CN113736918A - 一种检测牛结节性皮肤病的Cycleave荧光PCR方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法;所提供的引物对和探针,其中引物对的正向引物的序列为SEQ ID NO:1,反向引物的序列为SEQ ID NO:2;探针的序列为SEQ ID NO:3。本发明所提供的Cycleave荧光PCR检测牛结节性皮肤病病毒的引物、探针及方法具有检测灵敏度高、特异性好、高通量和操作简便的优点。
Description
技术领域
本发明属牛病病原微生物检测技术领域,具体涉及一种用于检测牛结节性皮 肤病的Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。
背景技术
牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease,LSD)是一种由痘病毒科(Poxviridae)、羊痘病毒属(Capripoxvirus,CaPV)的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)引起的急性、亚急性传染病,主要特征是发热,皮肤、粘膜上结 节样病变和淋巴结肿大等。
牛是该病毒的特异性宿主,发病可导致奶牛产奶量下降、公牛短暂或永久不 育、怀孕牛流产、皮革损坏以及继发细菌感染导致死亡。该病曾于非洲、中东、 东欧等地区多个国家流行并造成巨大经济损失。
检测时,通过发热、皮肤结节样变化、淋巴结肿大等临床症状可初步诊断该 病,但其确诊需依赖实验室检测,特别是疾病处于潜伏期或前驱期时。而且患病 牛产生皮肤损伤的症状易与皮肤癣病、昆虫叮咬等易混淆;发病期,患病牛结节 处可呈现黏膜坏死、破溃等症状,需与口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛传染 性鼻气管炎等进行鉴别。此外,还存在无临床症状的隐性感染的情况,均需进行 实验室检测确诊。因此,开发快速、准确、简便的LSD特异性检测方法是防控该 病的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对 和探针的检测方法,从而实现对牛结节性皮肤病病毒特异、敏感、快速的检测。
本发明首先提供一种检测牛结节性皮肤病病毒的引物对和探针,引物对和探 针序列信息如下:
牛结节性皮肤病病毒检测正向引物LSD forward:
5′-CGATACACTCTCCRATATC-3′(SEQ ID NO:1)
牛结节性皮肤病病毒检测反向引物LSD reverse:
5′-AACGAGAAGTATGAATTAGC-3′(SEQ ID NO:2)
牛结节性皮肤病病毒检测探针LSD probe:
其中,检测探针LSD probe的5′端进行羧基荧光素FAM标记,3′端进行淬灭 基团Eclipse标记,下划线位置为标记的RNA位点。
上述引物和探针用于制备检测牛结节性皮肤病病毒的Cycleave荧光PCR检 测体系。
进一步,本发明还提供检测牛结节性皮肤病病毒核酸的Cycleave荧光PCR 方法,包括如下的步骤:
1)Cycleave荧光PCR反应体系配制
反应液每管25μL,含有2×Cycleave PCR反应液12.5μL,5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各0.6μL,5pmol/μL的LSD probe 0.8μL,双蒸水8.5μL, 待检测样品DNA模板2μL。其中,Cycleave PCR检测试剂盒(目录号:CY505A) 购自宝生物工程(大连)有限公司产品。
2)Cycleave荧光PCR反应体系扩增
检测反应条件设置为:95℃预变性10s;95℃变性5s,55℃退火10s, 72℃延伸20s(收集FAM信号),共40个循环。
3)结果判定
阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点,或可根据仪 器噪音情况进行调整。待检样品无Ct值并且无扩增曲线,结果判为阴性;待检 样品Ct值≤40.0,且出现典型的扩增曲线,结果判为阳性。
本发明所提供的Cycleave荧光PCR检测牛结节性皮肤病病毒的引物、探针及 方法,具有如下的技术优点:
1)灵敏度高:扩增模板的最低检出限可达1.13×100copies/μL,约合2copies/ 反应;2)特异性好:采用Cycling标记的荧光探针,特异性针对LSDV基因组产 生荧光扩增信号,经验证对同属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒,及常见的口蹄疫病 毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、蓝舌病病毒等相关牛病病毒,均无交叉反应;3) 快速高通量:检测速度快,加入样品后40分钟内即可完成整个扩增检测过程, 且根据荧光定量PCR仪的检测孔数量,可以一次性实现96~384个样品的同步 检测;4)操作简便:配置好的Cycleave PCR反应体系,置于荧光定量PCR仪中 即可完成整个扩增及结果判定过程,不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。
