CN110699490A

CN110699490A - 非洲猪瘟病毒cd2v基因的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN110699490A
Application number: CN201911098454.6A
Authority: CN
Inventors: 黄震巨; 李沛; 李春燕; 林晓; 滕丽琼
Original assignee: Nanning Zhongce Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanning Zhongce Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110699490B

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法。本发明的引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其中，所述特异性荧光探针的5’端方向标记有荧光报告基团，3’端方向标记有荧光淬灭基团。本发明所提供的引物探针组及试剂盒可以在等温条件下快速、方便、高效、特异地检测样本中是否是否感染非洲猪瘟野毒株或CD2V缺失株，在现场不需要复杂仪器和专业设备，适宜于POCT。

Description

非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus，ASFV)引起的家猪、野猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率最高可达100％，世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASFV具有耐酸不耐碱、耐冷不耐热的特点，健康猪与患病猪或污染物直接接触是非洲猪瘟最主要的传播途径，猪被带病毒的蜱等媒介昆虫叮咬也可传播。当前还没有针对非洲猪瘟的有效治疗方法或疫苗，一旦爆发，唯一的控制策略就是隔离和清除受感染的动物。

目前，我国研究者根据非洲猪瘟病毒在中国的流行株的基因型别，开发了一系列的重组弱毒株疫苗，通过生物技术方法，将ASFV中的某个或某几个基因进行敲出，制备出基因缺失疫苗。已经报道的ASFV毒力基因和免疫抑制基因主要包括TK(K196R)、9GL(B119L)、CD2V(EP402R)、DP148R、NL(DP71L)、UK(DP96R)和多基因家族360和505(MGF 360/505)以及免疫逃逸相关基因A238L、A179L、A224L、DP71L、MGF360/505、I329L、K205R、D96R、DP148R、A276R、D96R和EP153R等，其中，CD2V基因缺失的疫苗是研究最多的一种基因缺失ASFV疫苗。

由于当前对非洲猪瘟病毒CD2V基因缺失的疫苗的研究数据还不充分，其具体的免疫效果仍有待进一步的研究，在疫苗使用过程中需要对ASFV野毒株和CD2V基因缺失的疫苗株进行区分鉴定，从而实现对使用疫苗的有非洲猪瘟症状的猪群的感染源进行正确的鉴别。

发明内容

基于上述背景介绍，本发明的目的是提供一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及检测方法。

作为本发明的第一方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测引物探针组。

作为优选，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其中，所述特异性荧光探针的5’端方向标记有荧光报告基团，3’端方向标记有荧光淬灭基团。

作为优选，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

作为本发明的第二方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测试剂盒。

作为优选，所述试剂盒包括非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测引物探针组，其中，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其中，所述特异性荧光探针的5’端方向标记有荧光报告基团，3’端方向标记有荧光淬灭基团。

作为优选，所述试剂盒还包括A Buffer、B Buffer、RAA干粉试剂、非洲猪瘟病毒CD2V基因标准品和ddH₂O中至少一种。

作为优选，所述A Buffer为20％PEG，B Buffer为280mM MgAc。

作为优选，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

作为优选，所述非洲猪瘟病毒标准品为含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区基因部分序列的阳性质粒。

作为优选，所述含有非洲猪瘟病毒CD2V保守区基因部分序列的阳性质粒如SEQ IDNO.13所示。

作为本发明的第三方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测方法。

作为优选，所述检测方法包括如下步骤：提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用本发明所述的试剂盒进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样本，确定待测样本是否含有非洲猪瘟病毒CD2V基因。

具体如下：提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在非洲猪瘟病毒CD2V基因的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、B Buffer和ddH₂O存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述非洲猪瘟病毒CD2V基因正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述非洲猪瘟病毒CD2V基因反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，其5’端方向标记有荧光报告基团，3’端方向标记有荧光淬灭基团。

