CN113249380B - 靶向covid-19新冠病毒的反义寡核苷酸、natac嵌合分子及其应用 - Google Patents

靶向covid-19新冠病毒的反义寡核苷酸、natac嵌合分子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了靶向COVID‑19新冠病毒的反义寡核苷酸、嵌合分子及其应用。本发明根据COVID‑19新冠病毒的刺突蛋白和包膜蛋白的RNA序列分别设计合成了靶向S蛋白和E蛋白的反义核酸，进一步将部分反义核酸与靶向核糖核酸酶L的功能基团2′‑5′腺嘌呤进行缀合得到嵌合分子。本发明所提供的反义寡核苷酸以及其反义核酸嵌合分子(NATAC分子)能明显降低靶标RNA的表达水平，同时显著激活细胞内核糖核酸酶L，β‑干扰素和白介素6的表达，表现出明显的药效优势且能够有效激活细胞中潜在的抗病毒免疫。因此，本发明提供的反义寡核苷酸或嵌合分子能够作为核酸药物应用于预防或治疗COVID‑19新冠病毒感染。

Description

靶向COVID-19新冠病毒的反义寡核苷酸、NATAC嵌合分子及其 应用
技术领域
本发明涉及反义寡核苷酸以及基于反义核酸的“核糖核酸内切酶水解靶向嵌合分子技术”(Nucleic Acid-hydrolysis TArgeting Chimeras,NATAC)的嵌合分子，尤其涉及靶向COVID-19新冠病毒的反义寡核苷酸以及用其制备的NATAC嵌合分子，本发明进一步涉及它们在制备预防或治疗COVID-19新冠病毒药物中的用途，属于COVID-19新冠病毒的预防或治疗领域。
背景技术
目前主要采用中和抗体或免疫疫苗来阻断病毒的复制和传播，但是还没有任何有效的药物可以用于新冠病毒病人的治疗。目标致病基因特异性的核酸药物具有序列特异性和高效性等疾病治疗的优势，以及易筛选、靶点可变和快速开发等特点，因而发展潜力巨大，具有重要的科学研究价值和应对突发病毒等潜力。
发明内容
本发明的目的之一是提供靶向COVID-19新冠病毒S蛋白或E蛋白的反义寡核苷酸；
本发明的目的之二是提供基于该反义寡核苷酸得到的NATAC嵌合分子；
本发明的目的之三是将所述的反义寡核苷酸以及NATAC嵌合分子应用于制备预防或治疗COVID-19新冠病毒的药物。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了靶向COVID-19新冠病毒S蛋白编码基因的反义寡核苷酸(5′→3′)，选自包含下述(1)-(8)中的所述的反义寡核苷酸中的任何一种或者根据靶基因序列在下述(1)-(8)中的所述的反义寡核苷酸3′或5′端增加或顺延1-3个碱基：
(1)5′-XpApApApApGpXpGpGpApApApApXpG-3′；
(2)5′-CpXpXpCpCpXpApApApCpApApXpCpX-3′；
(3)5′-ApApApGpXpApApCpApApXpXpApApA-3′；
(4)5′-XpApXpGpApXpXpGpXpApApApGpGpA-3′；
(5)5′-ApCpXpApCpXpCpXpGpXpApXpGpGpX-3′；
(6)5′-ApXpCpApGpXpApGpXpGpXpCpApGpC-3′；
(7)5′-ApXpApGpApCpApXpXpApGpXpApApA-3′；
(8)5′-ApApGpXpXpCpApApApApGpApApApG-3′；
其中，p指磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键位点；X是U或T；或者，A，C，G或X可以用2′-H，2′-OMe，2′-OCH2CH2OMe或2′-F等取代的任何一种核苷进行替换。
作为本发明优选的具体实施方案，所述反义寡核苷酸选自上述(4)-(6)所述反义寡核苷酸中的任何一种。
