CN111575289A

CN111575289A - 干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA及其应用

Info

Publication number: CN111575289A
Application number: CN202010451161.8A
Authority: CN
Inventors: 王喆明
Original assignee: Zhejiang Puti Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Puti Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2020-08-25

Abstract

本发明公开了一种干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA，所述siRNA是下述双链RNA序列之一：1)正义链、反义链为SEQ ID NO:6‑7的双链RNA序列；2)正义链、反义链为SEQ ID NO:8‑9的双链RNA序列；3)正义链、反义链为SEQ ID NO:10‑11的双链RNA序列；4)正义链、反义链为SEQ ID NO:12‑13的双链RNA序列；5)正义链、反义链为SEQ ID NO:14‑15的双链RNA序列。本发明筛选出的siRNA序列分子，可以高效地沉默/抑制靶基因的生物表达。为预防和治疗非洲猪瘟病毒传染，快速研制抗病毒核酸药物提供了有效技术和手段。

Description

干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及RNA干扰抗病毒领域，具体涉及一种干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA及其应用。

背景技术

非洲猪瘟首次于1921年的肯尼亚被发现，是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种在养殖猪中高度易感的烈性传染病，其致死率接近100％，目前尚没有任何疫苗和有效的抗病毒药物来预防或治疗这种疾病。非洲猪瘟在撒哈拉以南非洲地区流行多年，60年代在西欧大流行，在过去十多年中，它又在高加索，俄罗斯联邦和东欧的许多国家蔓延，特别是2018年非洲猪瘟疫情首次在中国被发现，2019年9月中国生猪产量较上年同期下降了40％左右，经济损失非常大，同时也对人民生活造成了很大影响。据世界动物卫生组织报道，在2018-2019年由于非洲猪瘟造成全球性的经济损失估计在140亿元左右。目前切断非洲猪瘟传染的途径只有隔离健康牲畜和扑杀感染牲畜的方法，并且病毒在自然环境中的存活能力很强，在猪群中传染性非常快，所以有效的治疗非洲猪瘟的手段是目前应对疫情的迫切需要。

非洲猪瘟病毒是一种大型复杂的双链DNA病毒，是已知的唯一一种虫媒DNA病毒，它的长度在170-193kbp左右，具有二十面体的多层结构。非洲猪瘟病毒编码超过160个蛋白，其中还有很多蛋白的生物功能未能明确，一部分基因编码蛋白作为生物抑制剂来调节宿主细胞的生物进程，进而影响到宿主免疫系统对病毒的免疫应答，这也是目前没有有效疫苗和药物来控制/治疗非洲猪瘟的重要因素。

本发明使用RNA干扰技术(RNAi技术)开发新一代siRNA核酸药物。RNA干扰技术是一种强大的手段，它可以用来抑制基因功能，比如通过破坏相应基因的mRNA，抑制基因的转录或者抑制mRNA转译成相应蛋白来实现。RNA干扰技术能够在基因层面将靶标蛋白清除，极大提高生物能源和资源的利用度，同时也极大减少了宿主体内正常生理活动所受的影响。

此技术通过将非洲猪瘟病毒在转录，复制和组装过程中涉及到的关键mRNA沉默并降解，使其失去原有的功能，从而导致病毒的完整生物过程被打断，来抑制病毒的增长并最终消除病毒。本发明干扰非洲猪瘟病毒基因表达的设计方案有下列两种：一是抑制病毒的高度保守的关键基因，比如DNA聚合酶编码基因，RNA聚合酶编码基因等等，直接将病毒的复制和转录过程破坏引起病毒凋亡；另一种是抑制病毒的一些特殊蛋白的编码基因，比如MGF505-7R基因，MGF360-15R基因，EP402R等等，这些特殊蛋白可以抑制迟缓宿主体内的免疫应答，或者引起高毒性和高传播性，从而使得病毒能够从宿主的免疫系统逃逸并导致高致死率，通过抑制这些蛋白基因，可以延缓病毒增殖，恢复宿主的免疫应答，使得病毒能够被宿主的自身免疫系统清除。非洲猪瘟病毒的基因序列已经明确，可以通过选择关键的基因序列片段来设计抗病毒的专有siRNA药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA及其应用，以解决现有技术的不足。

