CN102921003B - 稳定化免疫调控性rna(simra)化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及稳定化免疫调控性RNA(SIMRA)化合物。更具体地,本发明提供新型稳定化寡核糖核苷酸作为免疫调节剂用于免疫疗法应用的治疗用途。本发明提供了新的基于RNA的寡核糖核苷酸,其具有改善的核酸酶和RNA酶稳定性,而且具有经由TLR7和/或TLR8的免疫调控活性。

Description

稳定化免疫调控性RNA (SIMRA)化合物

[0001] 本申请是申请日为2008年7月7日、申请号为200880106124.0 (国际申请号为PCT/US2008/069335)、发明名称为“稳定化免疫调控性RNA(SMRA)化合物”的发明专利申请的分案申请。

[0002] 相关申请

[0003] 本申请要求2007年7月9日提交的美国临时申请流水号60/948,529 ;2007年8月22日提交的美国临时申请流水号60/957,195 ;2007年10月19日提交的美国临时申请流水号60/981,161 ;和2007年12月20日提交的美国临时申请流水号61/015,284的权益。通过提及而将这些申请的内容完整收入本文。

发明领域

[0004] —般而言,本发明涉及免疫学和使用寡核糖核苷酸作为免疫调控剂的免疫疗法应用的领域。更具体地,本发明涉及免疫调控性RNA组合物和使用它们经由Toll样受体8 (TLR8)、Toll样受体7 (TLR7)及TLR7和TLR8 二者调控免疫应答的方法。

[0005] 发明背景

[0006] 基于应答中牵涉的细胞子集,免疫应答牵涉先天性和适应性应答两者。例如,经典的细胞介导的功能(诸如迟发型超敏感性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活化)中牵涉的T辅助(Th)细胞是Thl细胞,而作为B细胞活化的辅助细胞牵涉的Th细胞是Th2细胞。免疫应答的类型受到响应抗原暴露而生成的细胞因子和趋化因子的影响。细胞因子通过影响T辅助细胞I (Thl)和T辅助细胞2 (Th2)的平衡(其直接影响发生的免疫应答的类型)而为控制免疫应答提供一种手段。若平衡朝向更高数目的Thl细胞,则发生细胞介导的免疫应答,包括细胞毒性T细胞(CTL)活化。在平衡朝向更高数目的Th2细胞时,则发生体液的或抗体的免疫应答。这每一种免疫应答导致不同的一组细胞因子自Thl和Th2细胞分泌。由Thl和Th2细胞分泌的细胞因子的差异可能是这两种T细胞子集的不同生物学功能的结果。

[0007] Thl细胞牵涉身体对抗原(例如病毒感染、细胞内病原体、和肿瘤细胞)的先天性应答。对抗原的初始应答可以是自抗原呈递细胞(例如活化的巨噬细胞和树突细胞)分泌IL-12和伴随的Thl细胞活化。活化Thl细胞的结果是某些细胞因子(例如IL-2、IFN-Y和其它细胞因子)的分泌和伴随的抗原特异性CTL的活化。已知Th2细胞响应细菌、寄生物、抗原和变应原而活化,并且可经由分泌某些细胞因子(例如IL-3、IL-4、IL-5、IL_6、IL-9、IL-10、IL-13和其它细胞因子)和趋化因子而介导身体的适应性免疫应答(例如免疫球蛋白生成和嗜曙红细胞活化)。这些细胞因子中某些的分泌可导致B细胞增殖和抗体生成升高。另外,这些细胞因子中的某些可刺激或抑制其它细胞因子的释放(例如IL-10抑制自Thl细胞分泌IFN- Y和自树突细胞分泌IL-12)。最后,Thl和Th2细胞之间的平衡及响应选定的刺激物而释放的细胞因子和趋化因子能在身体的免疫系统如何响应疾病中具有重要的作用。例如,IFN-α可抑制丙型肝炎,而MIP-1a和ΜΙΡ_1 β (分别也称为CCL3和CCL4)可抑制HIV-1感染。Thl/Th2免疫应答的最佳平衡呈现使用免疫系统治疗和预防多种疾病的机会。

[0008] 在哺乳动物中,可以通过例如引入细菌或含有非甲基化CpG 二核苷酸的合成DNA来诱导Thl免疫应答,该免疫应答源自于特定寡核苷酸序列(例如非甲基化的CpG)被呈递给某些免疫细胞上称为样式识别受体(PRR)的受体。这些PRR中的某些是Toll样受体(TLR)。

[0009] 在响应微生物感染而诱导先天性免疫应答中紧密牵涉TLR。在脊椎动物中,TLR由已知识别病原体相关分子样式的十种蛋白质(TLR1至TLR10)的一个家族组成。在这十种蛋白质中,已知TLR3、7、8、和9位于细胞内的内体中,而且识别核酸(DNA和RNA )和小分子诸如核苷和核酸代谢物。已知TLR3和TLR9分别识别存在于病毒的和细菌的和合成的DNA中的核酸诸如dsRNA和非甲基化CpG 二核苷酸。已经显示了,细菌DNA活化免疫系统,并产生抗肿瘤活性(Tokunaga T等,J.Natl.Cancer Inst.(1984)72:955-962;Shimada S 等,Jpn.H cancer Res,1986,77,808-816;YamamotoS 等,Jpn.J.Cancer Re s.,1986,79,866-7 3 ; Me s s i na, J 等,J.1mmunol0.(1991) 147:1759-1764)。使用含有CpG 二核苷酸的反义寡核苷酸的其它研究已经显示了免疫应答的刺激(Zhao Q 等,B1chem.Pharmacol.1996,26,173-82)。随后的研究显示了 TLR9识别存在于细菌的和合成的DNA中的非甲基化CpG基序(Hemmi H等,Nature.(2000) 408:740-5)。对含有CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其它修饰也能影响它们经由TLR9起作用和调控免疫应答的能力(参见例如Zhao等,B1chem.Pharmacol.(1996)51:173-182;Zhao 等,B1chem Pharmacol.(1996)52:1537-1544;Zhao等,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.(1997)7:495-502;Zhao 等,B10rg.Med.Chem.Lett.(1999)9:3453-3458;Zhao 等,B10rg.Med.Chem.Lett.(2000) 10:1051-1054;Yu等,B10rg.Med.Chem.Lett.(2000) 10: 2585-2588 ; Yu 等,B10rg.Med.Chem.Lett.(2001) 11:2263-2267;及 Kandimalla 等,B10rg.Med.Chem.(2001)9:807-813)。另外,结构活性关系研究已经容许鉴定如下的合成基序和新的基于DNA的结构,它们诱导的特异性免疫应答序型(profile)与那些源自于非甲基化CpG 二核苷酸的截然不同(KandimallaER 等,Proc Natl Acad Sci USA.(2005) 102:6925-30.Kandimalla ER 等,Proc NatlAcad Sci USA.(2003) 100:14303-8.Cong YP 等,B1chem B1phys Res Commun.(2003)310:1133-9.Kandimalla ER等,B1chem B1phys Res Commun.(2003)306:948-53.Kandimalla ER 等,Nucleic Acids Res.(2003)31:2393-400.Yu D 等,B10rg Med Chem.(2003) 11:459-64.Bhagat L 等,B1chem B1phys Res Commun.(2003)300:853-61.Yu D等,Nucleic Acids Res.(2002) 30:4460-9.Yu D 等,J Med Chem.(2002) 45:4540-8.Yu D等,B1chem B1phys Res Commun.(2002)297:83-90.Kandimalla ER等,B1conjug Chem.(2002) 13:966-74.Yu D, K 等,Nucleic Acids Res.(2002)30:1613—9.Yu D 等,B10rgMed Chem.(2001)9:2803-8.Yu D 等,B10rg Med Chem Lett.(2001) 11:2263-7.Kandimalla ER 等,B10rg Med Chem.(2001)9:807-13.Yu D 等,B10rg Med Chem Lett.(2000) 10:2585-8.Putta MR 等,Nucleic Acids Res.(2006)34:3231-8)。然而,直到最近,TLR7和TLR8的天然配体仍是未知的。

[0010] 已经显示了,TLR7和8识别病毒的和合成的单链RNA及小分子,包括多种核苷(Diebold, S.S.等,Science v:303,1529-1531 (2004))。Diebold 等(Science, 303:1529-1531 (2004))显示了,对流感病毒的IFN-α应答要求流感基因组RNA的内体识别及通过TLR7和MyD88的信号传导,而且鉴定了 ssRNA为一种TLR7配体。某些合成化合物,即咪唑喹诺酮(imidazoquinolones)、咪喹莫特(imiquimod) (R-837)和雷西莫特(resiquimod) (R-848)是 TLR7 和 TLR8 的配体(Hemmi H 等,(2002)Nat Tmmunol3:196-200; Jurk M等,(2002)Nat Immunol3:499)。另外,已经显示了某些鸟苷类似物诸如脱氣_G、7_硫-8-氧-G(TOG)、和7-稀丙基-8-氧-G (洛索立宾(1xoribine))在高浓度时活化 TLR7(Lee J 等,Proc Natl Acad Sci USA.2003,100:6646-51)。然而,还已知这些小分子例如咪喹莫特经由其它受体起作用(Schon MP等,(2006) J.1nvestDermatol., 126, 1338-47)。