附图说明
图1:本发明扩增LSDV ORF024基因部分序列的引物和探针设计示意图, 其中引物探针设计区域由方框圈出。
图2:阳性质粒制备电泳结果图,其中泳道1:2000bp Marker;泳道2: LSDV/China/XJ/2019-1。
图3:Cycleave PCR灵敏度试验结果图,其中1:工作标准品1;2:工作标 准品2;3:工作标准品3;4:工作标准品4;5:工作标准品5;6:工作标准品 6;7:工作标准品7;8:工作标准品8;9:工作标准品9;10:阴性对照。
图4:Cycleave PCR标准曲线结果图,其中1:工作标准品1;2:工作标准 品2;3:工作标准品3;4:工作标准品4;5:工作标准品5;6:工作标准品6; 7:工作标准品7;8:工作标准品8。
图5:Cycleave PCR特异性试验结果图,其中1:工作标准品4;2:绵羊痘 病毒;3:山羊痘病毒;4:O型/A型口蹄疫病毒;5:牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 与传染性鼻气管炎病病毒;6:蓝舌病病毒;7:阴性对照。
具体实施方式
本发明采用的Cycleave荧光PCR是采用一对引物和一个嵌合有RNA位点的 DNA探针扩增模板,当探针与互补的目标DNA杂交时,在RNA位点连接处切割 探针,产生标记荧光,通过实时监测荧光信号实现检测目的。
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更清楚的理解,现对照附图详细说 明本发明的具体实施方式。
实施例1:引物及探针的筛选与设计
牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)属于羊痘病毒属,同 属还有山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)和绵羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV), 已有研究显示三种病毒间具有较高基因组同源性。
为了避免检测LSDV时出现假阳性,首先,从NCBI数据库中查找并下载已有 的全部27株LSDV基因组全序列(GenBank登录号:MN636843.1、MN636842.1、MN636841.1、MN636840.1、MN636839.1、MN636838.1、MK4418381、 MH646674.1、KX764645.1、KX764644.1、KX764643.1、MT992618.1、MT130502.1、 AF409137.1、MN995838.1、MN642592.1、MN072619.1、KX894508.1、MH893760.2、 KY829023.3、KY829023.3、KY702007.1、KX683219.1、MT130502.2、MT643825.1、 AF325528.1、AF409138.1),已有全部12株GTPV基因组全序列(GenBank登录 号:KX576657.1、AY077836.1、AY077835.1、MN072621.1、MN072620.1、 MH381810.1、KC951854.1、MW020570.1、MN072622.1、MN072625.1、MN072624.1、MN072623.1)和全部13株SPPV基因组全序列(GenBank登录号: MN072631.1、MN072630.1、MN072629.1、MN072628.1、MN072627.1、 MN072626.1、MW020571.1、MG000156.1、AY077834.1、AY077833.1、AY077832.1、 KT438551.1、KT438550.1)。
再利用生物信息学软件BLAST和Lasergene MegAlign,逐段将上述LSDV、 GTPV、SPPV基因组全序列进行比较,分析筛选了4个LSDV种特异性单核苷 酸多态性位点(singlenucleotide polymorphism,SNP),即ORF024基因Y51G与 A287G,ORF101基因A1671T与T1743C。针对上述的SNP位点,综合考虑SNP 位点两翼序列的保守性、碱基组成、GC含量、二级结构的形成、Tm值等因素, 设计了4组检测LSDV的Cycleave荧光PCR引物探针方案(表1)。
表1:LSDV种特异性SNP位点及引物探针组设计表
简并碱基Y=T/C,R=A/G;探针中加粗标记为LSDV特异性SNP位点,下划线为RNA碱基位点,U表示 尿嘧啶。
经过灵敏性、特异性验证后,本发明最终采用方案2所示的引物探针组合。 以LSDVNI-2490株(GenBank登录号:AF325528.1)作为参考株,设计引物用 于扩增LSDV ORF024基因第238~388位序列,设计探针含LSDV特异性SNP位点。 引物和探针设计区域见图1。其具体序列信息如下:
牛结节性皮肤病病毒检测正向引物LSD forward:
5′-CGATACACTCTCCRATATC-3′(SEQ ID NO:1)
牛结节性皮肤病病毒检测反向引物LSD reverse:
5′-AACGAGAAGTATGAATTAGC-3′(SEQ ID NO:2)
牛结节性皮肤病病毒检测探针LSD probe:
其中,牛结节性皮肤病病毒检测探针LSD probe针的5′端进行羧基荧光素 FAM标记,3′端进行淬灭基团Eclipse标记,下划线位置为标记的RNA位点。引 物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。
实施例2:筛选的引物对、探针的灵敏度实验
1、阳性质粒标准品的制备
1)阳性质粒的制备
中国流行株LSDV/China/XJ/2019-1病毒由中国动物卫生与流行病学中 心分离、鉴定、保存及提供。采用商品化病毒基因组提取试剂盒按说明方 法提取病毒DNA模板,进行常规PCR扩增,具体步骤如下:
反应液每管25μL,含有2×Platinum Super Green PCR Mix反应液12.5 μL,10pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各1μL,双蒸水8.5μL,提取的 DNA模板2μL。其中,Platinum Super Green PCR Mix检测试剂盒(目录号: 00766789)购自Invitrogen公司。二是反应条件设置:95℃预变性5min,95℃ 变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s,35个循环,72℃最后延伸5min; 4℃保存。
PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳(见图2),回收目的片段并连接pMD19-T 载体,转化DH5α大肠杆菌,经PCR鉴定阳性菌株送青岛睿博兴科公司测序。 测序结果符合预期作为阳性菌种,提取其质粒作为阳性质粒。阳性质粒含ORF024 基因第238~388位序列,及LSDV特异性SNP位点A287G。序列如下:
(注:下划线区域表示引物匹配位置;下划线斜体区域为探针匹配位置;阴 影为SNP位点位置;加粗为RNA碱基位置)
2)阳性质粒标准品的制备
采用超微量紫外分光光度计测定阳性质粒OD260/OD280比值及浓度 (单位ng/μL),根据公式:质粒拷贝数(copies/μL)=(质粒浓度×10-9×稀释倍数×6.02×1023)/(660道尔顿/碱基×碱基数),计算其拷贝数。
经测定阳性质粒OD260/OD280比值为1.98,初始浓度为250.9ng/μL,拷 贝数为1.13×1011copies/μL,进行10倍梯度稀释,制备标准品分别为:工作标 准品1,含有1.13×107copies/μL阳性质粒非传染性DNA片段;工作标准品2, 含有1.13×106copies/μL阳性质粒非传染性DNA片段;工作标准品3,含有 1.13×105copies/μL阳性质粒非传染性DNA片段;工作标准品4,含有1.13×104 copies/μL阳性质粒非传染性DNA片段;工作标准品5,含有1.13×103copies/μL 阳性质粒非传染性DNA片段;工作标准品6,含有1.13×102copies/μL阳性质粒 非传染性DNA片段;工作标准品7,含有1.13×101copies/μL阳性质粒非传染性DNA片段;工作标准品8,含有1.13×100copies/μL阳性质粒非传染性DNA片 段;工作标准品9,含有1.13×10-1copies/μL阳性质粒非传染性DNA片段。
2、灵敏度检测的实施
采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系,对系列工作标准品和阴性 对照(成分为无核酸酶水)进行检测并绘制标准曲线,具体步骤如下:
(1)反应体系配制:反应液每管25μL,含有2×Cycleave PCR反应液12.5 μL,5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各0.6μL,5pmol/μL的LSD probe 0.8μL,双蒸水8.5μL,待检测样品DNA模板2μL。其中,Cycleave PCR检测试 剂盒(目录号:CY505A)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(2)反应条 件设置:95℃预变性10s;95℃变性5s,55℃退火10s,72℃延伸20s(收 集FAM信号),共40个循环。(3)结果的判定:阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点,或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品 无Ct值并且无扩增曲线,结果判为阴性;待检样品Ct值≤40.0,且出现典型的 扩增曲线,结果判为阳性。
结果如图3所示,工作标准品1~8均出现典型扩增曲线,检测结果为阳性; 工作标准品9和阴性对照无扩增曲线,检测结果为阴性。结果显示,本方法最低 检出限为工作标准品8,灵敏度为2.26copies/反应。选取梯度稀释的工作标准品 1~8绘制标准曲线,如图4所示,标准曲线的线性方程为:y=-2.723x+38.388, R2=0.999,扩增效率E=132.9%。结果说明本发明所使用的引物对和探针具有极 高的扩增效率,且在检测范围内模板浓度与检测Ct值间具有良好线性关系。