本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了一种干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA，所述siRNA对应的靶序列为非洲猪瘟病毒MGF 505-7R基因、MGF 360-15R基因、EP402R基因、H359L基因或O174L基因序列上连续的19-25个核苷酸。

进一步地，所述靶序列为序列表中的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示序列。

进一步地，，所述siRNA是下述双链RNA序列之一：

1)正义链为序列表中的SEQ ID NO:6，反义链为序列表中的SEQ ID NO:7的双链RNA序列；

2)正义链为序列表中的SEQ ID NO:8，反义链为序列表中的SEQ ID NO:9的双链RNA序列；

3)正义链为序列表中的SEQ ID NO:10，反义链为序列表中的SEQ ID NO:11的双链RNA序列；

4)正义链为序列表中的SEQ ID NO:12，反义链为序列表中的SEQ ID NO:13的双链RNA序列；

5)正义链为序列表中的SEQ ID NO:14，反义链为序列表中的SEQ ID NO:15的双链RNA序列。

进一步地，双链RNA 3′端还含有dTdT结构。

本发明靶序列为非洲猪瘟病毒MGF 505-7R，MGF 360-15R，EP402R，H359L，O174L基因序列上连续的19-25个核苷酸，优选的含有19个核苷酸，GC含量控制在30％-52％之间，避免出现超过4个连续的A或T。其中，MGF505-7R的靶序列对应MGF 505-7R基因的1258-1276序列，MGF360-15R的靶序列对应MGF360-15R基因的541-559序列，EP402R的靶序列对应EP402R基因的871-889序列，H359L的靶序列对应H359L基因的952-970序列，O174L的靶序列对应O174L基因的284-302序列，其中对于非目的基因的连续匹配碱基数不超过15个碱基对。3’端dTdT结构增加了siRNA的稳定性。

本发明第二方面提供了上述干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用

本发明的有益效果：

本发明公开了有效干扰非洲猪瘟病毒基因表达的靶序列和siRNA序列。针对非洲猪瘟病毒的关键蛋白基因DNA聚合酶编码基因O174L，RNA聚合酶编码基因H359L，和重要调节蛋白基因MGF 505-7R，MGF 360-15R，EP402R，根据基因干扰技术的靶点适用性，确定了上述基因的靶序列，然后根据siRNA的设计规则，设计并筛选出相应的siRNA序列分子，可以高效地沉默/抑制靶基因的生物表达。

本发明填补了非洲猪瘟的基因药物开发上的空白，并且siRNA药物开发具有时间短，效率高，专一性强的特点。

本发明为预防和治疗非洲猪瘟病毒传染，快速研制抗病毒核酸药物提供了有效技术和手段。

附图说明

图1为pEGFP-N1质粒结构图。

图2为O174L基因、H359L基因、MGF 505-7R基因、MGF 360-15R基因、EP402R基因转染NIH-3T3细胞后的PCR扩增图。

图3为O174L-siRNA、H359L-siRNA、MGF505-7R-siRNA、MGF360-15R—siRNA、EP402R-siRNA对基因的抑制率。

图4为O174L-siRNA、H359L-siRNA、MGF505-7R-siRNA、MGF360-15R—siRNA、EP402R-siRNA对蛋白的相对表达量。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

如无特别说明，下述试验方法均为常规方法，实验材料均可从商业公司获取。

实施例1：非洲猪瘟病毒O174L基因、H359L基因、MGF505-7R基因、MGF360-15R基因、EP402R基因siRNA的设计和合成

参考siRNA设计原则，从目标mRNA的起始密码子AUG下游50-100nt处搜索理想的siRNA序列，其3′端相邻21nt序列作为候选靶点，GC含量控制在30％-52％之间，避免出现超过4个连续的A或T，根据相应靶位点分别设计和合成一组siRNA，并通过Blast功能与猪基因组序列进行比对，确保与猪基因无同源性。最终选择MGF505-7R的靶序列对应MGF505-7R基因的1258-1276序列，MGF360-15R的靶序列对应MGF360-15R基因的541-559序列，EP402R的靶序列对应EP402R基因的871-889序列，H359L的靶序列对应H359L基因的952-970序列，O174L的靶序列对应O174L基因的284-302序列，其中对于非目的基因的连续匹配碱基数不超过15个碱基对。