[0011] TLR7或TLR8识别和潜在地广泛范围的刺激性ssRNA分子缺乏任何已知的特定ssRNA基序提示,TLR7和TLR8能识别自身的和病毒的RNA两者。最近显示了,某些富含⑶的寡核糖核苷酸在与N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐(DOTAP)或其它脂质剂复合时是免疫刺激性的,并且经由TLR7和TLR8起作用(Heil等,Science, 303:1526-1529(2004) ; Lipford 等,W003/086280; Wagner 等,W098/32462)。然而,RNA 分子已经被使用了很多年,例如作为核酶和更新近地,作为siRNA和微小RNA,而且作为核酶、siRNA、和微小RNA采用的RNA含有⑶二核苷酸。另外,已经显示了,多种这些RNA分子在脂质存在的情况中经由TLR刺激而引起免疫应答(Kariko等,Immunity (2005) 23:165-75;MaZ 等,B1chem B1phys Res Commun., (2005)330,755-9)。然而,这些 RNA 分子的不稳定性阻碍了许多领域(例如人类疾病的预防和治疗)中使用和应用这些分子的进展。

[0012] 含有核糖或脱氧核糖的寡核苷酸和寡脱氧核苷酸已经在极其多种领域中使用,包括但不限于诊断探测、PCR引发、基因表达的反义抑制、siRNA、微小RNA、适体、核酶、和基于Toll样受体(TLR)的免疫治疗剂。最近,许多出版物已经证明了寡脱氧核苷酸作为免疫调控剂的用途,以及它们在对许多疾病诸如变态反应、哮喘、自身免疫、癌症和传染病的免疫疗法应用中单独的或作为佐剂的用途。

[0013] DNA寡核苷酸受到TLR9识别,而RNA寡核苷酸受到TLR7和/或TLR8识别的实情最可能是由于DNA和RNA之间的结构构造差异。然而,DNA和RNA之间的化学差异也使DNA在化学和酶方面远比RNA更稳定。

[0014] RNA被普遍存在的胞外核糖核酸酶(RNA酶)快速降解,这确保少许的(若有的话)自体ssRNA到达抗原呈递细胞。外切核酸酶对核酸的降解主要是3’ -核酸酶消化的,及较小比例经由5’ -外切核酸酶作用的。在外切核酸酶消化外,RNA还能被RNA酶的内切核酸酶活性降解。目前为止,基于RNA的分子不得不与脂质复合来提供针对核酸酶的稳定性。

[0015] 虽然这些核糖核酸酶提供预防自身免疫反应性的必要功能,但是它们还给为用于免疫疗法而设计的任何合成ssRNA分子呈现了一个实质性问题,即核糖核酸酶会快速降解合成的和天然的ssRNA两者。为了克服此障碍,已经如下尝试了保护ssRNA分子免于降解,即在脂质体中包囊ssRNA,用聚乙撑亚胺将其缩合(condense),或将其与诸如^[1-(2,3-二油酰氧基)-丙基]-队队^三甲基铵甲基硫酸盐(DOTAP)等分子复合。然而,这些保护措施是对仍然不稳定的ssRNA应用的第二手措施,而且这些保护措施对ssRNA(天然的或合成的)的体内效力和免疫调控活性的影响仍然不清楚。

[0016] Agrawal等(11/697,422)记载了一类新的SIMRA组合物。然而,开发别的化合物仍然是一项挑战,所述化合物保留裸RNA,使得其继续被识别为TLR7和/或TLR8的配体,同时改善其稳定性,使得它能成为在体内有用的分子。理想地,可以经由设计天性稳定的基于RNA的分子来应对此挑战,所述分子能充当新型免疫治疗剂,其会在许多临床相关应用中找到应用,诸如在共施用时改善疫苗接种的效果或者在引起或增强免疫应答有益时,治疗和/或预防疾病,例如癌症、自身免疫性病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引起的疾病。

[0017] 发明概述

[0018] 在第一个方面,本发明提供了新型稳定化免疫调控性RNA(“SIMRA”)化合物(下文有进一步定义)及其用于诱导和/或增强免疫应答的用途。依照本发明的新型化学实体提供了诱导和/或增强免疫应答的化合物,其在诱导免疫应答方面实质上更有效且对于降解实质上更不敏感。依照本发明的方法使得能够为免疫疗法应用使用SIMRA来改变细胞因子和/或趋化因子序型。

[0019] 在第一个方面的一个实施方案中,本发明提供了一种作为TLR8激动剂的SIMRA化合物。

[0020] 在第一个方面的另一个实施方案中,本发明提供了一种作为TLR7和TLR8 二者激动剂的SIMRA化合物。

[0021] 在第一个方面的又一个实施方案中,本发明提供了一种作为TLR7激动剂的SIMRA化合物。

[0022] 在第一个方面的又一个实施方案中,本发明提供了一种作为佐剂的SIMRA化合物。

[0023] 在第二个方面,本发明提供了药物组合物。这些组合物包含本发明的任一种SIMRA组合物和生理学可接受的或药学可接受的载体。

[0024] 在第三个方面,本发明提供了一种用于在脊椎动物中产生免疫应答的方法,该方法包括给所述脊椎动物施用药学有效量的至少一种依照本发明的SIMRA化合物。

[0025] 在第四个方面,本发明提供了一种用于治疗性处理患有会受益于诱导和/或增强免疫应答的疾病或病症(例如癌症、自身免疫性病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引起的疾病)的脊椎动物的方法,该方法包括给患有此类病症或疾病的患者施用药学有效量的至少一种依照本发明的SIMRA化合物。

[0026] 在第五个方面,本发明提供了一种用于在脊椎动物中预防会受益于诱导和/或增强免疫应答的疾病或病症(例如癌症、自身免疫性病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引起的疾病)的方法,该方法包括给易患此类病症或疾病的脊椎动物施用药学有效量的至少一种依照本发明的SIMRA化合物。

[0027] 在第六个方面,本发明提供了一种如下的方法,即分离能够生成细胞因子或趋化因子的细胞(例如免疫细胞、PBMC),在标准细胞培养条件下培养此类细胞,用至少一种本发明的SIMRA化合物离体处理此类细胞,使得所分离的细胞生成或分泌水平升高的细胞因子或趋化因子,并给需要细胞因子或趋化因子疗法以预防或治疗疾病的患者施用或再施用经处理的细胞。

[0028] 在本发明这个方面的一个进一步的实施方案中,给需要细胞因子或趋化因子疗法以预防或治疗疾病的患者施用与一种或多种SMRA化合物组合的分离的、经SMRA处理的细胞。

[0029] 具体地,本发明涉及下述:

[0030] 1.一种SMRA化合物,其选自由SMRA#1至SMRA#189组成的组。

[0031] 2.一种组合物,其包含项I的SMRA化合物和生理学可接受载体。

[0032] 3.一种用于在脊椎动物中产生免疫应答的方法,该方法包括给所述脊椎动物施用依照项I的SIMRA化合物。

[0033] 4.一种用于治疗性处理患有会受益于调控免疫应答的疾病或病症的脊椎动物的方法,该方法包括给所述脊椎动物施用药学有效量的依照项I的SIMRA化合物。

[0034] 5.项4的方法,其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引起的疾病。

[0035] 6.依照项4的方法,其进一步包括施用一种或多种化疗化合物。

[0036] 7.依照项4的方法,其进一步包括施用靶向治疗剂。

[0037] 8.依照项4的方法,其进一步包括施用抗体。

[0038] 9.依照项4的方法,其进一步包括施用DNA疫苗。

[0039] 10.依照项4的方法,其进一步包括施用蛋白质疫苗。

[0040] 11.依照项4的方法,其进一步包括施用肽疫苗。

[0041] 12.依照项4的方法,其进一步包括施用抗原。

[0042] 13.依照项4的方法,其进一步包含佐剂。

[0043] 14.一种用于预防性处理患有会受益于调控免疫应答的疾病或病症的脊椎动物的方法,该方法包括给所述脊椎动物施用药学有效量的依照项I的SIMRA化合物。

[0044] 15.项14的方法,其中所述疾病或病症是脊椎动物中的癌症、自身免疫性病症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体引起的疾病。

[0045] 16.依照项15的方法,其进一步包括施用一种或多种化疗化合物。

[0046] 17.依照项15的方法,其进一步包括施用靶向治疗剂。

[0047] 18.依照项15的方法,其进一步包括施用抗体。

[0048] 19.依照项15的方法,其进一步包括施用DNA疫苗。

[0049] 20.依照项15的方法,其进一步包括施用蛋白质疫苗。

[0050] 21.依照项15的方法,其进一步包括施用肽疫苗。

[0051] 22.依照项15的方法,其进一步包括施用抗原。

[0052] 23.依照项15的方法,其进一步包括施用佐剂。

[0053] 附图简述

[0054] 依照实施例1合成本发明的SIMRA化合物。图1是用于本发明SIMRA化合物的平行合成的合成方案。DMTr=4,4’ - 二甲氧基三苯甲基;CE=氰乙基。

