝生物工程有限公司合成。引物及探针如表1所示:
表1:A19的Cycleave PCR引物及探针
注:下划线标记为SNP位置
二、牛种布氏菌弱毒疫苗株A19Cycleave PCR的效果检测
1.1试验材料
菌株:使用的布氏菌常见种、生物型参考株及布氏菌疫苗株,见表1;四个非布氏菌参考菌株:大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌DI-1。
表2:使用的布氏菌株及登录号
1.2细菌DNA提取
将上述菌株菌种接种胰蛋白琼脂培养基,37℃培养24—72h,根据需要不添加或添加5—10%CO2。培养菌落用0.5%甲醛的生理盐水洗涤后,37℃灭活24h,用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA,微量核酸蛋白测定仪测定细菌基因组DNA浓度,冻存于-20℃,备用,作为Cycleave PCR扩增模板。
1.3Cycleave PCR反应体系及条件
反应体系为:
反应条件:95℃预变性30s,;95℃5s,55℃10s,72℃20s,在72℃进行FAM荧光信号采集,进行40个循环。
1.4Cycleave PCR方法的灵敏度评价
灵敏度评价:经超微量核酸蛋白测定仪测得布氏菌A19株基因组DNA的浓度为40.0ng/μl。首先将质量浓度为40.0ng/μl的细菌基因组DNA进行10倍系列梯度稀释,再依次取1μl作模板,进行Cycleave PCR扩增。根据图像判定结果,扩增曲线有明显对数增长期,且Ct值≤37,为A19检测阳性;扩增曲线无对数增长期或Ct值>37,为A19检测阴性。以无菌水代替细菌DNA模板作为阴性对照。
1.5Cycleave PCR方法的特异性评价
特异性评价:分别提取布氏菌常见种、生物型参考株与布氏菌疫苗株(见表2,编号1-23)以及大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌DI-1的基因组DNA。用所建立的布氏菌A19株Cycleave PCR检 测体系进行特异性试验。以无菌水代替细菌DNA模板作为阴性对照。
2结果与分析
2.1以A19基因组DNA为模板,Cycleave PCR后出现典型扩增曲线(含明显对数增长期),且Ct值≤37;而以无菌水代替细菌DNA模板,Cycleave PCR后未出现扩增信号,无Ct值。
2.2Cycleave PCR灵敏度检测结果
图2的荧光曲线扩增结果显示这个方法的最低检出限为4.0×10-5ng/μl基因组DNA模板。
2.3Cycleave PCR特异性检测结果
用本试验中建立的布氏菌A19株Cycleave PCR检测体系,可以检测出A19株,而检测不到其它常见种、生物型布氏菌与疫苗株,以及大肠杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、绿脓杆菌,如图3所示。说明引物具有特异性,可作为我国布氏菌A19株的检测引物。
上述结果表明本发明的布氏菌A19株Cycleave PCR引物及检测方法检测灵敏度高、特异性好,通过单次检测即可快速、有效的鉴别检测样品是否为布氏菌A19株。操作简便,在荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程,不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时,可以实现样品的高通量检测。
Claims (5)
1.一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组,其特征在于,所述的引物组的序列信息如下:
ATT-F:CCAGAATGCGAACGGAGATG、
ATT-R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG、
ATT-P:GCTCACGGA。
2.如权利要求1所述的引物组,其特征在于,所述的ATT-P的5′端用FAM进行标记;3′端用Eclipse进行标记。
3.权利要求1所述的引物组在检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的引物组检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的方法,其特征在于,所述的方法包括有如下的步骤:
1)待检测基因组DNA的提取:用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA;
2)Cycleave PCR步骤:将权利要求1所述的引物组加入到反应体系中,反应程序为95℃30s;95℃5s,55℃10s,72℃20s,在72℃进行FAM荧光信号采集,进行40个循环;
3)结果检测:根据荧光扩增曲线情况,判定检测结果。
5.一种检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。
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