实施例3重复性实验
采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系,对实施例2中制备的工作 标准品2~6进行三次Cycleave荧光PCR重复检测,计算批间变异系数;在同次 Cycleave荧光PCR中重复检测三次,计算批内变异系数,具体步骤如下:
(1)反应体系配制:反应液每管25μL,含有2×Cycleave PCR反应液12.5 μL,5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各0.6μL,5pmol/μL的LSD probe 0.8μL,双蒸水8.5μL,待检测样品DNA模板2μL。其中,Cycleave PCR检测试 剂盒(目录号:CY505A)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(2)反应条 件设置:95℃预变性10s;95℃变性5s,55℃退火10s,72℃延伸20s(收 集FAM信号),共40个循环。(3)结果判定:阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点,或可根据仪器噪音情况进行调整。重复检测工 作标准品2~6,分别统计3次批间和3次批内重复检测的Ct值,按变异系数 CV%=(标准偏差SD/平均值Mean)×100%,计算批间和批内重复Ct值 变异系数。
结果如表2所示,工作标准品2~6批内重复性检测和批间重复性检测 Ct值变异系数均小于2%,表明本方法具有良好的可重复性。
表2:批内和批间重复性检测结果表
实施例4特异性实验
采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系,对牛病毒性腹泻/黏膜病病 毒等相关病毒样品,健康牛来源全血、唾液、皮肤样品,以及阳性对照(成分为 实施例2中制备的工作标准品4)和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测, 具体步骤如下:
(1)特异性样品制备:健康牛来源全血、唾液、皮肤样品,由国家外来动 物疫病研究中心采集与提供;山羊痘病毒AV41株、口蹄疫病毒O型和A型 (FMDV/Re-O/MYA98/JSCZ2013+FMDV/Re -A/WH/09株)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒和牛传染性鼻气管炎病毒(NMG株 +LY株)来源市售商品化疫苗;绵羊痘病毒GL株DNA模板由中国农业科学院 兰州兽医研究所惠赠;蓝舌病病毒DNA模板由军事医学科学院军事兽医研究所 惠赠。全血、唾液、病毒样品直接采用商品化DNA提取试剂盒于全自动核酸提 取仪上取核酸;皮肤样品先进行匀浆,再采用商品化DNA提取试剂盒于全自动 核酸提取仪上取核酸,获得的核酸样本于-20℃保存备用。(2)反应体系配制: 反应液每管25μL,含有2×Cycleave PCR反应液12.5μL,5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各0.6μL,5pmol/μL的LSD probe 0.8μL,双蒸水8.5μL, 待检测样品DNA模板2μL。其中,Cycleave PCR检测试剂盒(目录号:CY505A) 购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(3)反应条件设置:95℃预变性10s; 95℃变性5s,55℃退火10s,72℃延伸20s(收集FAM信号),共40个循 环。(4)结果的判定:阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的 最高点,或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无Ct值并且无扩增曲线, 结果判为阴性;待检样品Ct值≤40.0,且出现典型的扩增曲线,结果判为阳性。
结果如图5,阳性对照出现典型扩增曲线,阴性对照未出现扩增信号,实验 成立。本实验中检测的相关山羊痘病毒、绵羊痘病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹 泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒样本核酸均未出现扩增信号, 表明本方法检测上述病毒均无交叉反应,具有良好的特异性。
实施例5实际临床样本的检测
采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系,对采集自临床疑似感染动 物的血液等类型临床样品,以及阳性对照(成分为实施例2中制备的工作标准品 4)和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测;同时参照国家标准《牛结节性 皮肤病诊断技术》(GB/T39602-2020)方法对临床样品进行平行检测。具体步 骤如下:
(1)临床样品的制备:临床疑似感染牛结节性皮肤病牛的全血、唾液、皮 肤结节样品共计89份,由内蒙古自治区动物疫病预防与控制中心采集与提供。 全血、唾液样品直接采用商品化DNA提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸; 结节样品先进行匀浆,再采用商品化DNA提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取 核酸,获得的核酸样本于-20℃保存备用。
(2)Cycleave荧光PCR方法:一是反应体系配制:反应液每管25μL,含 有2×Cycleave PCR反应液12.5μL,5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各 0.6μL,5pmol/μL的LSD probe 0.8μL,双蒸水8.5μL,待检测样品DNA模板2μL。 其中,Cycleave PCR检测试剂盒(目录号:CY505A)购自宝生物工程(大连) 有限公司产品。二是反应条件设置为:95℃预变性10s;95℃变性5s,55℃退火 10s,72℃延伸20s(收集FAM信号),共40个循环。三是结果的判定:阈值 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点,或可根据仪器噪音情 况进行调整。待检样品无Ct值并且无扩增曲线,结果判为阴性;待检样品Ct值 ≤40.0,且出现典型的扩增曲线,结果判为阳性。
(3)国标方法:参照国家标准《牛结节性皮肤病诊断技术》(GB/T 39602-2020)中通用牛结节性皮肤病病毒核酸检测方法进行。
检测结果见表3,Cycleave荧光PCR方法检出牛结节性皮肤病病毒核酸阳 性53份、阴性36份;国标方法检出牛结节性皮肤病病毒核酸阳性49份、阴性 40份。与国标方法相比,Cycleave荧光PCR方法敏感性为100%,特异性为90%, 总符合率为95.5%。将与国际方法检测结果不一致的4份样品,回收扩增片段并 测序鉴定,证实均为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性。结果显示,Cycleave荧光PCR 方法与国标荧光定量PCR方法检测结果间符合率良好,同时具有更高的阳性检 出率。
表3:Cycleave荧光PCR与国标方法平行检测临床样品结果表
综上,本发明的引物对、探针及使用该引物对、探针的Cycleave荧光PCR 方法特异敏感且简便快速,适用于我国牛结节性皮肤病的检测。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种检测牛结节性皮肤病的Cycleave 荧光PCR方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgatacactc tccratatc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacgagaagt atgaattagc 20
<210> 3
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggccgcc 7
Claims (6)
1.一种检测牛结节性皮肤病病毒的引物对和探针,其特征在于,所述的引物对,其正向引物的序列为SEQ ID NO:1,反向引物的序列为SEQ ID NO:2;探针的序列为SEQ ID NO:3。
2.如权利要求1所述的引物对和探针,其特征在于,所述的探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记,3′端进行淬灭基团Eclipse标记。
3.权利要求1所述的引物对和探针在制备检测牛结节性皮肤病病毒的Cycleave荧光PCR检测制品中的应用。
4.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的制品,其特征在于,所述的制品为Cycleave荧光PCR检测制品,其中包含有权利要求1所述的引物对和探针。
5.一种检测牛结节性皮肤病病毒的方法,其特征在于,所述的方法中使用权利要求1所述的引物对和探针进行检测。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的方法包括如下的步骤:
1)Cycleave荧光PCR反应体系配制
反应液每管25μL,含有2×Cycleave PCR反应液12.5μL,5pmol/μL的LSD forward和LSDreverse各0.6μL,5pmol/μL的LSD probe 0.8μL,双蒸水8.5μL,待检测样品DNA模板2μL;
2)Cycleave荧光PCR反应体系扩增
检测反应条件设置为:95℃预变性10s;95℃变性5s,55℃退火10s,72℃延伸20s来收集FAM信号,共40个循环;
3)结果判定
待检样品无Ct值并且无扩增曲线,结果判为阴性;待检样品Ct值≤40.0,且出现典型的扩增曲线,结果判为阳性。
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