[0055] 图2A描绘了依照实施例2处理和分析的表达人TLR8的HEK293细胞中的NF- κ B活性。简言之,用150 μ g/ml TLR8激动剂刺激HEK293细胞达18小时,并使用SEAP (分泌型人胚胎碱性磷酸酶)测定法来测定NF-K B水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的免疫应答序型。

[0056] 图2B描绘了依照实施例2处理和分析的表达人TLR8的HEK293细胞中的NF- κ B活性。简言之,用150 μ g/ml TLR8激动剂刺激HEK293细胞达20小时,并使用SEAP测定法来测定NF-κ B水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的免疫应答序型。

[0057] 图2C-图2E描绘了依照实施例2处理和分析的表达人TLR8的HEK293细胞中的NF- κ B活性。简言之,用150 μ g/ml TLR8激动剂刺激HEK293细胞达18小时,并使用SEAP测定法来测定NF- κ B水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的免疫应答序型。

[0058] 图2F描绘了依照实施例2处理和分析的表达人TLR8的HEK293细胞中的NF- κ B活性。简言之,用O、20、50、100、200、或300 μ g/ml激动剂刺激表达人TLR8的HEK293细胞达18小时。使用SEAP测定法来测定NF- κ B 7K平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的免疫应答序型。

[0059] 图2G描绘了依照实施例2处理和分析的表达人TLR7的HEK293细胞中的NF- κ B活性。简言之,用O、20、50、100、200、或300 μ g/ml激动剂刺激表达人TLR7的HEK293细胞达18小时。使用SEAP测定法来测定NF- κ B 7K平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的免疫应答序型。

[0060] 图2H、图2J和图2L描绘了依照实施例2处理和分析的表达人TLR8的HEK293细胞中的NF-κΒ活性。简言之,用0、20、50、100、200、或300 μ g/ml激动剂刺激表达人TLR8的HEK293细胞达18小时。使用SEAP测定法来测定NF- κ B水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的免疫应答序型。

[0061] 图21、图2Κ和图2Μ描绘了依照实施例2处理和分析的表达人TLR7的ΗΕΚ293细胞中的NF-κΒ活性。简言之,用0、20、50、100、200、或300 μ g/ml激动剂刺激表达人TLR7的HEK293细胞达18小时。使用SEAP测定法来测定NF- κ B水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的免疫应答序型。

[0062] 图3Α-图3C描绘了来自依照实施例3处理和分析的人PBMC的细胞因子和趋化因子浓度。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液分离PBMC,并用50 μ g/ml剂量的TLR7/8激动剂培养24小时,收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0063] 图4A-图4C描绘了来自依照实施例3处理和分析的人PBMC的细胞因子和趋化因子浓度。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液分离PBMC,并用200 μ g/ml剂量的TLR7/8激动剂培养24小时,收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0064] 图4D-图4AA描绘了来自依照实施例3处理和分析的人PBMC的细胞因子和趋化因子浓度。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液分离PBMC,并用浓度渐增的TLR7/8激动剂培养24小时,收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的、剂量依赖性的、TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0065] 图5A-图5C描绘了来自依照实施例3分离、处理、和分析的人类浆细胞树突细胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)的细胞因子和趋化因子浓度。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液PBMC分离pDC,并用50 μ g/ml剂量的TLR7/8激动剂培养24小时,收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0066] 图®描绘了来自依照实施例3分离、处理、和分析的人类浆细胞树突细胞(pDC)的细胞因子和趋化因子浓度。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液PBMC分离pDC,并用50 μ g/ml或200 μ g/ml剂量的TLR7/8激动剂培养24小时,收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0067] 图6A、图6B、图6C、图6E和图6F描绘了来自依照实施例3处理和分析的人类浆细胞树突细胞(PDC)的细胞因子和趋化因子浓度。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液PBMC分离pDC,并用200 μ g/ml剂量的TLR7/8激动剂培养24小时,收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0068] 图6D描绘了来自依照实施例3处理和分析的人类浆细胞树突细胞(pDC)的细胞因子和趋化因子浓度。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液PBMC分离pDC,并用100 μ g/ml剂量的TLR7/8激动剂培养24小时,收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0069] 图7A-图7C描绘了来自依照实施例3处理和分析的人髓样树突细胞(myeloiddendritic cell,mDC)的细胞因子和趋化因子浓度。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液PBMC分离mDC,并用50 μ g/ml剂量的TLR7/8激动剂培养24小时,收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0070] 图8A和图8B描绘了依照实施例4处理和分析C57BL/6小鼠后2小时,C57BL/6小鼠(n=3)中的血清细胞因子诱导。简言之,给C57BL/6小鼠皮下注射25mg/kg剂量的TLR7/8激动剂,并在施用激动剂后2小时,对血清分析细胞因子和趋化因子水平,并呈现IL-12水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的体内施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0071] 图9A和图9B描绘了依照实施例4处理和分析BALB/c小鼠后2小时,BALB/c小鼠(n=3)中的血清细胞因子诱导。简言之,给BALB/c小鼠皮下注射25mg/kg剂量的TLR7/8激动剂,并在施用激动剂后2小时,对血清分析细胞因子和趋化因子水平,并呈现IL-12水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的体内施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0072] 图9C-图9F描绘了依照实施例4处理和分析BALB/c小鼠后2小时,BALB/c小鼠(n=3)中的血清细胞因子诱导。简言之,给BALB/c小鼠皮下注射10mg/kg或25mg/kg剂量的TLR7/8激动剂,并在施用激动剂后2小时,对血清分析细胞因子和趋化因子水平,并呈现IL-12水平。数据表明,依照本发明的SIMRA的体内施用产生独特的TLR介导的细胞因子和趋化因子序型。

[0073] 图1OA-图1OH描绘了依照实施例5处理的来自表2的例示性SMRA化合物的血清稳定性。简言之,将约0.5个OD的例示性SMRA化合物个别地在含1%人血清的PBS中于37° C温育30分钟。30分钟温育结束时,在阴离子交换HPLC上分析SMRA化合物以测定保留的全长SMRA化合物与血清处理前存在的SMRA化合物量相比的百分比。

[0074] 发明详述

[0075] 本发明涉及寡核糖核苷酸作为免疫调控剂用于免疫疗法应用的治疗用途。具体地,本发明提供了具有改善的体内稳定性的基于RNA的寡核苷酸,其经由单独的TLR7、TLR7和TLR8 二者、或单独的TLR8调控免疫应答(SMRA化合物)。通过启动多种多样的先天性和获得性免疫应答机制,例如经由用稳定的TLR7和/或TLR8激动剂或者SMRA化合物活化树突细胞和其它抗原呈递细胞,所得的细胞因子序型能导致对病原体、受感染的细胞或肿瘤细胞的破坏以及抗原特异性抗体和CTL应答的发生。如此,本发明提供了一组多种多样的SMRA化合物,每种具有其自己的独特免疫调节特征。因此,能针对不同医学适应证定制免疫应答的范围和性质,即提供具有针对该适应证的想要的一组免疫调控特征的SIMRA化合物。通过提及而将本文中所引用的授权专利、专利申请、和参考文献收入本文,其程度如同具体地和个别地指明通过提及而收录每一篇一样。在本文中所引用的任何参考文献的任何教导与本说明书之间不一致的情况中,对本发明来说以后者为准。

[0076] 本发明提供了用于使用SIMRA化合物来增强免疫应答的方法。此类方法会在免疫疗法应用中找到应用,诸如但不限于成年和儿科人类和兽医应用中癌症、自身免疫性病症、哮喘、呼吸变态反应、食物变态反应、皮肤变态反应、和细菌、寄生物和病毒感染的治疗。如此,本发明进一步提供了对免疫疗法具有最佳水平的免疫调控效果的新型SIMRA化合物及用于制备和使用此类化合物的方法。另外,本发明的SIMRA化合物作为佐剂或者与可用于治疗疾病或状况且不降低SIMRA化合物的免疫调控效果的药剂组合用于预防和治疗疾病是有用的。

[0077] 定义

[0078] 术语“2’ -取代的核糖核苷”或“2’ -取代的阿拉伯糖苷(arabinoside)” 一般包括如下的核糖核苷或阿拉伯糖核苷,其中戊糖模块2’位置的羟基被取代而生成2’-取代的或2’ -O-取代的核糖核苷。在某些实施方案中,所述取代是用含有1-6个饱和的或不饱和的碳原子的低级烃基、用卤素原子、或用具有6-10个碳原子的芳基进行的,其中所述烃基或芳基可以是未取代的或者可以是取代的,例如用卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、羰烷氧基(carboalkoxy)、或氨基取代。本发明的阿拉伯糖核苷包括但不限于阿拉伯糖-G、阿拉伯糖-C、阿拉伯糖-U、阿拉伯糖-A。2’ -O-取代的核糖核苷或2’ -O-取代的阿拉伯糖苷的例子包括但不限于2’ -氨基、2’ -氟、2’ -烯丙基、2’ -O-烃基和2’ -炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷、2’ -O-甲基核糖核苷或2’ -O-甲基阿拉伯糖苷和2’ -O-甲氧基乙氧基核糖核苷或2’ -O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷。