本发明还提供了靶向COVID-19新冠病毒的E蛋白编码基因的反义寡核苷酸(5′→3′)，选自包含下述(1)-(8)中所述反义寡核苷酸中的任何一种或者根据靶基因序列在下述(1)-(8)中所述反义寡核苷酸3′或5′端增加或顺延1-3个碱基：
(1)5′-XpApApCpApApXpApXpXpGpCpApGpC-3′；
(2)5′-CpApApXpApXpXpGpCpApGpCpApGpX-3′；
(3)5′-XpXpXpXpApApCpApCpGpApGpApGpX-3′；
(4)5′-ApGpCpGpCpApGpXpApApGpGpApXpG-3′；
(5)5′-CpGpCpApCpApCpApApXpCpGpApApG-3′；
(6)5′-ApApXpApCpCpApCpGpApApApGpCpA-3′；
(7)5′-ApApCpGpApApXpGpApGpXpApCpApX-3′；
(8)5′-ApApApApGpApApGpXpApCpGpCpXpA-3′；
其中，p指磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键位点；X是U或T；或者，A，C，G或X可以用2′-H，2′-OMe，2′-OCH2CH2OMe或2′-F等取代的任何一种核苷进行替换。
本发明更进一步提供了靶向COVID-19新冠病毒S蛋白编码基因的NATAC(核糖核酸内切酶水解靶向嵌合分子技术)嵌合分子，由上述的反义寡核苷酸、连接臂序列以及核糖核酸酶L的激活剂组成；其中，通过连接臂序列将核糖核酸酶的激活剂与所述的反义寡核苷酸缀合在一起。
作为本发明优选的一种具体实施方案，所述的核糖核酸酶L的激活剂是p(A2-5)n，其中，A2-5为2′-5′磷酸二酯键连接的rA；n为3-6的任意整数。
作为本发明优选的一种具体实施方案，所述的连接臂序列是(PEG)m，其中，m指PEG单元(-OCH2CH2-)的数目为3-6个。
作为本发明最优选的一种具体实施方案，所述NATAC嵌合分子选自下述(1)-(5)中所述嵌合分子的任何一种：
(1)p-(A2-5)n-p-(PEG)m-p-XpApXpGpApXpXpGpXpApApApGpGpA；
(2)p-(A2-5)n-p-(PEG)m-p-ApCpXpApCpXpCpXpGpXpApXpGpGpX；
(3)p-(A2-5)n-p-(PEG)m-p-ApXpCpApGpXpApGpXpGpXpCpApGpC；
(4)p-(A2-5)n-p-(PEG)m-p-XpApApCpApApXpApXpXpGpCpApGpC；
(5)p-(A2-5)n-p-(PEG)m-p-CpApApXpApXpXpGpCpApGpCpApGpX；
其中，A2-5为2′-5′位磷酸二酯键连接的rA；p指磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键位点；X是U或T；或者，A，C，G或X可以用2′-H，2′-OMe，2′-OCH2CH2OMe或2′-F等取代的任何一种核苷进行替换；n为3-6的任意整数，m指PEG单元(-OCH2CH2-)的数目为3-6个。
本发明中所述的碱基“A”为“腺嘌呤”，所述的碱基“G”为“鸟嘌呤”，所述的碱基“C”为“胞嘧啶”，所述的碱基“U”为“尿嘧啶”，所述的碱基“T”为“胸腺嘧啶”。
根据降低靶标RNA表达水平的实验结果可见，本发明提供的反义核酸，尤其是NATAC嵌合分子，能明显降低靶标RNA的表达水平，同时显著激活细胞内RNase L，β-干扰素和白介素6的表达水平；假病毒感染抑制实验结果表明，本发明提供的NATAC嵌合分子，尤其是NATAC嵌合分子Chimera-S4，表现出明显的药效优势；浓度效应实验结果可见,40nM的嵌合分子Chimera-S4在Vero细胞中可有效降低SARS-CoV-2 S蛋白RNA表达水平至NC组的35％以下，同时，其上调RNase L的转录水平相比于4A组的数值也更高，可达到NC组的1.66倍；此外，本发明提供的NATAC嵌合分子Chimera-S4能够有效激活细胞中潜在的抗病毒免疫。