作为优选，所述实时荧光RAA反应程序为：39℃，1min；39℃，30s，共计40个循环。

本发明所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为非洲猪瘟病毒CD2V基因阳性结果，则当前样本为非洲猪瘟野毒株感染样本；当待测样本无明显扩增曲线且CT值≥40，判断为对非洲猪瘟病毒CD2V基因阴性结果，则当前样本为非洲猪瘟CD2V疫苗猪或阴性猪只；当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且35＜CT值＜40，判为可疑，需要排除环境污染造成的不准确结果后，再次检测，若样本的结果仍然为35＜Ct值＜40，以阴性对照作为参照标准，检测阴性对照的Ct值，若阴性对照Ct值≥40，则该待测样本判为阳性。

作为本发明的第四方面，本发明提供了本发明所述的引物探针组、试剂盒在用于检测非洲猪瘟病毒CD2V基因中的应用。本发明所提供的引物探针组及试剂盒可以快速、方便、高效、特异地检测样本中是否含有非洲猪瘟病毒及鉴别是否为CD2V基因缺失，适宜于临床鉴别。

本发明的有益效果为：

(1)快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；

(2)操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和，整个反应简单快速，特别适合在有大量样品的非实验室检测场所进行；

(3)高特异性：本发明与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪蓝耳病病毒(PPRSV)均无交叉反应；

(4)高灵敏度：检测灵敏度可达到10²copies/μL；

(5)鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合POCT现场检测。

附图说明

图1为本发明中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。

图2为RAA检测方法对FHV的灵敏度实验图，从左到右依次为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL 5个的阳性标准品的扩增结果。

图3为RAA检测方法对非洲猪瘟病毒的特异性实验图。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若无特别指明，实施例中采用的方法为本领域通用技术，所有的设备和原料等均为本行业常用产品，可从市场中购得。

实施例1：非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测引物探针组的设计

本研究参考GenBank上已公布的非洲猪瘟基因CD2V基因序列，使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对。大量实验表明，不同的引物对恒温扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本研究针对非洲猪瘟病毒CD2V基因初步设计了四组引物探针：ASFV-CD2V-1、ASFV-CD2V-2、ASFV-CD2V-3和ASFV-CD2V-4(引物序列如表1所示)，这些序列可以和非洲猪瘟病毒CD2V基因的相应序列特异性结合，其中，上述四组引物扩增目的片段的大小分别为107bp、110bp、172bp和197bp，阳性样本扩增曲线如图1所示。

表1 ASFV-CD2V-1、ASFV-CD2V-2、ASFV-CD2V-3和ASFV-CD2V-4序列信息

由图1结果可见，ASFV-CD2V-1的扩增曲线最优，出峰最早，荧光强度最高(纵坐标值)并且有明显的指数期和平台期。其它引物探针曲线上升峰高较低，出峰时间较晚，相较于ASFV-CD2V-1表现较差。说明ASFV-CD2V-1引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。其中，该特异性荧光探针的5’端方向标记有荧光报告基团，3’端方向标记有荧光淬灭基团，具体为：5’端方向起第29位碱基T标记有FAM荧光报告基团，3’端方向起第16位碱基T标记有BHQ1荧光淬灭基团，荧光报告基团FAM与荧光淬灭基团BHQ1之间隔1个碱基位置，该碱基用于修饰四氢呋喃残基。

实施例2：非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测试剂盒及检测方法

本实施例提供一种ASFV-CD2V的RAA恒温荧光检测试剂盒，包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer(20％PEG)、B Buffer(280mM MgAc)、RAA干粉试剂、非洲猪瘟病毒标准品和ddH₂O。

RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μLBsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

本实施例所述的引物混合液中，所述的正向引物碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的碱基序列SEQ ID No.2所示，正向引物和反向引物的摩尔配比为1:1。

本实施例提供的非洲猪瘟病毒CD2V基因的特异性探针碱基序列如SEQ ID No.3所示，探针的5′端标记有FAM荧光报告基团，3′端标记有BHQ1荧光淬灭基团。

进一步地，本发明建立的方法中为了避免所用试剂失效或受到污染，以非洲猪瘟病毒标准品作为阳性对照，以ddH₂O作为阴性对照，其中，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生，阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生。