[0079] 术语“3’ ”在用于方向时一般指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中另一区域或位置3’(朝向糖的3’位置)的区域或位置。

[0080] 术语“5’ ”在用于方向时一般指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中另一区域或位置5’(朝向糖的5’位置)的区域或位置。

[0081] 术语“约” 一般意味着确切的数目不是至关重要的。如此,寡核糖核苷酸中核糖核苷残基的数目不是至关重要的,而且涵盖少一个或两个核糖核苷或阿拉伯糖苷残基或者多一个至数个核糖核苷或阿拉伯糖苷残基的寡核糖核苷酸作为上文所述每一个实施方案的等同方案。

[0082] 术语“佐剂” 一般指如下物质,其在被添加至诸如疫苗或抗原等免疫原性剂时在暴露于该混合物的受体宿主中增强或加强针对所述药剂的免疫应答。

[0083] 术语“气道炎症” 一般包括但不限于由传染性变应原引起的呼吸道炎症,包括哮喘。

[0084] 术语“变应原”一般指抗原或在暴露于受试者后引发变态反应的分子(通常是蛋白质)的抗原性部分。典型的是,受试者对变应原是过敏的,如通过例如风团(wheal)和潮红(flare)测试或本领域已知的任何方法所指出的。即使只有一小部分受试者在暴露于该分子后展现出变应性(例如IgE)免疫应答,也说该分子是变应原。

[0085] 术语“变态反应” 一般包括但不限于食物变态反应、呼吸变态反应和皮肤变态反应。

[0086] 术语“抗原” 一般指受到抗体或T细胞抗原受体识别和选择性结合的物质。抗原可以包括但不限于肽、蛋白质、核苷、核苷酸及其组合。抗原可以是天然的或合成的,而且一般诱导对该抗原特异性的免疫应答。

[0087] 术语“自身免疫性病症” 一般指其中“自身”抗原遭受免疫系统攻击的病症。

[0088] 阻断3’或5’降解或者“帽”或“加帽”意味着寡核糖核苷酸的3’或5’端附着于另一分子(例如接头或其它非RNA核苷酸)以充分抑制核酸酶降解(例如3’外切核酸酶降解)。

[0089] 术语“载体” 一般涵盖任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂、含脂的囊泡、微球体、脂质体封装、或本领域公知用于药物配制剂的其它物质。应当理解,载体、赋形剂、或稀释剂的特征会取决于用于特定应用的施用路径。含有这些物质的药学可接受配制剂的制备记载于例如《Remington’s Pharmaceutical Sciences》,第18版,A.Gennaro 编,Mack Publishing C0., Easton, PA, 1990。

[0090] 术语“共施用”一般指在足够近的时间里施用至少两种不同物质以调控免疫应答。共施用包括同时施用至少两种不同物质。

[0091] 术语“互补的”一般意味着具有与核酸杂交的能力。所述杂交通常是互补链之间氢键键合的结果(优选形成Watson-Crick或Hoogsteen碱基对),虽然其它模式的氢键键合以及碱基堆积也能导致杂交。

[0092] 术语“免疫调控性寡核糖核苷酸” 一般指在给诸如鱼类、鸟类或哺乳类等脊椎动物施用时诱导或遏制免疫应答的寡核糖核苷酸。

[0093] 术语“与...组合” 一般意味着在治疗同一患者的同一疾病的过程中,而且包括以任意次序施用SIMRA化合物和可用于治疗疾病或状况且不降低SIMRA化合物的免疫调控效果的药剂,包括同时施用或共施用,以及相隔几秒钟至数天的时间上有间隔的次序。此类组合处理还可包括超过一次的SMRA化合物和/或独立的所述药剂的施用。SMRA化合物和所述药剂的施用可以是通过相同或不同的路径的。

[0094] 术语“个体”或“受试者” 一般指哺乳动物,诸如人。哺乳动物一般包括但不限于人、非人灵长类、大鼠、小鼠、猫、犬、马、牛(cattle)、奶牛(cows)、猪、绵羊和家兔。

[0095] 术语“线性合成” 一般指在免疫调控性寡核糖核苷酸的一端开始并线性进展至另一端的合成。线性合成容许将相同或不同(就所掺入的长度、碱基组成和/或化学修饰而言)的单体单元掺入免疫调控性寡核糖核苷酸。

[0096] 术语“接头”一般指能借助共价或非共价键合经由糖、碱基、或主链附着至寡核糖核苷酸的任何模块。接头可用于附着两个或更多个核苷,或者可附着至寡核糖核苷酸的5’和/或3’末端核苷酸。所述接头可以是非核苷酸接头或核苷酸接头。

[0097] 术语“经过修饰的核苷” 一般是包括经过修饰的杂环碱基、经过修饰的糖模块、或其任意组合的核苷。在一些实施方案中,经过修饰的核苷是非天然嘧啶或嘌呤核苷,如本文所述。为了本发明,经过修饰的核苷、嘧啶或嘌呤类似物或非天然存在的嘧啶或嘌呤可互换使用,指包括非天然存在的碱基和/或非天然存在的糖模块的核苷。为了本发明,如果某碱基不是鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶,那么认为该碱基是非天然的。在一些实施方案中,经过修饰的核苷是2’ -取代的核糖核苷和阿拉伯糖核苷或2’ -脱氧-2’ -取代的阿拉伯糖苷,可以将它们替代入寡核糖核苷酸的选定位置中以提高稳定性而不干扰TLR7或TLR8活性。

[0098] 术语“调控”或“刺激” 一般指变化,诸如响应的升高或响应的定性差异,这可以源于对响应的引发和/或增强。

[0099] 术语“非核苷酸接头”一般指能借助共价或非共价键合附着至寡核糖核苷酸的、核苷酸连接以外的化学模块。优选的是,所述非核苷酸接头的长度是约2埃至约200埃,而且可以是顺式或反式取向。

[0100] 术语“核苷酸连接” 一般指经由它们的糖(例如3’ _3’、2’ _3’、2’ _5’、3’ _5’)接合两个核苷的化学连接,其由相邻核苷间的磷酸酯、非磷酸酯、带电荷的、或中性的基团(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)组成。

[0101] 术语“肽”一般指长度和组成足以影响生物学应答(例如抗体生成或细胞因子活性,无论该肽是否是半抗原)的多肽。术语“肽”可以包括经过修饰的氨基酸(无论是天然存在的还是非天然存在的),其中所述修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG化、脂化(Iipidizat1n)和甲基化。

[0102] 术语“药学可接受的”或“生理学可接受的”一般指不干扰依照本发明的化合物的效力和与生物学系统(诸如细胞、细胞培养物、组织、或生物体)相容的物质。优选的是,所述生物学系统是活的生物体,诸如脊椎动物。

[0103] 术语“药学有效量”一般指足以实现期望生物学效应(诸如有益结果)的量。如此,“药学有效量”会取决于施用它的背景。药学有效量可以在一次或多次预防性或治疗性施用中施用。

[0104] 术语“SIMRA” 一般指由TLR7和/或TLR8识别为配体的稳定化的免疫调控性RNA化合物,其中所述化合物可含有单链RNA(ssRNA)和/或双链RNA (dsRNA),和用于保护或稳定其3’末端的修饰(例如通过阻断3’降解或通过为3’末端加帽或通过连接两条或更多条寡核糖核苷酸的3’末端),倘若SMRA在体内比未经修饰的寡核糖核苷酸更加稳定且如此实现(affect)它的免疫调控能力。SMRA可含有经过修饰的寡核糖核苷酸。SMRA化合物还可含有用于保护其5’末端以进一步改善寡核糖核苷酸稳定性的修饰(例如通过阻断5’降解或给5’末端加帽)。SIMRA可以是线性的或分支的,其中核酸是经由例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或备选连接相连接的核糖核苷聚合物。SIMRA可以由共价附着至核糖残基或其衍生物的嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)或其衍生物(例如7-脱氮-G、阿拉伯糖-G和阿拉伯糖-A))或嘧啶(胞嘧啶(C)或尿嘧啶⑶或其衍生物(例如阿拉伯糖-C和阿拉伯糖-U))喊基组成。

[0105] 术语“治疗”或“处理”一般指旨在获得有益的或期望的结果(其可以包括症状的缓和或者疾病进展的延迟或改善)的办法。

[0106] 术语“病毒性疾病” 一般指具有病毒作为其起病性因子的疾病,包括但不限于乙肝、丙肝、流感、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、和带状疱疹。