因此，本发明提供的反义寡核苷酸或NATAC嵌合分子能够应用于预防或治疗COVID-19新冠病毒感染。
本领域技术人员可按照本领域的常规制备方法将本发明提供的反义寡核苷酸或NATAC嵌合分子制备成核酸药物用于COVID-19新冠病毒感染的预防或治疗。
本发明整体技术方案详述
本发明首先根据COVID-19的新冠病毒的S蛋白和E蛋白的RNA序列，分别设计合成了8种靶向S蛋白和8种靶向E蛋白的反义核酸以及部分反义核酸与寡聚2′-5′腺嘌呤通过连接臂进行缀合得到5种NATAC嵌合分子(Chimera-S4,S5,S6以及Chimera-E1,E2)。
本发明将寡聚2′-5′腺嘌呤缀合的靶向S蛋白的反义核酸Chimera-S4,S5,S6在80nM给药浓度下，在细胞中评价靶基因S蛋白RNA的表达水平，结果显示三种缀合反义核酸Chimera-S4,S5,S6均能明显降低靶标S-RNA的表达水平至NC组的25％以下，基因敲除效率约为对照的未缀合2′-5′腺嘌呤的ASO-S4,S5,S6的2倍以上；同时，细胞内RNase L的表达水平会因嵌合体给药上调至NC组的2～4倍，而对照的ASO序列则不会引起细胞RNase L表达上调。
本发明进一步构建了COVID-19的新冠病毒的假病毒模型，在基于构建的假病毒模型中借助报告基因Firefly Luciferase和GFP在被感染细胞HEK293T-hACE2(高表达hACE2的HEK293T)中的表达水平反映接受给药的HEK293T细胞所包装出的病毒滴度。三种嵌合反义核酸药物Chimera-S4,S5,S6的病毒组装和细胞感染实验结果显示，40nM和80nM的Chimera-S4可引起Luciferase表达水平降低至NC组的24％和6％，效果明显优于Chimera-S5的数值(45％和14％)以及Chimera-S6的数值(50％和28％)。在倒置荧光显微照片中，40nM和80nM的Chimera-S4给药也可引起HEK293T-hACE2细胞中GFP荧光的明显变弱，其亮度低于等浓度的Chimera-S5和Chimera-S6组。根据假病毒感染抑制实验结果可见，Chimera-S4相对于Chimera-S5和S6出现了明显的药效优势，故后续选择Chimera-S4进行浓度效应的实验。
根据浓度效应的实验结果可见，20nM的嵌合反义核酸Chimera-S4在Vero细胞中可有效降低SARS-CoV-2 S蛋白RNA表达水平至NC组的20％，其敲低效果优于同浓度下的未缀合的ASO-S4组(88％)和4A组(42％)；同时，其上调RNase L的转录水平相比于4A组的数值(1.14倍)也更高，可达到NC组的1.66倍。类似的结果也在假病毒模型中得到印证，FireflyLuciferase的表达水平在40nM Chimera-S4给药后可被降低至NC组的24％；同等实验条件下其GFP表达的流式定量结果显示，Chimera-S4 40nM组GFP阳性率为29.07％，远低于NC组的81.46％，4A组的71.35％，ASO-S4组的69.06％，4A+ASO-S4物理混合组的65.70％。
本发明进一步选择具有干扰素分泌功能的人肺癌细胞A549作为细胞模型评价嵌合反义核酸药物诱导免疫因子的表达水平。根据试验结果可见，在40nM和80nM的嵌合反义核酸Chimera-S4给药条件下，A549细胞中IFN-βmRNA表达水平可被上调至NC组的5.9倍和26倍，对于IL-6mRNA表达水平来说，这些数值为2.0倍和7.5倍。两种细胞因子的表达均出现了Chimera-S4浓度依赖性的抬升，提示了细胞中潜在的抗病毒免疫被激活。