其序列如下表所示：

实施例2：体外构建非洲猪瘟病毒O174L基因、H359L基因、MGF505-7R基因、MGF360-15R基因、EP402R基因

以非洲猪瘟病毒O174L基因(序列号：41901960)、H359L基因(序列号：41901976)、MGF505-7R基因(序列号：41902799)、MGF360-15R基因(序列号：41902808)、EP402R基因(序列号：41901921)为目标序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司在无病毒体系中合成寡核苷酸片段，片段末端两两互补，再经过PCR过程相互延伸，最终分别组装成完整的RO174L基因、H359L基因、MGF505-7R基因、MGF360-15R基因、EP402R基因。将组装好的RO174L基因、H359L基因、MGF505-7R基因、MGF360-15R基因、EP402R基因克隆至质粒pEGFP-N1质粒(如图1所示)，获得真核表达质粒pEGFP-RO174L、pEGFP-H359L、pEGFP-MGF505-7R、pEGFP-MGF360-15R、pEGFP-EP402R，经过测序分析，所获得的O174L基因、H359L基因、MGF505-7R基因、MGF360-15R基因、EP402R基因序列与非洲猪瘟病毒的O174L基因、H359L基因、MGF505-7R基因、MGF360-15R基因、EP402R基因序列一致，完全符合预期设计。

实施例3：细胞培养与体外构建的病毒基因转染

用含有10％(v/v)胎牛血清DMEM(高糖)培养基的培养瓶培养NIH-3T3细胞，将培养瓶置于37℃无菌CO₂细胞培养箱中。将大小均匀、状态良好的NIH-3T3细胞约1.2×10⁶分到6孔板中，并使其均匀分布。24小时后，将构建的pEGFP-O174L、pEGFP-H359L、pEGFP-MGF505-7R、pEGFP-MGF360-15R、pEGFP-EP402R质粒按照SuperFect Transfection转染说明书分别进行。转染6小时后，进行细胞换液1-2次，48小时后，收获细胞上清，45000转/分钟、4℃离心2小时，将离心到管底部的细胞用少量DMEM高糖培养基重悬。提取转染细胞的总DNA，经PCR分析结果发现，O174L基因、H359L基因、MGF505-7R基因、MGF360-15R基因、EP402R基因片段被成功扩增(如图2所示)，表明，体外构建的O174L基因、H359L基因、MGF505-7R基因、MGF360-15R基因、EP402R基因在宿主细胞中能正确转录靶基因。

实施例4：siRNA的转染

将已感染含有O174L基因、H359L基因、MGF505-7R基因、MGF360-15R基因、EP402R基因假病毒的NIH-3T3细胞约1.2×10⁴分到24孔板，24小时后进行转染。转染时按照lipofectamine RNAiMAX转染说明书进行。大孔上每孔siRNA终浓度为50nM，lipofectamineRNAiMAX加入1Ul。转染6小时后去掉细胞上清，加入新鲜DMEM高糖培养基培养24小时，之后将细胞分到96孔板中，转染48小时。

实施例5：实时荧光定量PCR检测siRNA对基因的抑制效果

分别收集实施例4的细胞，用trizol试剂提取总DNA，通过实时荧光定量PCR观察siRNA对基因的抑制效果，实时荧光定量PCR采用荧光定量PCR试剂盒(QIAGEN)，内参基因采用GAPDH。结果显示(如图3所示)，与阴性对照组相比，O174L-siRNA对O174L基因的抑制率为75.3％；H359L-siRNA对H359L基因的抑制率为82.6％；MGF505-7R-siRNA对H359L基因的抑制率为81.4％；MGF360-15R-siRNA对MGF360-15R基因的抑制率为87.3％；EP402R-siRNA对EP402R基因的抑制率为79.7％。