[0107] 在第一个方面,本发明提供了新的SMRA化合物。本发明人已经发现了修饰免疫调控性寡核糖核苷酸以保护其3’末端(例如通过阻断3’降解或者给3’末端加帽或者通过连接两条或更多条寡核糖核苷酸的3’末端)令人惊讶地影响其免疫调控能力。另外,已确定这种保护令人惊讶地改善寡核糖核苷酸的稳定性,不再需要脂质联合或其它保护手段。进一步地,在保护3’末端外或者与保护3’末端组合,阻断5’降解或给5’末端加帽还能改善寡核糖核苷酸的稳定性。

[0108] 在本发明中,演示了用新型SIMRA化合物活化TLR8,并诱导独特的免疫应答(例如细胞因子和/或趋化因子序型的变化)。此外,在此类人TLR8活化性RNA中掺入某些化学修饰还能活化TLR7,导致独特的免疫应答和细胞因子和/或趋化因子序型的变化。如此,本发明人令人惊讶地发现了,通过使用经修饰的化学结构(包括经修饰的碱基、经修饰的糖、主链、接头、连接和/或帽)作为免疫调控性寡核糖核苷酸的一部分能经由活化TLR8和/或TLR7来调控与之相关的细胞因子和/或趋化因子序型。

[0109] 在一个实施方案中,本发明提供了一种免疫调控性化合物,其包含至少两条基于RNA的寡核苷酸,这些寡核苷酸在它们的3’末端、或核苷间连接、或者官能化的核碱基或糖处与非核苷酸接头连接。本发明的此实施方案可以具有至少一个易接近的5’末端,其可以是加帽的或未加帽的。已经确定了,此结构为SMRA化合物提供了进一步的稳定性(例如抑制外切核酸酶活性)而无需脂质联合或其它保护。“易接近的5’末端”意味着SIMRA的5’端不以阻止SMRA化合物经由TLR7和/或TLR8调控免疫应答的方式修饰。

[0110] 本发明这个方面的另一个实施方案包含至少两条寡核糖核苷酸,其中所述免疫调控性化合物具有如下的结构,包括但不限于那些如表I式1-X中所详述的。

[0111] 表1:寡核糖核苷酸式1-X

[0112]

Figure CN102921003BD00141

[0113] 域A、B、C、和D的长度可以独立为约2个至约35个核糖核苷酸,且在一些实施方案中为约2个至约20个、或约2个至约12个、或约2个至约11个、或约2个至约8个核糖核苷酸。域A、B、C、和/或D可以是或者可以不是相同的。域A、B、C、和D可以独立为具有或没有自我互补域、同源(homo)或异源(hetero)核糖核苷酸序列、或者接头的5’ _3’或2’-5’RNA。“η”可以为I至无限的数目。

[0114] “X”是连接域A、B、C、和/或D或给域A、B、C、和/或D加帽的接头,其可以是经由

3’或5’连接、磷酸酯基团、核碱基、非RNA核苷酸、或非核苷酸接头,其可以是脂肪族的、芳香族的、芳基、环状的、手性的、非手性的、肽、碳水化合物、脂质、脂肪酸、单_、三-或六聚乙二醇、或杂环模块、或其组合。

[0115] 在又一个实施方案中,本发明提供了 SIMRA化合物,其包含至少两条通过非核苷酸接头连接的寡核糖核苷酸,其中免疫调控性寡核糖核苷酸的序列可以是至少部分自我互补的。正如本领域技术人员会认识到的,所述寡核糖核苷酸的互补序列容许分子间氢键键合,由此给予寡核糖核苷酸二级结构。别的寡核糖核苷酸能结合在一起,由此创建依照本发明的寡核糖核苷酸的链或多聚物。

[0116] 类似的考虑适用于有不同碱基序列的免疫调控性寡核糖核苷酸之间的分子间碱基配对。如此,在一起使用众多免疫调控性寡核糖核苷酸的情况中,所述众多免疫调控性寡核糖核苷酸可以但非必须包括彼此至少部分互补的序列。在一个实施方案中,所述众多免疫调控性寡核糖核苷酸包括具有第一序列的免疫调控性寡核糖核苷酸和具有第二序列的免疫调控性寡核糖核苷酸,其中所述第一序列和所述第二序列至少50%互补。例如,如在至少50%互补的两条8聚物之间的,它们可以形成4、5、6、7、或8个G_C、A_U、和/或G-U摆动碱基对。此类碱基对可以但非必然牵涉位于互补的免疫调控性寡核糖核苷酸任一末端的碱基。互补程度可取决于免疫调控性寡核糖核苷酸之间的比对,并且此比对可以包括或不包括单个或多个核苷突出端。在其它实施方案中,互补程度是至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或甚至100%。

[0117] 正如本领域技术人员会认可的,因为域的序列是互补的,容许分子间氢键键合,所以所描绘的免疫调控性化合物可具有二级结构。此外,如从式I至X能想到的,别的连接的基于RNA的寡核苷酸能经由分子间氢键键合而结合,由此创建链或多聚物,其中可以掺入任意数目的连接的基于RNA的寡核苷酸。

[0118] 在另一个实施方案中,本发明提供了一种免疫调控性化合物,其包含至少两条基于RNA的寡核苷酸,所述寡核苷酸在它们的3’或5’末端处,或者经由核苷间连接或官能化的核碱基或糖连接至非核苷酸接头,且其中将接头(例如帽)附着至至少一个5’末端。已经确定了此结构为SIMRA化合物提供了进一步的稳定性(例如抑制外切核酸酶活性)。SIMRA的5’端不以阻止SMRA化合物经由TLR7和/或TLR8调控免疫应答的方式修饰。

[0119] 在一些实施方案中,寡核糖核苷酸各自独立具有约2个至约35个核糖核苷残基。如此,在某些实施方案中,寡核糖核苷酸可以独立长2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个核糖核苷酸。优选地,寡核糖核苷酸为约4个至约30个核糖核苷残基,更优选约4个至约20个核糖核苷残基,或者约4个至约11个核糖核苷残基。在一些实施方案中,免疫调控性寡核糖核苷酸包含具有约I个至约18个、或约I个至约11个、或约5个至约14个核糖核苷残基的寡核糖核苷酸。在一些实施方案中,所述寡核糖核苷酸中的一个或多个具有11个核糖核苷酸或约8个至约14个核糖核苷酸或约10个至约12个核糖核苷酸。在免疫调控性寡核糖核苷酸的背景中,优选的实施方案具有约I个至约35个核糖核苷酸,优选约5个至约26个核糖核苷酸,更优选约13个至约26个核糖核苷酸。优选地,免疫调控性寡核糖核苷酸包含至少一个磷酸二酯、硫代磷酸酯、或二硫代磷酸酯核糖核苷间连接。

[0120] 在例示性的实施方案中,每个核糖核苷单元包括杂环碱基和呋喃戊糖基(pentofuranosyl)、海藻糖、阿拉伯糖、2’ -脱氧_2’ -取代的阿拉伯糖、2’ -O-取代的核糖或阿拉伯糖、或己糖糖基团。核糖核苷残基可以通过多种已知的核糖核苷间连接中的任一种彼此偶联。此类核糖核苷间连接包括但不限于磷酸二酯(phosphodiester)、硫代磷酸酯(phosphoroth1ate)、二硫代磷酸酯(phosphorodith1ate)、径基膦酸酯(alkylphosphonate)、径基硫代膦酸酯(alkylphosphonoth1ate)、磷酸三酯(phosphotriester)、氨基憐酸酯(phosphoramidate)、娃氧焼(si1xane)、碳酸酯(carbonate)、羰烷氧基(carboalkoxy)、氨基乙酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯(carbamate)、吗啉代(morpholino)、硼代(borano)、硫醚(th1ether)、桥接氨基磷酸酯(bridged phosphoramidate)、桥接亚甲基勝酸酯(bridged methylene phosphonate)、桥接硫代磷酸酯(bridged phosphoroth1ate)、和砜(sulfone)核苷间连接。下文式XI中指出了偶联核糖核苷酸的可能位点,其中B代表杂环碱基。

[0121]