基于相同的NATAC嵌合体设计策略，本发明又合成靶向SARS-CoV-2E蛋白RNA的NATAC反义核酸Chimera-E1并评价了其敲除E蛋白RNA水平的药效。RT-qPCR结果显示，80nM的Chimera-E1给药浓度可有效降低新冠病毒E蛋白的RNA至NC组水平的16％，同时上调RNase L水平至NC组水平的1.26倍，随给药浓度的进一步提升至320nM，这种靶标降解和酶上调的效应会继续提升。
针对目前的新冠COVID-19，本发明提出了基于反义核酸的“核糖核酸内切酶水解靶向嵌合分子技术”(Nucleic Acid-hydrolysis TArgeting Chimeras,NATAC)，筛选和设计合成了一系列能靶向SARS-CoV-2病毒包膜蛋白(E蛋白)和刺突蛋白(S蛋白)的反义核酸嵌合药物，通过在反义核酸上连接靶向核酸酶L的功能基团2′-5′腺嘌呤(2-5A)，该核酸药物药物可招募内源性的核糖核酸酶L(RNase L)进而诱导靶标RNA的降解。NATAC反义核酸在20～80nM浓度下可显著降解Vero细胞中外源性的病毒E-RNA和S-RNA、在药效上明显优于非嵌合的反义核酸，并伴随着核酸酶因导向激活引起的转录水平抬高。在SARS-CoV-2假病毒模型中，靶向S蛋白的NATAC反义核酸在40nM浓度下能够明显抑制SARS-CoV-2假病毒感染高表达ACE2受体的293T细胞。上述核酸酶的激活不仅提升了传统反义核酸对靶mRNA的降解效率，还能在A549细胞中同时上调IFN-β和IL-6两种细胞因子的表达水平，显示出其在激活抗病毒免疫方面的潜在作用。这表明基于NATAC技术的反义核酸嵌合分子有望进一步用于SARS-CoV-2的核酸药物研究。
附图说明
图1 NATAC诱导SARS-CoV-2 RNA降解的示意图。
图2 ASO-E序列和4A序列的质谱表征结果。
图3 Chimera-S4,S5,S6和ASO-S4,S5,S6的质谱表征结果。
图4激活RNaseL的靶向新冠病毒SARS-CoV-2 RNA的缀合反义寡核苷酸4A-ASO；(A)4A-ASO缀合反义寡核苷酸抑制新冠病毒SARS-CoV-2复制增殖的示意图；(B)靶向新冠病毒SARS-CoV-2包膜蛋白(Envelope,E)RNA和刺突蛋白(Spike,S)RNA的缀合反义寡核苷酸结构示意图。
图5 Chimera-S4,S5,S6对新冠病毒SARS-CoV-2 S-RNA的药效活性比较；(A)Vero细胞中Chimera-S4/S5/S6(80nM,24h)作用下新冠病毒SARS-CoV-2的S-RNA转录水平；(B)Chimera-S4/S5/S6(80nM,24h)作用下细胞中RNase L的上调水平；未经给药或转染反义核酸ASO-S4/S5/S6的细胞作为对照组；(C)用于评价新冠病毒SARS-CoV-2的反义寡核苷酸的假病毒模型；(D,E)不同反义寡核苷酸缀合物Chimera-S4/S5/S6在假病毒模型中引起的病毒包装水平变化，这包括被感染的HEK293T-hACE2细胞中荧光素酶的表达水平(D)和绿色荧光蛋白的表达水平(E)；图片标尺为100μm，数据的统计方法为双尾t检验，*P＜0.033,**P＜0.002,***P＜0.001。
图6筛选Chimera-S4,S5,S6阶段中假病毒抑制实验的荧光和明场照片；(A)HEK293T细胞经外源质粒和寡核苷酸转染48小时后拍摄的各组GFP绿色荧光和明场照片，同NC相比，各组的核酸转染效率并未受到显著影响；图片标尺为100μm；(B)HEK293T-hACE2细胞经含假病毒的培养上清孵育48小时后拍摄的各组明场照片；图片标尺为100μm。
图7 Chimera-S4浓度效应评价阶段中假病毒抑制实验的荧光照片、明场照片及流式分析结果；(A,B,C)HEK293T细胞经外源质粒和寡核苷酸转染48小时后拍摄的各组GFP绿色荧光(A)、明场照片(B)和各组GFP绿色荧光流式定量结果(C)，同NC相比，各组的核酸转染效率并未受到显著影响；(D,E,F)HEK293T-hACE2细胞经含假病毒的培养上清孵育48小时后拍摄的各组GFP绿色荧光照片(D)、明场照片(E)和各组GFP绿色荧光流式定量结果(F)；图片标尺为100μm。