实施例6：流式细胞仪检测VeroE6细胞中RDRP、S蛋白的表达情况

siRNA转染后72小时，分别收集每孔内的NIH-3T3细胞，用胰酶消化细胞，加入5mlDMEM高糖培养基反复吹打，1000转/分钟离心5分钟，用PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)清洗2次后重悬于PBS中，用流式细胞仪在488nm激光波长下检测每孔细胞平均荧光强度及荧光阳性细胞比率，计算每孔细胞的总荧光强度。结果显示(如图4所示)，与阴性对照组相比，O174L-siRNA对DNA聚合酶的抑制率为74.8％；H359L-siRNA对RNA聚合酶的抑制率为80.5％；MGF505-7R-siRNA对MGF505-7R调节蛋白的抑制率为79.3％；MGF360-15R-siRNA对MGF 360-15R调节蛋白的抑制率为86.7％；EP402R-siRNA对EP402R调节蛋白的抑制率为77.9％。

序列表

<110> 浙江璞题生物科技有限公司

<120> 干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> MGF 505-7R-DNA(人工序列)

<400> 1

tatgaaagtg gaaggcaat 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> MGF 360-15R-DNA(人工序列)

<400> 2

tcaacaaacg cggaatctg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> EP402R-DNA(人工序列)

<400> 3

ccattacttc ctaagcctt 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> H359L-DNA(人工序列)

<400> 4

gaaatggtgt taaccatta 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> O174L-DNA(人工序列)

<400> 5

agacgtatca acttgatct 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> MGF 505-7R-siRNA正义链(人工序列)

<400> 6

uaugaaagug gaaggcaau 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> MGF 505-7R-siRNA反义链(人工序列)

<400> 7

auacuuucac cuuccguua 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> MGF 360-15R-siRNA正义链(人工序列)

<400> 8

ucaacaaacg cggaaucug 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> MGF 360-15R-siRNA反义链(人工序列)

<400> 9

aguuguuugc gccuuagac 19

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> EP402R-siRNA正义链(人工序列)

<400> 10

ccauuacuuc cuaagccuu 19

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> EP402R-siRNA反义链(人工序列)

<400> 11

gguaaugaag gauucggaa 19

<210> 12

<211> 19

<212> RNA

<213> H359L-siRNA正义链(人工序列)

<400> 12

gaaauggugu uaaccauua 19

<210> 13

<211> 19

<212> RNA

<213> H359L-siRNA反义链(人工序列)

<400> 13

cuuuaccaca auugguaau 19

<210> 14

<211> 19

<212> RNA

<213> O174L-siRNA正义链(人工序列)

<400> 14

agacguauca acuugaucu 19

<210> 15

<211> 19

<212> RNA

<213> O174L-siRNA反义链(人工序列)

<400> 15

ucugcauagu ugaacuaga 19

<210> 16

<211> 525

<212> DNA

<213> O174L基因(人工序列)

<400> 16

atgttaacgc ttattcaagg aaaaaaaatt gtaaatcact tacgttcccg acttgcgttt 60

gaatataatg gacaacttat aaaaatttta tcaaaaaaca tcgttgctgt tggtagttta 120

agacgcgaag agaaaatgct taatgacgtg gatcttctta ttattgttcc agaaaaaaaa 180

cttttaaaac acgtcctgcc caacattcgc ataaagggtc tttctttttc tgtaaaagtc 240

tgcggagaac gaaagtgtgt actttttatt gaatgggaaa aaaagacgta tcaacttgat 300

ctttttacgg ctttagccga ggaaaaacca tacgcaatat ttcattttac gggtcccgtt 360

tcttatctaa taagaattcg agccgcgtta aaaaaaaaga attataagct aaatcagtat 420

ggattattta aaaatcaaac tttagtacct ctaaaaatca ctactgaaaa agaacttatt 480

aaagaattag gatttacgta tcgcatacct aagaaacgtt tataa 525

<210> 17

<211> 1080

<212> DNA

<213> H359L基因(人工序列)