Figure CN102921003BD00161

[0122] 本发明的SMRA化合物可以包括天然存在的核糖核苷、经修饰的核糖核苷、或其混合物。

[0123] 在本发明中,新的SMRA化合物受到人TLR8识别,并且在此人TLR8活化性RNA中掺入某些化学修饰能使它们受到人TLR7识别并诱导免疫应答。此类化学修饰包括但不限于鸟嘌呤类似物,诸如7-脱氮-G、ara-G、6-硫-G、肌苷、异-G、洛索立宾(1xoribine)、TOG (7-硫-8-氧)_G、8_溴_G、8_羟基_G、5_氨基间型霉素(aminoformycin) B、氧间型霉素(Oxoformycin)、7_甲基_G、9_对-氯苯基-8-氮_G、9_苯基_G、9_己基-鸟嘌呤、7-脱氣_9_苄基_G、6_氣_7_脱氣鸟嘿呤、6_甲氧基_7_脱氣鸟嘿呤、8_氣7-脱氣-G(PPG)、2-( 二甲基氨基)鸟苷、7-甲基-6-硫鸟苷、8-苄氧基鸟苷、9-脱氮鸟苷、和1-(B-D-呋喃核糖基)-2_氧-7-脱氮-8-甲基-嘌呤。化学修饰还包括但不限于腺嘌呤类似物,诸如9-苄基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)腺嘌呤、2-氨基-N2-0-、甲基腺苷、8-氮-7-脱氮-A、7-脱氮-A、ara-A、Vidarabine (阿糖腺苷)、2_氨基腺苷、N1-甲基腺苷、8-氮腺苷、5-碘杀结核菌素。化学修饰还包括但不限于胞嘧啶和尿嘧啶类似物,诸如假尿苷、arc-C、ara-U、5-甲基胞苷、4_硫尿苷、N4-乙基尿苷、zebularine、5_氨基烯丙基尿苷、N3-甲基尿苷、5-氟尿苷。

[0124] 依照本发明的“免疫调控性寡核糖核苷酸”是如下的SIMRA化合物,其包含至少两条在它们的3’ -或2’ -端或官能化核糖或官能化核糖核碱基处经非核苷酸或核苷酸接头共价或非共价连接的寡核糖核苷酸。下文列出了接头的数个例子。非共价连接包括但不限于静电相互作用、疏水相互作用、η -叠加相互作用和氢键键合。

[0125] 在其它实施方案中,所述非核苷酸接头是具有容许附着至寡核糖核苷酸的官能团的有机模块。此类附着优选是通过稳定的共价连接。作为一个非限制性例子,所述接头可以附着至核苷酸上的任何合适位置。在一些优选的实施方案中,所述接头附着至3’-羟基。在此类实施方案中,所述接头优选包含羟基官能团,其优选依靠基于磷酸酯的连接(像磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)或非基于磷酸酯的连接附着至3’ -羟基。

[0126] 在一些实施方案中,所述非核苷酸接头是小分子、大分子或生物分子,包括但不限于多肽、抗体、脂质、抗原、变应原、和寡糖。在一些其它实施方案中,所述非核苷酸接头是小分子。为了本发明,小分子是分子量小于1,OOODa的有机模块。在一些实施方案中,所述小分子具有小于750Da的分子量。

[0127] 在一些实施方案中,所述小分子是脂肪族或芳香族碳氢化合物(烃),二者任选可以在连接寡核糖核苷酸或附着于寡核糖核苷酸的线性链中包括一个或多个官能团,包括但不限于羟基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、酯、脲、或硫脲。所述小分子可以是环状的或无环的。小分子接头的例子包括但不限于氨基酸、碳水化合物、环糊精、金刚烷(adamantane)、胆固醇、半抗原和抗生素。然而,出于描述非核苷酸接头的目的,术语“小分子”并非意图包括核苷。

[0128] 在一些实施方案中,所述非核苷酸接头是烃基接头或氨基接头。所述烃基接头可以是分支的或不分支的,环状的或无环的,取代的或未取代的,饱和的或不饱和的,手性的、非手性的或外消旋的混合物。所述烃基接头可以具有约2个至约18个碳原子。在一些实施方案中,此类烃基接头具有约3个至约9个碳原子。一些烃基接头包括一个或多个官能团,包括但不限于羟基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、酯、脲、和硫醚。此类烃基接头可包括但不限于1-丙醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2,3-丙三醇、三甘醇、六甘醇、聚乙二醇接头(例如[_0-CH2-CH2-]n (n=l-9))、甲基接头、乙基接头、丙基接头、丁基接头、或己基接头。在一些实施方案中,此类烃基接头可包括肽或氨基酸。

[0129] 在一些实施方案中,所述非核苷酸接头可以包括但不限于表2所列那些。

[0130] 表2:代表性的非核苷酸接头

[0131]

Figure CN102921003BD00181
Figure CN102921003BD00191

[0134]表 2:续

[0135]

Figure CN102921003BD00201

[0136]表 2:续

[0137]

Figure CN102921003BD00211
Figure CN102921003BD00221
Figure CN102921003BD00231

1,3,4-异丁三醇 氰尿酸

[0142] 在一些实施方案中,所述小分子接头是甘油或式HO-(CH2)trCH(OH)-(CH2)p-OH的甘油同系物,其中ο和P独立为I至约6、1至约4、或I至约3的整数。在一些其它实施方案中,所述小分子接头是1,3-二氨基-2-羟基丙烷的衍生物。一些此类衍生物具有式HO- (CH2) m-C (O) NH-CH2-CH (OH) -CH2-NHC (O) - (CH2) m-OH,其中 m 是 O 至约 10、O 至约 6、2 至约6、或2至约4的整数。

[0143] 一些依照本发明的非核苷酸接头容许附着超过两条寡核糖核苷酸,如表1所描绘的。例如,小分子接头甘油具有三个羟基,可供寡核糖核苷酸共价附着。因此,一些依照本发明的免疫调控性寡核糖核苷酸包含超过两条经非核苷酸接头连接的寡核糖核苷酸(例如域C等,别的域包含如上文为域A、B、C、和D定义的寡核糖核苷酸)。

[0144] 在本发明这个方面的又一个实施方案中,SMRA可含有三条或更多条在它们的3’或5’端处、或经由核苷间连接或官能化核碱基或糖连接至两个或更多个接头的寡核糖核苷酸,如表1所描绘的。本发明这个方面的寡核糖核苷酸可具有相同或不同的序列。本发明这个方面的接头可以是相同的或不同的。

[0145] 本发明的免疫调控性寡核糖核苷酸可以方便地使用自动化合成仪和亚氨基磷酸酯法合成。在一些实施方案中,免疫调控性寡核糖核苷酸是通过线性合成法合成的。

[0146] 另一种合成模式是“平行合成”,其中自中央接头模块向外进行合成(见图1)。可以使用附着于固体支持物的接头来进行平行合成,如美国专利N0.5,912,332中所记载的。或者,可以使用通用固体支持物(诸如附着有磷酸酯的受控孔径玻璃)。

[0147] 免疫调控性寡核糖核苷酸的平行合成相对于线性合成具有数项优点:(I)平行合成容许掺入相同的单体单元;(2)与线性合成不同,所有单体单元都是在同一时间合成的,由此合成步骤的数目和合成所需要的时间与单体单元的是相同的;和(3)合成步骤的减少提高了最终的免疫调控性寡核糖核苷酸产物的纯度和产率。

[0148] 在通过线性合成或平行合成方案进行的合成结束时,可以用浓氨水溶液或像亚氨基磷酸酯供应商推荐的那样(如果掺入有经过修饰的核苷的话)方便地使免疫调控性寡核糖核苷酸脱保护。将产物免疫调控性寡核糖核苷酸优选通过反相HPLC纯化,脱三苯甲基化,脱氧和透析。

[0149] 表3显示了依照本发明的基于RNA的免疫调控性寡核糖核苷酸。除非另有规定,所有核苷是核糖核苷。

[0150] 表3:稳定化的基于RNA的免疫调控性寡核苷酸(SIMRA)序列

[0151]

Figure CN102921003BD00251
Figure CN102921003BD00261
Figure CN102921003BD00271
Figure CN102921003BD00281
Figure CN102921003BD00291
Figure CN102921003BD00301

[0157] G1=?-脱氮 _rG ;G2=ara_G ;G3=7_脱氮 _ara_G !Cfara-C ;C2=2’-F_C ;C4=5_ 甲基-C ;Afara-A !Ufara-U ;U2=2’ -F-U ;M=顺,顺-环己烧三醇接头;m=顺,反-环己烧三醇;Z=I, 3,5-戊三醇接头;X=甘油接头;Χ1=1,2,4- 丁三醇接头;X2=氰尿酸;X3=异丁三醇接头;Y=I, 3-丙二醇;L=1, 5-戍二醇;Ι^=,2’ - 二脱氧核糖;6Eg=六甘醇接头;3Eg=三甘醇接头;4Eg=四甘醇接头;P=硫代磷酸酯;E=乙二醇。

[0158] 在第二个方面,本发明提供了包含依照本发明的SMRA化合物和药学可接受载体的药物配制剂。

[0159] 在第三个方面,本发明提供了用于在脊椎动物中产生TLR7和/或TLR8介导的免疫应答的方法,此方法包括给所述脊椎动物施用依照本发明的SIMRA化合物。在一些实施方案中,所述脊椎动物是哺乳动物。在优选的实施方案中,给需要免疫调控的脊椎动物施用SIMRA化合物。

[0160] 在第四个方面,本发明提供了用于治疗性处理患有疾病或病症的患者的方法,此方法包括给所述患者施用依照本发明的SIMRA化合物。在各种实施方案中,要治疗的疾病或病症是可能想要免疫调控的。例如但不限于癌症、自身免疫性病症、传染病、气道炎症、炎性病症、变态反应、哮喘、或由病原体引起的疾病。病原体包括细菌、寄生物、真菌、病毒、类病毒和朊病毒。