图8 Chimera-S4,ASO-S4,4A,ASO-S4+4A对新冠病毒SARS-CoV-2的S-RNA敲除和假病毒感染抑制的浓度效应评价；(A,B)上述寡核苷酸对新冠病毒SARS-CoV-2的S-RNA敲除和RNase L上调的浓度效应(24h)；(C,D,E)20nM，40nM或80nM浓度下上述寡核苷酸处理后的假病毒对HEK293T-hACE2细胞感染能力的评价(48h)；Blank，无假病毒质粒转染组；NC，假病毒质粒转染空白给药组；4A+ASO-S4，相同浓度物理混合组并共转染假病毒质粒组；图片标尺为100μm；数据的统计方法为双尾t检验，*P＜0.033,**P＜0.002,***P＜0.001。
图9 A549细胞转染Chimera-S4、ASO-S4,4A，ASO-S4+4A等寡核苷酸后，胞内IFN-β和IL-6mRNA表达水平的变化；数据的统计方法为双尾t检验，*P＜0.033,**P＜0.002,***P＜0.001。
图10靶向新冠病毒SARS-CoV-2的包膜蛋白(Envelope,E)RNA的反义寡核苷酸及其4A缀合物(Chimera-E1)对E-RNA的敲除及其对RNase L的上调；数据的统计方法为双尾t检验，*P＜0.033,**P＜0.002,***P＜0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实验例1反义寡核苷酸和嵌合序列的设计以及抑制SARS-CoV-2病毒的药效学实验
1实验方法
1.1嵌合序列设计
本发明根据SARS-CoV-2病毒的E蛋白和S蛋白的RNA基因序列(Gene ID:43740570,43740568)，结合E蛋白和S蛋白的RNA的二维结构特征，筛选出具有潜力的特定位点作为靶向位置的反义核酸序列，并验证其对相应靶基因的基因敲除的能力。在此基础上进一步通过PEG连接臂连接RNase L配体2′-5′腺嘌呤(A2-5)。同时，反义核酸相应的核苷酸可以为ATCG脱氧核苷酸或′2-OMe，2′-OCH2CH2OMe或2′-F取代的AUCG核苷酸，而整个寡核苷酸的核酸骨架为部分硫代或者全硫代。
根据COVID-19的新冠病毒的S蛋白和E蛋白的RNA序列，分别设计合成了8种靶向S蛋白和8种靶向E蛋白的反义核酸以及部分的反义核酸与2′-5′腺嘌呤缀合物，对部分位点进行磷酸骨架修饰和糖环修饰得到表1所示的5条嵌合序列(Chimera-S4,Chimera-S5,Chimera-S6以及Chimera-E1和Chimera-E2)。
表1 寡核苷酸序列信息及来源
Figure GDA0003794850850000091
Figure GDA0003794850850000101
注：A2-5为2′-5′磷酸二酯键连接的rA；p指磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键位点；U，A，C或G可以为2′-OMe取代修饰的核苷，也可是2′-OCH2CH2OMe或2′-F取代的核苷。n为3-6的任意整数，m指PEG单元(-OCH2CH2-)的数目为3-6个。
1.2序列合成
依照亚磷酰胺化学法，以相应的核苷酸亚磷酰胺单体为主要原料，通过固相合成仪合成所需的寡核苷酸。其中，为了得到反义核酸和A2-5的缀合物，需要将首先合成的反义核酸继续依次与PEG化的亚磷酰胺单体和A2-5亚磷酰胺单体反应。固相合成结束后，寡核苷酸需要经过在浓氨水或甲胺醇溶液中的固相切割和碱基脱保护，并通过后续的脱硅步骤除去A2-5核苷上的硅保护基，最终产物以HPLC进行纯化、ESI-MS进行表征。用于生物评价的序列均预先溶解在无酶水中并通过NanoDrop 2000于260nm处进行定量。
1.3质粒准备
细胞实验中将使用分别携带SARS-CoV-2-E基因及SARS-CoV-2-S基因的pCAG-FLAG质粒。