<400> 17

atggaaaaaa ttttccaaaa cgtggaaatc aaaccgtttt tgatagactt ttccaacccc 60

tttattaaaa atgcggccaa aagactattt cagctcgagg agcagttgcc cctcgtccca 120

gtcaatgttg ttatggactt taagggcatt agcagagccg cggtgcacgg cctgtcgcgg 180

gtcttgcaag atgaaattcc caattatatg ctagatatta agcccggtgg gtataagatc 240

gaggattcca cggacctgtt tatgacggaa caatttatta gaaaccgcat taatttcatt 300

ccgatttatg cgaaaaacga gacactggta tttgctctgc ggagtttaaa caatagctgt 360

gaggttaaaa ccatctatag ccgcgatctc attcaggtgg caggccctaa gcttaaatac 420

ccgattttta atcctacttt tgagattggc ttcctacaac ccggaaaatc gttgattata 480

gaggatatct atattaaaaa gggcatagga cgaaaacatg ccgcctttaa tcttgccgtt 540

aaaacacatt tttcccacct cgatattgag cagtacccaa cagataaaaa agaatatatg 600

gcgcttagtg gttacaaaca aagctctatg acctcagacc cgcgtcacca ccgcctgggg 660

ctttgctttc cagcggtgcc gctgccacat atcaatcagg ccgttcgcac gtatttaaaa 720

aacgcctgcc ggatcattat tggccgaatc caaagcattc aaaaaattta tgaaaacttt 780

gaagagccgc agccggaact tgtgctgttt tcgttggacg aggaaaaaac aaaggctatt 840

atcacgataa aggatgaaac tcatactatt ggaaatctgc taaaaacatg tatttatgaa 900

atgattcctg atattagctt tgtggggtat cagtgtgttc cccataagca agaaatggta 960

ttaacaatta ttcataaggc ctcacaagaa gatttgataa ctcttttaga aaaaagtatc 1020

cagaacatta tccaaacttt tcaaatcctt gaaaaaaatg ttgatgaact gattgcttaa 1080

<210> 18

<211> 1584

<212> DNA

<213> MGF505-7R基因(人工序列)

<400> 18

atgttctccc ttcaggacct ctgtcggaag aacaccttct tccttccaag tgattttagc 60

aagcataccc tgcatttgct ggggttatac tggaaggggc atggatctat ccaaaggata 120

aagaatgatg gtgtgcttat agagcatgat cttactcttt ccatcaatga agccttaatt 180

cttgcaggag aagagggaaa caatgaagta gtaaagctct tgttactatg ggaaggaaat 240

cttcattatg ccatcatagg agctttgagg actgagaact ataacctagt atgtgagtac 300

catagtcaaa ttcaggactg gcatgttctc ctccctttga ttcaagatcc agaaacattc 360

gaaaaatgtc atgatttaag ccttgaatgt gatctttcat gccttctcca acatgctgta 420

aaatataaca tgctttcgat tcttgttaaa tataaagagg atctactaaa tgtactattt 480

aggcaacaaa ttcaaggact atttatttta gcatgtgaaa atcggaagct tgagattctt 540

acgtggatgg gtcaaaatct gccaattcct gatcctgagc ctatttttag cattgctgtt 600

gtcacaaaag atttagaaat gttttcctta gggtacaaga ttgtttttga atacatggaa 660

aaccaaggac ttcatttaac ccaggtagtt cgtatggtta tgctaaatca tcactttggc 720

atggtaataa ataaaggact tttacccttt gtgctggaaa ttttaaatta tggtgggaat 780

gtaaatagag ccttatctta tgctgtcaca caaaataaaa gaaagatttt agaccatgtt 840

gttcgccaaa agaatatacc ccataaaacc attgaaagaa tgttgcatct ggctgtaaaa 900

aagcatgctc ccaggaaaac tctgaacttg ttactatctt acataaatta caaggtgaaa 960

aatgttaaaa agttgttaga acatgtagtg aaatacaact ctactcttgt gataagactc 1020

ttgttagaaa aaaagaaaaa cctgctggat gctactttga caagatatgt caaagattct 1080

acatactttc aggtgaaaga atttatgcaa gacttctcca tcagcccaga aaaattcatt 1140

aaaatagctg tgcgggaaaa gagaaatgtg ttgatcaagg gtatttctga agatatttgg 1200

gaaaatcccg cggaaagaat caggaatctt aagcagatag tgtgtaccat aaaatatgaa 1260

agtggaagac aattcctgat aaatatcatt cacaccattt accagagtta ttctttgaaa 1320

cctgaagaaa ttcttaaatt ggcaacattt tatgtcaaac acaatgcaac cacccatttt 1380

aaagatctct gcaaatatct ttggctgaac agaagaacag aaagtaagaa actgttttta 1440

gagtgcttgg aaattgctga taagaaggag tttcctgata ttaaaagtat tgtgagtgaa 1500

tacattaact atttgtttac tgcaggagct attaccaagg aagaaatcat gcaagcctat 1560

gctttggagt atgccatgta ttaa 1584

<210> 19

<211> 810

<212> DNA

<213> MGF360-15R基因(人工序列)