[0161] 在第五个方面,本发明提供了用于预防疾病或病症的方法,此方法包括给患者施用依照本发明的SIMRA化合物。在各种实施方案中,要预防的疾病或病症是可能想要免疫调控的。例如但不限于癌症、自身免疫性病症、气道炎症、炎性病症、传染病、变态反应、哮喘、或由病原体引起的疾病。病原体包括细菌、寄生物、真菌、病毒、类病毒、和朊病毒。

[0162] 在第六个方面,本发明提供了一种预防或治疗病症的方法,此方法包括分离能够生成细胞因子或趋化因子的细胞(包括但不限于免疫细胞、B细胞、T调节性细胞、B细胞、PBMC、pDC和淋巴样细胞);在标准细胞培养条件下培养此类细胞,用SMRA离体处理此类细胞,使得所分离的细胞生成或分泌水平升高的细胞因子或趋化因子,并给需要细胞因子或趋化因子治疗以预防或治疗疾病的患者施用或再施用经处理的细胞。本发明的这个方面会依照标准过继性细胞免疫疗法技术来产生活化的免疫细胞。

[0163] 在本发明这个方面的一些实施方案中,可以自患有或不患有疾病或病症的受试者分离能够生成细胞因子或趋化因子的细胞。此分离可以包括鉴定和选择,并且可以使用标准细胞分离规程(包括下文的具体实施例中所列出的那些)来实施。依照标准细胞培养规程并使用标准细胞培养条件(其可以包括下文的具体实施例中所列出的培养规程和条件)来培养此类分离的细胞。在本发明的这个实施方案的又一个方面,在存在至少一种SIMRA的情况中培养分离的细胞,SIMRA的量和培养的时限足以与在没有所述一种或多种SIMRA的情况中培养的分离细胞相比诱导、提高或增强细胞因子和/或趋化因子的生成和/或分泌。此时间可以从若干分钟至若干小时、至若干天。此类分离的、经SMRA处理的细胞可用于给供体再施用或者给第二位组织学相容患者施用,其中此供体或第二患者需要诱导、提高或增强细胞因子和/或趋化因子的生成和/或分泌。例如,给患有癌症、自身免疫性病症、气道炎症、炎性病症、传染病、变态反应、哮喘、或由病原体引起的疾病的供体再施用或者给患有癌症、自身免疫性病症、气道炎症、炎性病症、传染病、变态反应、哮喘、或由病原体引起的疾病的第二患者施用。可以使用包括导管或注射施用或任何其它有效路径的多种方式来实现此再施用或施用。本发明的这个方面还可应用于可能具有有限的或不完全的启动免疫应答的能力的患者或免疫受损的患者(例如受HIV感染的患者或骨髓移植的患者)。本发明的这个方面还可应用于与给施用或再施用分离的、经SIMRA处理的细胞的患者进行SIMRA施用的组合。

[0164] 在依照本发明的任何方法中,SIMRA化合物能通过单独地或与任何其它对治疗或预防疾病或疾患有用的、不降低SIMRA化合物的免疫调控效果的药剂组合地产生直接免疫调控效果而以各种方式起作用。在依照本发明的任何方法中,对治疗或预防疾病或疾患有用的药剂包括但不限于疫苗、抗原、抗体(优选单克隆抗体)、细胞毒剂、变应原、抗生素、siRNA、微小RNA、反义寡核苷酸、TLR激动剂(例如TLR9激动剂和/或TLR7激动剂和/或TLR8激动剂)、化疗剂(传统的化疗和现代的靶向疗法二者)、靶向治疗剂、活化的细胞、肽、蛋白质、基因疗法载体、肽疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗、佐剂、和共刺激分子(例如细胞因子、趋化因子、蛋白质配体、反式激活因子、肽或包含经修饰氨基酸的肽)、或其组合。例如,在癌症的治疗中,可以将SIMRA化合物与一种或多种化疗化合物、靶向治疗剂和/或单克隆抗体组合施用。或者,所述药剂可包括编码抗原或变应原的DNA载体。或者,所述SIMRA化合物可以与其它佐剂组合施用以增强针对所述SIMRA化合物的免疫应答的特异性或强度。

[0165] 在依照本发明的任何方法中,SIMRA化合物的施用(单独的或与任何其它药剂组合的)可通过任何合适路径来进行,包括但不限于胃肠外(parenteral)、粘膜投递(mucosaldelivery)、口月艮(oral)、舌下(sublingual)、经皮(transdermal)、表面(topical)、吸A (inhalat1n)、鼻内(intranasal)、气溶胶(aerosol)、眼内(intraocular)、气管内(intratracheal)、直肠内(intrarectal)、阴道(vaginal)、通过基因枪(gene gun)、皮肤贴片(dermal patch)或滴眼剂(eye drop)或漱口水(mouthwash)形式。SIMRA化合物的治疗性组合物的施用可使用已知规程以有效减轻疾病的症状或替代标志物的药学有效量和时限来进行。例如,SIMRA化合物用于治疗疾病和/或病症的药学有效量可以是缓和或减轻症状,或者延迟或改善肿瘤、癌症、或细菌、病毒或真菌感染所必需的量。作为疫苗佐剂使用的药学有效量可以是对加强受试者对疫苗或抗原的免疫应答有用的量。在施用调控针对共施用的抗原的免疫应答的组合物的背景中,SIMRA化合物和抗原的药学有效量是足以与在单独施用该抗原时所获得的免疫应答相比实现想要的调控的量。任何具体应用的有效量可以随诸如所治疗的疾病或疾患、所施用的具体寡核苷酸、受试者的体型、或疾病或疾患的严重程度等因素而变化。本领域技术人员能凭经验决定具体寡核苷酸的药学有效量而没有过度实验的必要。

[0166] 在系统性施用时,优选以足够剂量施用治疗性组合物以使SMRA化合物的血液水平达到约0.0001微摩尔至约10微摩尔。对于局部施用,比这低得多的浓度可以是有效的,而且可耐受高得多的浓度。优选的是,SIMRA化合物的总剂量的范围为约0.0Olmg每名患者每天至约200mg每kg体重每天。可能希望对个体同时地或顺序地施用治疗有效量的一种或多种本发明治疗性组合物作为单次处理事件。

[0167] SIMRA化合物可任选是与一种或多种变应原和/或抗原(自身的或外来的)、免疫原性蛋白质或肽相连接的,诸如匙孔!戚血蓝蛋白(KLH)、霍乱毒素B亚基、或任何其它免疫原性载体蛋白。SMRA化合物还可与其它化合物(例如佐剂)组合使用,包括但不限于TLR激动剂(例如TLR2激动剂和TLR9激动剂)、弗氏不完全佐剂、KLH、单磷酰基脂质A(MPL)、明帆、和阜苷(包括QS-21和咪喹莫特(imiquimod)),或其组合。

[0168] 依照本发明这个方面的方法对于免疫系统的模型研究是有用的。所述方法对于人或动物疾病的预防性或治疗性处理也是有用的。例如,所述方法对于儿科和兽医疫苗应用是有用的。

[0169] 以下实施例旨在进一步例示本发明的某些例示性实施方案,并非意图限制本发明的范围。

实施例

[0170] 实施例1:免疫调控性寡核糖核苷酸的合成

[0171] 在自动化DNA/RNA合成仪上使用亚氨基磷酸酯化学法化学合成免疫调控性寡核糖核苷酸。N-乙酰基保护的(除U外)2’ -O-TBDMS RNA单体(A、G、C和U)购自Sigma-Aldricho 7-脱氮-G、肌苷购自 ChemGenes Corporat1n。0.25M 5-乙硫基-1H-四唑、PAC-酐Cap A和Cap B购自Glen Research。二氯甲烷(DCM)中的3%三氯乙酸(TCA)和5%3H-1, 2-苯并二硫醇-3-酮-1,1- 二氧化物(Beaucage试剂)均自行制备。

[0172] 使用标准RNA合成方案以1-2 μ M规模合成免疫调控性寡核糖核苷酸。

[0173] 切割和碱基脱保护

[0174]自固体支持物切割免疫调控性寡核糖核苷酸,并在甲胺和氢氧化铵溶液中除去外-环-胺的保护基团。在SpeedVac中完全干燥所得溶液。

[0175] IE HPLC 纯化

[0176] 通过离子交换HPLC来纯化免疫调控性寡核糖核苷酸。使用D1nex DNAPac 100柱。将粗制的免疫调控性寡核糖核苷酸溶液注射入HPLC中。实施上文的梯度,并收集级分。混合所有含有超过90%期望产物的级分,然后通过RotoVap将溶液浓缩至几乎干的。添加不含RNA酶的水使终体积为10ml。