病毒实验中使用用于生产假病毒和构建HEK293T-hACE2细胞的质粒包括pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Spike,pLVX-hACE2-IRES-puro,pMD2G-VSVG,pspAX.2,pLenti-FLuc-GFP质粒。具体来说，SARS-CoV-2刺突蛋白对应的基因片段经公司(GenScript Inc.)合成后，通过
Figure GDA0003794850850000111
HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB)试剂盒被插入pcDNA 3.1质粒骨架进而构建出pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Spike质粒。hACE2基因片段由pMD18-T-hACE2质粒(Sino biological Inc.)克隆得到，随后该片段的两端被分别引入限制性内切酶XhoI和XbaI的识别位点并被克隆至慢病毒转移质粒pLVX-IRES-puro上，进而构建出pLVX-hACE2-IRES-puro。pMD2G-VSVG,pspAX.2和pLenti-FLuc-GFP质粒由实验室本身构建(CellChem.Biol.2020Oct 20；S2451-9456(20)30383-4)。
1.4细胞培养和转染方法
Vero细胞及A549细胞由含10％胎牛血清(PAN)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基(M&C)于含37℃、5％二氧化碳的孵箱中培养。Vero细胞以7.5×104个/孔的密度种于24孔板中(对于A549细胞，这一密度为1×105个/孔)，24h后开始接受外源的质粒及寡核苷酸序列共转染。该过程使用LipofectamineTM 2000(Invitrogen)为转染试剂，按其说明书操作给药，之后经6h孵育，将含转染试剂的上清更换为新鲜的DMEM培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)，另培养18h后再行检测。
HEK293T细胞及转基因细胞系HEK293T-hACE2由含10％胎牛血清(Gibco)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基(Gibco)培养。
1.5实时聚合酶链反应(RT-qPCR)
Vero细胞以7.5×104个/孔的密度种于24孔板中(对于A549细胞，这一密度为1×105个/孔)，将对应浓度的外源核酸和/或质粒通过Lipofectamine2000转染入细胞后于24h停止培养，以BioZol试剂(Bioer)按其说明书方法提取各孔中的总RNA，之后通过HiScriptIII 1st cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme Biotech)将总RNA逆转录为cDNA。实时聚合酶链反应通过GoTaq qPCR Master Mix(Promega)按其说明书方法完成，在QuantStudio 6Flex system(ABI)上完成检测。目的基因RNA表达水平通过ΔΔCt处理法获得，内参基因为GAPDH或18S。
1.6 SRB细胞活力实验
Vero细胞以2×104个/孔的密度种于96孔板中，将对应浓度的外源核酸和质粒通过LipofectamineTM 2000转染入细胞后于24h停止培养，弃培养上清，每孔加入预冷的10％三氯乙酸100μL，于4℃固定细胞1h。之每孔加入200μL去离子水重复洗涤4遍并使孔板自然晾干，再向每孔加入溶解在1％乙酸溶液中的4mg/mL的磺酰罗丹明B(SRB)100μL，室温孵育30min之后以1％乙酸溶液润洗各孔4遍并使孔板自然晾干,最终向每孔加入10mM Tris碱溶液(pH＝10.5)100μL，在酶标仪(SYNERGY H1,BioTek)上读取540nM处各孔光密度。