<400> 19

atggtgttga tacagttttt aacaggtttc ttctatttat atggtaagag actgttctca 60

attagcaaag ttatggacat gatatgtcta gactattata ccattcttcc tgctcctctg 120

gcgatgatgt tagcggcgag agtaaaaaac tatgacctca taaaaaaact gcacgaatgg 180

gaaatccctg ttgactatgc tttacttgta gtagatgatg tgccgactat cgactactgc 240

ttaagccttg gcgccatctc tccgactaga gcacaaaaaa gacgactgct aagggacacc 300

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aaaaacattc cttgtgatgt gcaatgcgaa agactgcaaa aaaccatcat aaaagaactg 420

gtatttaact gctccgtact gcttgaaatg atactgctct cagaaaaaga atatgcatac 480

gccctacact atgcagcaaa atataaccaa ttgcctatcc tgatgtattg ctggcaacaa 540

tcaacaaacg cggaatctgt tttgttaaaa acctgctgct ctgataaaaa catcaattgt 600

tttaatcatt gtatcatata tggcggcgcg cagaatctgg atgctgcaat gatagaagcg 660

gcaaaacacg atgcccgaat gctaatcaac tactgtgtca tgcttggtgg aagatcccta 720

aacgaagcaa gagaaacggc cattatattt ggacacattg aatgcgcaca tcattgctcg 780

agattgcaat cttacgccat gcgcgactaa 810

<210> 20

<211> 1158

<212> DNA

<213> EP402R基因(人工序列)

<400> 20

atgataataa agcttatttt tttaatatca tttaaaatga ttttaggtat tgattattgg 60

gttagtctta ataatacaat aattttagat agtaacatta ctattaataa tattactaat 120

actactaata atcctacatt aaatggtata ttttggaata tttataataa tagttataat 180

aatactttta atttacttac cacatgtggg aatacatata atatatgttc ttgttctaat 240

aattataata caatattatt taattataat accacaaata attgtagttt aattatttct 300

cctcatgatg aaaaaatttt tgatacgatg tttcagataa tatatttaac taataaaatt 360

aattatacaa tacgatggtt acaacctgtt gatcccccaa atatttcatt taatgatagt 420

aattctttaa taaaatgtga aaaaaataat ggaacaaata ctgaaatcta tttatattta 480

aatgatacat ttattaataa tactaatgaa aatgatctta aatattattg gaattgtagt 540

gagttaaact ataatattac agctacatgt attattaata atacacttaa ttcggcaaat 600

accacaaaag ttataaattg cactaatcta ttattaaaat ctgaccaaaa ttattttctt 660

aaaaacattc atacattatt ttatatcata atttttattg taactgggat aataataagt 720

atttttatag caatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 780

atagaaagtc catcgcctga atctaatgaa gaggaagaac aacaacatca tcatgacact 840

acttccatac atgaaccgtc tcccagagaa ccattacttc ctaagcctta cagtcgttat 900

cagtataata cacctattta ttacatgcgt ccctcaacac aacaactatt taaatcatat 960

tctttaccca aaccatgtcc cccacctaaa ccatgtcctc cacctaaacc atgtccccca 1020

cccaaaccat gtccctcacc agaatcatat ccctcacctg aaccatatcc tctactacct 1080

aatatcccac taccacccaa tatcccgcca ttatctacac aaaatatttc gcttattcac 1140

gtagatagaa ttatttaa 1158

Claims

1.一种干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA对应的靶序列为非洲猪瘟病毒MGF 505-7R基因、MGF 360-15R基因、EP402R基因、H359L基因或O174L基因序列上连续的19-25个核苷酸。

2.根据权利要求1所述的干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA，其特征在于，所述靶序列为序列表中的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示序列。

3.根据权利要求2所述的干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA是下述双链RNA序列之一：

4.根据权利要求3所述的干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA，其特征在于，双链RNA3′端还含有dTdT结构。

5.权利要求1-4任一权利要求所述的干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。