本实施例提供的非洲猪瘟病毒标准品为含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区序列的阳性质粒，该质粒的碱基序列如下：

ATGATAATACTTATTTTTTTAATATTTTCTAACATAGTTTTAAGTATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAGTAATATTACTAATGATAATAATGATATAAATGGAGTATCATGGAATTTTTTTAATAATTCTTTTAATACACTAGCTACATGTGGAAAAGCAGGTAACTTTTGTGAATGTTCTAATTATAGTACATCAATATATAATATAACAAATAATTGTAGCTTAACTATTTTTCCTCATAATGATGTATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGGAATCAAATAATTAATTATACAATAAAATTATTAACACCTGCTACTCCCCCAAATATCACATATAATTGTACTAATTTTTTAATAACATGTAAAAAAAATAATGGAACAAACACTAATATATATTTAAATATAAATGATACTTTTGTTAAATATACTAATGAAAGTATACTTGAATATAACTGGAATAATAGTAACATTAACAATTTTACAGCTACATGTATAATTAATAATACAATTAGTACATCTAATGAAACAACACTTATAAATTGTACTTATTTAACATTGTCATCTAACTATTTTTATACTTTTTTTAAATTATATTATATTCCATTAAGCATCATAATTGGGATAACAATAAGTATTCTTCTTATATCCATCATAACTTTTTTATCTTTACGAAAAAGAAAAAAACATGTTGAAGAAATAGAAAGTCCACCACCTGAATCTAATGAAGAAGAACAATGTCAGCATGATGACACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAGAACCATTACTTCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGTATAATACACCTATTTACTACATGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACCCATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCCTCCACCCAAACCATGTCCGCCACCCAAACCATGTCCTCCACCTAAACCATGTCCTTCAGCTGAATCCTATTCTCCACCCAAACCACTACCTAGTATCCCGCTACTACCCAATATCCCGCCATTATCTACCCAAAATATTTCGCTTATTCATCGTAGATAGAATTATTTAA(SEQ ID No.13)。

应用本发明的一种实施方式的试剂盒对样本中的非洲猪瘟病毒CD2V基因进行检测，包括如下：

1、样品核酸的提取

1.1、核酸提取：采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，按照说明步骤提取待测样本基因组DNA。

2、RAA反应体系的配置：每个检测样品对应一个RAA反应干粉管(每个RAA反应干粉管中含RAA干粉试剂2ug)，其中，引物混合液和特异性探针被冻干在RAA干粉试剂中，浓度分别为400nmol/L和120nmol/L。

每个RAA反应干粉管中所加入的反应组分和体积如表2所示。

表2反应体系配置表:

RAA反应体系组分	体积(μL)
		A Buffer	45.5
B Buffer	2.5
		DNA模板	2
总体积	50

3、将配置好反应体系的RAA反应管放置于ABI7500扩增仪中，按照下列程序进行RAA扩增：39℃，1min；39℃，30s，共计40个循环。每个循环收集FAM通道的荧光。

4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定非洲猪瘟病毒CD2V基因阳性或阴性结果。

判定结果：待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对非洲猪瘟病毒CD2V基因阳性结果，则当前样本为非洲猪瘟野毒株感染样本；当待测样本无明显扩增曲线且CT值≥40，判断为对非洲猪瘟病毒CD2V基因阴性结果，则当前样本为非洲猪瘟CD2V疫苗猪或阴性猪只；当待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且35＜CT值＜40，判为可疑，需要排除除环境污染造成的不准确结果后，再次检测，若结果仍然35＜Ct值＜40，应参照阴性对照Ct值，若阴性对照Ct值≥40，则该待测样本为阳性。

在本发明的另一种实施方式中，引物混合液和特异性探针不是以冻干的形式存在，而是在使用时被加在RAA干粉试剂中形成扩增体系，本实施方式中，每个检测样品对应一个RAA反应干粉管(每个RAA反应干粉管中含RAA干粉试剂2ug)，每个RAA反应干粉管中所加入的反应组分和体积可以如表3所示。