1.7 SARS-CoV-2假病毒的包装
构建携带SARS-CoV-2刺突蛋白的VSV假病毒的方法：HEK293T细胞被种于六孔板中并培养至50％密度时，每孔以LipofectamineTM 3000(Invitrogen)按其说明书方法共转染pLenti-FLuc-GFP质粒1.2μg，pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Spike质粒0.4μg，pspAX.2质粒0.4μg以及外源寡核苷酸0.3～1.1μg。孵育6h后，将含转染试剂的上清更换为新鲜的DMEM培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)。另经42h后，通过倒置荧光显微镜(Olympus)观察并记录细胞状态及其绿色荧光，之后收集各孔含有假病毒的培养上清并过0.45μm的滤膜(Pall)，滤液中的假病毒滴度进一步由流式细胞术和荧光素酶实验检测。
1.8假病毒感染及荧光素酶实验
荧光素酶的表达水平可反映上一步包装出的SARS-CoV-2假病毒滴度。HEK293T-hACE2细胞以5×103个/孔的密度种于黑色96孔透明底孔板中并培养24h，之后将各孔的培养上清更换为对应组别上一步得到的假病毒培养滤液，另培养48h。Firefly荧光素酶的表达水平由Bright GloTM luciferase assay system(Promega)进行检测定量，孔板由酶标仪(Tecan Infinite M2000 PRO)读取各孔数值。
1.9流式细胞术
SARS-CoV-2假病毒包装过程中的质粒转染效率由流式细胞术定量分析。具体来说，转染有pcDNA pLenti-FLuc-GFP,pcDNA 3.1-SARS-CoV-2-Spike,pspAX.2质粒以及外源寡核苷酸的HEK293T细胞经48h培养后，其GFP表达水平由CytoFLEX flow cytometer(Beckman)分析得到。
为了进一步确认SARS-CoV-2假病毒滴度，将HEK293T-hACE2细胞种于6孔板上，经24h培养后，将各孔的培养上清更换为1mL新鲜培养基与1mL对应组别上一步得到的假病毒培养滤液混合物，另培养48h，其GFP表达水平由CytoFLEX flow cytometer(Beckman)分析得到。
2.实验结果
2.1降低靶标S-RNA的表达水平的实验结果
相较于其它序列，ASO-S4,S5,S6这三条序列对靶标S-RNA在空间上具有更好的可及性和结合能力。因此，以上述三条序列为例，合成相应的4A缀合反义寡核苷酸用于靶向新冠病毒SARS-CoV-2的刺突蛋白(S蛋白)基因。根据图4A和图4B，在Vero细胞中评价80nM 2′-5′腺嘌呤缀合的靶向S蛋白的反义核酸嵌合分子Chimera-S4,S5,S6对靶基因S蛋白RNA的表达水平影响，活性结果显示三种缀合反义核酸的嵌合分子Chimera-S4,S5,S6均能明显降低靶标S-RNA的表达水平至NC组的20％以下，基因敲除效率约为对照的未缀合2′-5′腺嘌呤的ASO-S4,S5,S6的2倍以上(图5A)；同时，细胞内RNase L的表达水平会因嵌合体给药上调至NC组的2～4倍，而对照的ASO序列则不会引起细胞RNase L表达上调(图5B)。
2.2 Chimera-S4,S5,S6的假病毒感染抑制实验结果