[0177] C-18反相脱盐

[0178] 如下清洗购自Waters的tC-18Sep_Pak筒(cartridge),即用1ml乙腈流过,接着1ml 0.5M乙酸钠流过该筒。然后将1ml免疫调控性寡核糖核苷酸溶液加载至该筒上。然后使用15ml水来洗去盐。最后使用Iml在水中的50%乙腈来洗脱免疫调控性寡核糖核苷酸。将该溶液放置在SpeedVac中达30分钟。将剩余溶液流过0.2微米滤器过滤,然后冻干。然后将固体在不含RNA酶的水中再溶解以得到想要的浓度。在低于0° C贮存终溶液。通过毛细管电泳、离子交换HPLC和PAGE分析来对寡核糖核苷酸分析纯度,并通过MALD1-ToF质谱术来分析分子量。

[0179] 实施例2:用表达TLR的HEK293细胞进行的测定法的方案

[0180]将 HEK293 或 HEK293XL/ 人 TLR7 或者 HEK293 或 HEK293XL/ 人 TLR8 细胞(Invivogen, San Diego, CA)在5%C02培养箱中在48孔板中在补充有10%热灭活FBS的250 μ I/孔DMEM中培养。

[0181] 报告基因转化

[0182]将稳定表达人 TLR7 或 TLR8 的 ΗΕΚ293 或 HEK293XL 细胞(Invivogen, SanDiego, CA)在5%C02培养箱中在48孔板中在补充有10%热灭活FBS的250 μ I/孔DMEM中培养。在 80%汇合时,在培养基中存在 4 μ 1/ml Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA)的情况中用400ng/ml SEAP (分泌形式的人类胚胎碱性磷酸酶)报告质粒(pNifty2_Seap)(Invivogen)瞬时转染培养物。将质粒DNA和Lipofectamine在不含血清的培养基中分开稀释,并于室温温育5分钟。温育后,混合稀释的DNA和Lipofectamine,并将混合物于室温温育 20 分钟。将含有 10ng 质粒 DNA 和 I μ I Lipofectamine 的 25 μ I DNA/Lipofectamine混合物的等分试样添加至细胞培养板的每个孔,并继续培养4小时。

[0183] IMO 处理

[0184] 转染后,用新鲜培养基更换培养液。用0、20、50、100、150、200、或300μ g/ml TLR7或TLR8激动剂,即SMRA刺激表达人TLR7或TLR8的HEK293或HEK29XL细胞,并继续培养18小时-20小时。SMRA处理结束时,自每项处理采集30 μ I培养物上清液,并遵照制造商的方案(Invivogen)用于SEAP测定法。

[0185] SEAP (分泌形式的人类胚胎碱性磷酸酶)测定法

[0186] 简言之,将培养物上清液与对硝基苯基磷酸酯底物一起温育,并通过读板仪在405nm处测量所生成的黄色。数据显示为NF- κ B活性相对于PBS对照的倍数增加。(PuttaMR 等,Nucleic Acids Res.,2006,34:3231-8)。

[0187] 实施例3:人细胞培养方案

[0188]人 PBMC 分离

[0189] 通过Ficoll密度梯度离心法(Histopaque-1077, Sigma)自新鲜采集的健康志愿者血液(CBR Laboratories, Boston, MA)分离外周血单个核细胞(PBMC)。

[0190] 人pDC分离

[0191] 通过Ficoll密度梯度离心法(Histopaque-1077, Sigma)自新鲜采集的健康志愿者血液(CBR Laboratories, Boston, MA)分离外周血单个核细胞(PBMC)。使用BDCA4细胞分离试剂盒(Miltenyi B1tec)依照制造商的指令通过正选择自PBMC分离pDC。

[0192] 人mDC分离

[0193] 通过Ficoll密度梯度离心法(Histopaque-1077, Sigma)自新鲜采集的健康志愿者血液(CBR Laboratories, Boston, MA)分离外周血单个核细胞(PBMC)。使用BDCA4细胞分离试剂盒(Miltenyi B1tec)依照制造商的指令通过正选择自PBMC分离髓样树突细胞(mDC)。

[0194] 多重细胞因子测定法

[0195] 使用5xl06个细胞/ml,在48孔板中分配人PBMC。使用IxlO6个细胞/ml,在96孔皿中分配pDC。以终浓度20、50、100、200或300 μ g/ml或如图中所指示的将在DPBS (pH7.4;MediateCh)中溶解的SMRA添加至细胞培养物。然后于37° C温育细胞达24小时,并收集上清液用于Luminex多重测定法或ELISA测定法。在一式三份的孔中实施实验。通过三明治式ELISA来测量IFN-a、IL-6、或TNF-α水平。需要的试剂(包括细胞因子抗体和标准品)购自PharMingen。

[0196] 在Luminex 100/200仪器上使用B1source人多重细胞因子测定法试剂盒来实施 Luminex 多重测定法,并使用由 Applied Cytometry Systems (Sacramento, CA)供应的StarStat1n软件来分析数据。

[0197] 实施例4:用TLR9激动剂化合物处理的小鼠模型中的体内细胞因子分泌

[0198] 5-6 周龄的 C57BL/6 小鼠和 BALB/c 小鼠得自 Taconic Farms (Germantown, NY)并依照Idera Pharmaceutical的IAOJC批准的动物方案来饲养。以25mg/kg (单剂)给小鼠(n=3)皮下(s.C)注射表3的各稳定化免疫调控性基于RNA的寡核苷酸。施用免疫调控性寡核苷酸后2小时通过眶后采血来收集血清,并通过三明治式ELISA或Luminex多重测定法测定细胞因子和趋化因子水平。结果显示在图8A、图8B、图9A和图9B中,并且证明体内施用依照本发明的SIMRA寡核苷酸产生独特的细胞因子和趋化因子序型。所有试剂(包括细胞因子和趋化因子抗体和标准品)都购自PharMingen (San Diego, CA)。

[0199] 实施例5:血清稳定性测定法

[0200] 将约0.5个OD的来自表3的例示性SMRA化合物个别地于37° C在含1%人血清的PBS中温育30分钟。在1%人血清中温育30分钟后,在阴离子交换HPLC上分析SMRA化合物以测定与血清处理前存在的SMRA化合物量相比保留的全长SMRA化合物的百分比。结果显示在图1OA-图1OH中,并且证明了对基于RNA的化合物进行的依照本发明的化学修饰能增强其稳定性。

[0201] 等同方案

[0202] 虽然出于澄清和理解的目的已经较为详细地描述了上述发明,但是本领域技术人员在阅读本公开内各后会领会,可以对形式和细节做各种改变而不背离本发明和所附权利要求的真正范围。

Claims (17)

1.如下所示的SIMRA化合物: 5, -AUGCUGCGCUG-M-⑶CGC⑶C⑶A-5,; 其中M为顺,顺-环己烷三醇。
2.一种组合物,其包含权利要求1的SMRA化合物和生理学可接受的载体。
3.权利要求1的SIMRA化合物在制备用于在脊椎动物中产生免疫应答的药物中的用途,其中产生免疫应答包括对所述脊椎动物施用权利要求1的SIMRA化合物,其中所述脊椎动物是哺乳动物,所述免疫应答是TLR7/8介导的免疫应答。
4.权利要求3的用途,其中所述治疗还包括施用一种或多种化疗化合物、靶向治疗剂、抗体、DNA疫苗、蛋白疫苗、肽疫苗、抗原、或佐剂。
5.权利要求4的用途,其中所述佐剂是明矾。
6.权利要求1的SIMRA化合物在制备用于治疗性处理患有会受益于调控免疫应答的疾病或病症的脊椎动物的药物中的用途,其中所述处理包括对所述脊椎动物施用药学有效量的权利要求1的SIMRA化合物。
7.权利要求6的用途,其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性病症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘、或由病原体引起的疾病。
8.权利要求7的用途,其中所述炎性病症是气道炎症。
9.权利要求6的用途,其中所述处理进一步包括施用一种或多种化疗化合物、靶向治疗剂、抗体、DNA疫苗、蛋白疫苗、肽疫苗、抗原、或佐剂。
10.权利要求9的用途,其中所述佐剂是明矾。
11.权利要求1的SIMRA化合物在制备用于预防性处理患有会受益于调控免疫应答的疾病或病症的脊椎动物的药物中的用途,其中所述处理包括对所述脊椎动物施用药学有效量的权利要求1的SIMRA化合物。
12.权利要求11的用途,其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性病症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘、或由病原体引起的疾病。
13.权利要求12的用途,其中所述炎性病症是气道炎症。
14.权利要求11的用途,其中所述处理进一步包括施用一种或多种化疗化合物、靶向治疗剂、抗体、DNA疫苗、蛋白疫苗、肽疫苗、抗原、或佐剂。
15.权利要求14的用途,其中所述佐剂是明矾。
16.权利要求2的组合物,还包含一种或多种化疗化合物、靶向治疗剂、抗体、DNA疫苗、蛋白疫苗、肽疫苗、抗原、或佐剂。
17.权利要求16的组合物,其中所述佐剂是明矾。
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