表3反应体系配置表:

RAA反应体系组分	体积(μL)
		A Buffer	12.5
B Buffer	2.5
		引物混合液	4.0
特异性荧光探针	0.6
		ddH<sub>2</sub>O	28.4
DNA模板	2
		总体积	50

实施例3：应用本发明的试剂盒进行实际样本检测

为验证本发明所述引物、探针、试剂在实际情况下能正常使用，于是模拟实际情况，使用本发明的引物、探针、试剂对实际样本进行检测。

实际样本为患病猪口鼻拭子及患病猪血样(血清，血浆以及全血)，共12份。检测结果与已知PCR检测结果一致，符合率100％。

说明本发明的引物探针组合试剂盒具有在具备温控功能的荧光检测仪器中，在体温条件下(37℃-39℃)对非洲猪瘟CD2V基因进行快速、实时、灵敏、准确、便捷的检测的优点。

实施例4：本发明的试剂盒灵敏度试验

使用非洲猪瘟病毒标准品质粒，提取阳性质粒，并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度，并将其分别稀释到10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL6个浓度梯度进行灵敏度试验，每个梯度重复三次。

检测结果如图2所示，从左到右依次为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的RAA荧光扩增试剂和检测的灵敏度可达10²copies/μL，表明本发明的RAA恒温荧光检测试剂盒和检测方法对非洲猪瘟病毒CD2V基因的诊断具有高度的灵敏性。

实施例5：本发明的试剂盒的特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，分别对病毒样本进行检测，分析本试剂盒对非洲猪瘟病毒和近源病毒的检测情况。

检测结果表明：仅非洲猪瘟病毒样品(含有CD2V基因的ASFV)出现正常扩增，阴性对照(ddH₂O)及猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪蓝耳病病毒(PPRSV)样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明，本发明RAA恒温荧光检测试剂盒能特异性扩增出非洲猪瘟病毒中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

序列表

<110> 南宁众册生物科技有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacatgttga agaaatagaa agtccacc 28

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatggttct ctgggagatg gttcatgtat 30

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accacctgaa tctaatgaag aagaacaatt cagcatgatg acacc 45

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtattcttc ttatatccat cataactt 28

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaggcttagg aagtaatggt tctctgggag 30

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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catgttgaag aaatagaaag tccaccacct gatctaatga agaagaac 48

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aacatgttga agaaatagaa agtccacc 28

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<212> DNA

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aagtaatggt tctctgggag atggttcatg 30

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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accacctgaa tctaatgaag aagaacaatt cagcatgatg acacc 45

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaagcatca taattgggat aacaataag 29

<210> 11

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<212> DNA

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ggcttaggaa gtaatggttc tctgggagat 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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catgttgaag aaatagaaag tccaccacct gatctaatga agaagaac 48

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<211> 1084

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60

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tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600

acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660

cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720

atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780

tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840

tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900

cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960

ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020

cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcatcgtag atagaattat 1080

ttaa 1084

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其中，所述特异性荧光探针的5’端方向标记有荧光报告基团，3’端方向标记有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

3.一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括A Buffer、B Buffer、RAA干粉试剂、非洲猪瘟病毒标准品和ddH₂O中至少一种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述A Buffer为20％PEG，B Buffer为280mM MgAc。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白或30ng/μL Rad51、30ng/μLBsu DNA聚合酶、100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒标准品为含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区基因部分序列的阳性质粒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述含有非洲猪瘟病毒CD2V基因保守区基因部分序列的阳性质粒如SEQ ID NO.13所示。

9.一种非洲猪瘟病毒CD2V基因的RAA恒温荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用如权利要求3～8任一项所述的试剂盒进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样本，确定待测样本是否含有非洲猪瘟病毒。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光RAA反应程序为：39℃，1min；39℃，30s，共计40个循环。