假病毒模型(图5C)中被用于检测三种NATAC反义核酸药物Chimera-S4,S5,S6对病毒组装和其滴度的影响(图5-图6)。结果显示40nM和80nM的Chimera-S4可引起Luciferase表达水平降低至NC组的24％和6％，效果明显优于Chimera-S5的数值(45％和14％)以及Chimera-S6的数值(50％和28％)。在倒置荧光显微照片中，40nM和80nM的Chimera-S4给药也可引起HEK293T-hACE2细胞中GFP荧光的明显变弱，其亮度低于等浓度的Chimera-S5和Chimera-S6组。因此，假病毒感染抑制实验中，Chimera-S4相对于Chimera-S5和S6出现了明显的药效优势，后续实验选择Chimera-S4进行浓度效应的实验。
2.3 Chimera-S4的浓度效应实验结果
根据图7A和图7B可见,20nM的嵌合反义核酸Chimera-S4在Vero细胞中可有效降低SARS-CoV-2 S蛋白RNA表达水平至NC组的20％，其敲低效果优于同浓度下的未缀合的ASO-S4组(88％)和4A组(42％)；同时，其上调RNase L的转录水平相比于4A组的数值(1.14倍)也更高，可达到NC组的1.66倍，类似的结果也在假病毒模型中得到印证，Firefly Luciferase的表达水平在40nM Chimera-S4给药后可被降低至NC组的14％(图7C)；同等实验条件下，其GFP表达的流式定量结果(图7D)显示，Chimera-S4 40nM组GFP阳性率为29.07％，远低于NC组的81.46％，4A组的71.35％，ASO-S4组的69.06％，4A+ASO-S4物理混合组的65.70％。
2.4反义核酸药物Chimera-S4诱导免疫因子的表达水平实验结果
选择具有干扰素分泌功能的人肺癌细胞A549作为模型评价NATAC反义核酸药物诱导免疫因子的表达水平。根据图9的结果可见，在40nM和80nM的NATAC反义核酸的嵌合分子Chimera-S4给药条件下，A549细胞中IFN-βmRNA表达水平可被上调至NC组的5.9倍和26倍，对于IL-6mRNA表达水平来说，这些数值为2.0倍和7.5倍。两种细胞因子的表达均出现了Chimera-S4浓度依赖性的抬升，提示了细胞中潜在的抗病毒免疫被激活。
2.5 Chimera-E1敲除E蛋白RNA水平的药效试验结果
基于相同的嵌合体设计策略，本发明又合成靶向SARS-CoV-2E蛋白RNA的NATAC反义核酸Chimera-E并评价了其敲除E蛋白RNA水平的药效。
RT-qPCR结果显示，80nM的Chimera-E1给药浓度可有效降低新冠病毒E蛋白的RNA至NC组水平的16％，同时上调RNase L水平至NC组水平的1.26倍，随给药浓度的进一步提升至320nM，这种靶标降解和酶上调的效应会继续提升(图10)；本发明在针对另一病毒结构靶点使用相同的降解策略时，Chimera-E1依旧有较好的药效和明显的浓度效应，说明应用该策略有一定的广泛性。

Claims (2)

1.靶向COVID-19新冠病毒S蛋白或E蛋白编码基因的NATAC嵌合分子，其特征在于，选自(1)-(4)中的任何一种：
(1) p-(A2-5)n-p-(PEG)m-p-UpApUpGpApUpUpGpUpApApApGpGpA；
(2) p-(A2-5)n-p-(PEG)m-p-ApCpUpApCpUpCpUpGpUpApUpGpGpU；
(3) p-(A2-5)n-p-(PEG)m-p-ApUpCpApGpUpApGpUpGpUpCpApGpC；
(4) p-(A2-5)n-p-(PEG)m-p-UpApApCpApApUpApUpUpGpCpApGpC；
其中，A2-5为2＇-5＇磷酸二酯键连接的rA；p指磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键位点；n为3-6的任意整数，m指PEG单元(-OCH2CH2-)的数目为6个。
2.权利要求1所述的NATAC嵌合分子在制备预防或治疗COVID-19新冠病毒药物中的用途。
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